Обратный диссекции и DiceCT выявить иначе скрытых данных в эволюции приматов лица

Резюме

Выражения лица являются режим визуальной коммуникации, производимые подражательный мышц. Здесь мы представляем протоколы для новых методов обратного диссекции и DiceCT полной визуализации и оценить подражательный мышц. Эти комбинированные методы могут изучить Морфологические и физиологические аспекты подражательный мускулатуры для определения функциональных аспектов.

Аннотация

Выражения лица, или лица дисплеев, социальных или эмоциональных намерений производятся многим таксонам млекопитающих как средства визуального общения с сородичами с близкого расстояния. Эти дисплеи достигаются путем сокращения подражательный мышц, которые являются скелетных мышц, придает в дерме лица. Обратная рассечение, удаление полная маска из черепа и приближается к подражательный мышц в обратном порядке, является эффективным, но разрушительные способом выявления морфологии подражательный мышцы, но это является разрушительным. DiceCT — это новый механизм для визуализации скелетных мышц, включая подражательный мышцы и изоляции отдельных мышц брошюры для количественного измерения. Кроме того DiceCT предоставляет механизм неразрушающего для визуализации мышц. Комбинированные методы обратного диссекции и DiceCT могут использоваться для оценки эволюционной морфологии подражательный мускулатура, а также потенциальные сокращения численности и скорость в этих мышц. Это исследование далее показывает, что DiceCT может использоваться для точно и достоверно визуализировать подражательный мышц, а также обратный диссекции и предоставляют неразрушающий метод выборки подражательный мышц.

Введение

Подражательный мускулатура, или выражение лица мускулатура, скелетных мышц и встречается во всем Mammalia¹. Хотя наиболее млекопитающих скелетных мышц придает дискретных костлявые достопримечательностей, подражательный мускулатура уникален в его вложения, главным образом в кожу лица, волосистой части головы и брюшной аспект шеи^{1,2,3, 4}. Подражательный мускулатура сужение искажает «маска» в выражениях или лица отображает социальных и эмоциональных намерений, изменяет размер и форма сфинктеров глаз, полости носа и полости рта, используемые в кормлении, дыхание и в вокализации, и является частью механизма общего закрытия близость визуальной коммуникации, среди большинства млекопитающих^2,3,4,5. Различных млекопитающих лица показывает, порожденных подражательный мышцы помощь в регулировании и поддержание территориальных границ, социальных связей и социальной группы, Каинг сородичами на эмоциональные и поведенческие намерения отправителя^{2, 5}.

Среди млекопитающих как с использованием высокий уровень социального поведения на протяжении жизненного цикла с всех видов, живущих в социальной группе^2,5частично характеризуются приматов. Во время некоторых таксонов такие как ночные galagos и Лори, могут жить в группах, состоящих только из матери и потомство, другие таксонов, таких как суточный макак и бабуинов, могут жить в группах свыше 100 человек⁶. Независимо от размера социальной группы приматы часто используют стереотипы социального поведения, связанные с ранга и территориальности и эти поведения обычно включают в себя компонент лица дисплея. Лица дисплеи являются частью процесса поддержания связей между государствами-членами социальных групп, Доминирование иерархий, воспроизводства и коммуникации, которая является частью повседневной жизни, особенно в дневное время видов^2,5,7 . Хотя было ясно в течение некоторого времени что лицевой мускулатуры используется для создания эти лица дисплеи, лишь недавно стало очевидным, что форма лицевой мускулатуры и физиологии, связанные с функциональными требованиями социальных переменных^{2, 8}. Предыдущие исследования на филогенетически и функционально различных диапазонов приматов показали, что суточный видов, живущих больших, сложных социальных групп, как правило имеют большое количество дискретных лица показывает что фокус на движение губ, бровей и век с большим количеством мышц лица группируются вокруг губ и орбитальных региона⁹. Напротив, там было несколько исследований на ночной вид, живущих в малых группах, но эти виды имеют большое количество дискретных лицевых мышц с вложениями вокруг наружного уха и губы, которые могут быть связаны с движениями ушей и губы (которая были зарегистрированы в некоторых ночных видов в агонистических встреч с сородичами и местонахождения звуки)^2,9,10,11. Кроме того люди имеют относительно высокий процент миозин медленно сокращающиеся волокна в мимикрией мускулатура чем макак резус или шимпанзе, которые могут быть связаны с «замедление» в сокращение мускулатуры человека подражательный вокруг губ используются в процессе производства звуков речи или возможности общего сопротивления усталости мышц⁸.

Люди являются, пожалуй, наиболее социально всех приматов и разработали язык как один из компонентов социальной коммуникации. Тем не менее хотя, люди используют выражение лица как средства визуальной коммуникации и имеют наиболее известные лица дисплей репертуар среди приматов. В попытке более полностью понять переменные окружающие эволюции человека и общие приматов социального поведения углубление понимания морфологии и физиологии подражательный мускулатуры приматов весьма желательно. Потому что подражательный мускулатура прилагается к самой кожи и может в некоторых видов, быть исключительно тонким и трудно визуализировать, мы разработали уникальный метод визуализации это мускулатура процессы записи валовой присутствие/отсутствие и вложения, а также выборки для microanatomical обработки.

«Обратный рассечение» — это метод для сохранения подражательный мускулатура, удалив весь маска для лица из головы и увеличивая видимость даже мелких мышц. Потому что обратный рассечение — деструктивный процесс, редкие и ценные образцы могут не всегда быть доступны для этой методологии. DiceCT является эффективным методом, который может визуализировать многие подражательный мышц даже крошечные видов^12,,1314. Этот метод может использоваться совместно с обратном вскрытие или в случаях, когда редкие и ценные образцы не могут быть расчленены и может предоставить много информации без необходимости удалить маска для лица «обратный рассечение»^{12,13, 14}. Настоящий Протокол описывает набор методов для объединения обратном вскрытие с DiceCT для изучения приматов подражательный мускулатура.

протокол

Потому что эти процедуры используют животных, которые умерли от естественных причин в зоопарках или были принесены в исследовательских лабораториях, где они были частью несвязанных исследования, эти протоколы не требуют утверждения IACUC.

1. обратный рассечение

Примечание: Протокол для обратного диссекции является эффективным для очень мелких млекопитающих, таких как лабораторных мышей, вплоть до крупных наземных млекопитающих, таких как внутренние лошади. Подражательный мышцы часто лучше всего сохранились и лучше визуализировать когда ушел с вышележащих дермы вместо оставив их на черепе. Смотрите Рисунок 1-3.

1. Disarticulate головы от шейного отдела позвоночника до процедуры вскрытия. Если труп замораживается, позволяют ему полностью разморозить перед переходом через этот шаг.
   1. Независимо от состояния сохранности ощупывайте затылочной области черепа и остистого отростка второго шейного позвонка (C2). Обратите внимание, что первого шейного позвонка (C1) не хватает остистого отростка, поэтому пальпируя C2 и затылочной области черепа даст примерное местоположение C1.
   2. С помощью скальпеля, сделайте горизонтальных разрезов между затылочной области черепа и C2, чтобы начать, отделяя черепа от позвоночного столба в C1. Продолжать сокращать до черепа disarticulated от позвоночника.
   3. Если образец свежие и нефиксированных, 1.1.2-1.2 шаги должны быть выполнены в течение относительно короткого промежутка времени. Кроме того если мозг остается неповрежденной внутри черепной полости, некроз нервных тканей может действовать быстро, поэтому настоятельно рекомендуется исключить из трупа мозг если образец без исправлений.
      Примечание: Как необязательный шаг, образец может быть погружен в формалина 10% буферизации на 24 часа для того, чтобы исправить образца. Это позволит процедура сбора неторопливой данных.
   4. Если образец уже фиксируется с этиловым спиртом или 10% буферизуются формалин, промойте несколько часов с пресной водой.
2. Сделайте разрезы выпустить маска для лица от черепа. Если мозг и обволакивающие Кальвария были удалены во время патанатомия, сделайте один разрез вблизи глабеллярной области черепа и другой вдоль хвостовой аспект черепа где черепные кости нетронутыми.
   1. После того, как образец был промыть на несколько часов, высушите с бумажными полотенцами и передачи для работы станции.
   2. Ощупывайте для внешнего затылочного бугра на краю хвостового (или задний) черепа. Это знаменует области, где Череп встречает позвоночника. С помощью скальпеля #4 для больших образцов или скальпелем #3 для малых образцов, сделать середине линии разреза, начиная с внешнего затылочного бугра и ближайшие рострально (или вперед) над лобной и теменной области черепа, над районом орбитальных и между глаз, вниз носовой региона, вплоть до внешнего носовой области между ноздри.
   3. Сделать надрез на нижней челюсти между нижней, Центральный резцов и двигаться в сторону ключицы каудально (или назад).
   4. Выберите одну сторону лица маски для удаления и оставить другую сторону на месте.
3. Релиз одной стороне маски от черепа.
   1. Начиная в затылочной области, используйте скальпель сократить маски для лица, в том числе подражательный мускулатура, от затылочной кости черепа, потянув маски рострально (или вперед) и сбоку (в сторону). Вырежьте Затылочная мышца от черепа, оставляя небольшое количество мышц позади на черепе, так что его вложений по-прежнему могут быть визуализированы, после снятия маски для лица. Оставляя некоторые части мышцы позади на костлявые/хрящевой череп, вложения могут быть сохранены для записи на более позднее время.
   2. После того, как ударил наружного уха, найдите аурикулярных мышц. Вырезать через них так что небольшая часть каждого остается с черепом. Прорезать упругие хрящи, присоединения внешнего уха к черепу.
   3. Продолжайте тянуть маска рострально и освободить каждый подражательный мышцы от черепа, оставляя небольшую часть каждой мышцы позади на черепе.
   4. Раз есть нетронутыми маска для лица от одной стороны черепа, позвольте ему сидеть, подвергается в воздух, в час (для малых образцов как крысы лаборатории) до трех часов (на большой образец как внутренние лошадь), мускулатура стороной вверх. Этот шаг desiccates некоторые из соединительной ткани на маску и повышает цветовой контраст между мышечной и соединительной ткани.
4. Удаление достаточно соединительной ткани для визуализации мускулатура.
   1. #3 с помощью скальпеля, щипцы и microscissors, срывать прочь соединительной ткани, которая отделяет подражательный мускулатура друг от друга.
   2. Для доступа к поверхностный слой мускулатуры подражательный в этот «обратный рассечение», аккуратно поднять и отдельные глубокий слой мускулатуры от поверхностного слоя и удалить соединительной ткани, окружающие поверхностных мышц. Результате маски могут быть возвращены в формалине, и процедура может быть приостановлена здесь, прежде чем перейти далее рассечение или окрашивание (шаг 2). Каждый промежуточный шаг в дальнейших рассечение позвольте маска высохнуть достаточно так, что соединительной ткани можно легко выделить из мышечной ткани.

2. Окрашивание процесс для DiceCT

Примечание: Образцы должны быть исправлены в формалина 10% буферизации если DiceCT будет использоваться для того, чтобы сохранить ткани во время длительной процедуры окрашивания. Если образец не были исправлены, поместите его в контейнер с достаточно формалина 10% буферизуются погружаться все ткани и оставить его на 48 часов.

1. Сделать 1,75% (m/v) Люголя раствор йода (я₂KI) для окрашивания маска.
   Примечание: Сделать достаточно я₂ки решение полностью погрузите маска в выбранном контейнере. Сделайте более или менее решение путем масштабирования значения растворенных веществ и растворителей одинаково в шагах 2.1.1 и 2.1.2.
   1. Под вытяжного шкафа добавьте 3,50 г, калия йодида (KI) в 200 мл дистиллированной воды в большой стеклянный стакан. Перемешайте с использованием стекла помешивая штанги до полного растворения.
      Предупреждение: йодида калия (KI) может вызвать глаз, кожи и раздражение дыхательных путей или повреждения. Носите защитные очки и обрабатывать под вытяжного шкафа.
   2. Медленно добавьте 1,75 г йода кристаллов (я₂), помешивая, пока полностью растворится. Это займет несколько минут.
      Предупреждение: Йода кристаллов (я₂) может вызвать глаз, кожи и раздражение дыхательных путей или повреждения. Пользоваться средствами защиты глаз и кожи и работать под зонта при обработке этого химического вещества.
   3. Фильтр раствор в бутылку из темного стекла с помощью фильтр-бумаги с размером пор 11 микрон для удаления любой нерастворенных кристаллы, которые могут производить несовместимым пятнать.
      Предупреждение: Это решение является высоко токсичен для водных организмов. Не выбрасывайте решения канализацию. В случае разлива нефти, нейтрализации водных иодид (я₃^–) в йодид (I^–) с 5% (m/v) тиосульфата натрия (Na₂S₂O₃). Проверьте политики институциональные отходов для йодида и утилизация отходов соответственно.
2. Пятно маска.
   1. Место маска сократить стороны в Янтарный стекла или затемненными контейнера (чтобы держать свет) достаточно большой, чтобы позволить маска для отдыха в естественной форме и быть полностью погружены в воду.
   2. Залейте раствор Люголя йода маски до тех пор, пока он полностью погружен. Вес может быть необходимо сохранить маску полностью погружен и предотвратить его от плавающих в верхней части решения. Уплотнение контейнера для предотвращения испарения и держать свет.
   3. Агитировать контейнер постоянно на электрические рокер или регулярно вручную для облегчения даже окрашивание и предотвратить кристаллы от урегулирования для по крайней мере две недели. Если для адекватно пятно брошюрах мышц требуется больше времени, замените свежим раствором Люголя раствор.
   4. После двух недель удалите маску из решения. Залейте небольшим количеством дистиллированной воды обеих поверхностей маска для полоскания. Оберните маска в влажные бумажные полотенца и место в запечатанный пластиковый пакет для по крайней мере 24 часов, чтобы позволить для незначительные сушки перед переходом к следующему шагу.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена на срок до недели. Убедитесь, что маска остается влажной в течение этого периода.

3. сканирование DiceCT

1. Подготовьте маска для КТ сканирование.
   1. Смонтируйте маски на низкой плотности материала, например, Флористическая пена, чтобы устранить любые морщины в маске и ограничить движения маски, как маска высыхает слегка во время сканирования. Закрепите маска до пены с деревянными зубочистками.
2. Настройка параметров КТ сканирование и сканирование.
   1. Использование высокого разрешения для этих проверок, как небольшой брошюры будут скрыты в низком разрешении. Использование интервалов между срез и Интер пиксель расстояние около 0,05 мм.
   2. Сканировать навесные маска на высокоразрешающей рентгеновского вычисляется томографии.
   3. Если брошюры не смогут быть полностью визуализирована, из-за чрезмерной окрашивание, место маски в раствор формалина 10% или 5% натрия тиосульфат удалить некоторые из пятно. Если брошюрах достаточно не запятнаны, вернитесь к раствор Люголя в йода. После корректировки окрашивание, сканировать маска снова. Продолжать вносить необходимые коррективы и сканировать до тех пор, пока брошюрах способны полностью визуализирована.

4. Подготовьте маску для длительного хранения.

1. Химически нейтрализовать йода пятно в маску, удаление обесцвечивание от процесса окрашивания.
   1. Место окрашенных маска в 5% (m/v) натрия тиосульфат раствор химически нейтрализации образца. Это может занять несколько часов или дней. Агитируйте регулярно во время минигелей.
   2. Возвращение destained маска в раствор формалина 10% для сохранения. Если пятно продолжает выщелачиваться из образца в раствор, замените бесцветные формалин свежие формалин до тех пор, пока он остается ясным для длительного хранения.

Результаты

Этом разделе представлены примеры результатов на форме лицевой мускулатуры, которая может быть достигнута с помощью «обратный рассечение» в концерте с DiceCT сканирования. С помощью «обратный рассечение» для создания маски, полное представление подражательный (лицево?...

Обсуждение

Следующие шаги для «обратный рассечение» протокол обычно производит маска для лица, которое может быть медленно и методично расчлененный раскрыть подражательный мускулатура, независимо от размера головы. Это особенно важно, чтобы двигаться медленно и непрерывно оценивать ли мышцы бы...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon XTH 225 ST	Nikon		no catalog numbers
10% buffered formalin	Fisher Scientific	SF98-4
Iodine, ACS Grade	Lab Chem, Inc.	LC155901
Sodium thiosulfate	Acros Organics	AC450620010
Potassium Iodide	Alfa Aesar	A1270430