Pharmacothérapie intracrânienne et dosages de la douleur chez les rongeurs

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour effectuer des expériences pharmacologiques intracrâniennes suivies de tests de comportement de la douleur chez les rongeurs. Ce protocole permet aux chercheurs de livrer des cibles moléculaires et cellulaires du cerveau, des agents pharmacologiques dans le traitement de la douleur.

Résumé

La douleur est une expérience sensorielle saillante avec dimensions cognitives et affectives. Cependant, les mécanismes centraux pour la douleur restent mal compris, qui entravent le développement de thérapeutiques efficaces. Intracrânienne pharmacologie présente un outil important pour la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires de la douleur dans le cerveau, ainsi que de nouveaux traitements. Nous présentons ici un protocole qui intègre la pharmacologie intracrânienne avec douleur comportement stable. Plus précisément, nous montrons comment infuser des médicaments analgésiques dans une région du cerveau select, qui peut être responsable de la modulation de la douleur. En outre, afin de déterminer l’effet du médicament candidat dans le système nerveux central, douleur analyses après traitement intracrânien. Nos résultats démontrent que l’administration intracrânienne de médicaments analgésiques dans une région ciblée peut apporter un soulagement de la douleur chez les rongeurs. Ainsi, notre protocole démontre que la pharmacologie intracrânienne, combiné avec douleur comportement stable, peut être un outil puissant pour l’étude des mécanismes de la douleur dans le cerveau.

Introduction

Le système nerveux central est appelé à jouer un rôle clé dans le règlement de la douleur. Par exemple, glutamate de signalisation dans le cerveau a un rôle régulateur dans le contexte de la douleur^1,2. Par conséquent, il y a un intérêt pour l’étude des voies de signalisation cellulaires et moléculaires dans le cerveau en ce qui concerne la douleur. En outre, il est nécessaire de comprendre si les cibles moléculaires dans certaines régions du cerveau peuvent être modifiées pour traiter la douleur. Les études actuelles de la douleur dans le cerveau s’appuient sur des études in vitro d’électrophysiologie en combinaison avec délivrance (intrapéritonéale) systémique d’agents pharmacologiques. Des études in vitro ont des déficits évidents en révélant en vivo les mécanismes de la douleur. Pendant ce temps, administration de médicaments systémiques ne pas délimiter les cibles cellulaires précis. In vivo intracrâniennes injections d’agents chimiques et biologiques sont devenues un outil puissant pour étudier les voies moléculaires et neurologiques dans le cerveau. Ces dernières années, autres domaines ont utilisé en vivo intracrânienne injections d’étudier avec succès les addiction et récompenser les comportements et les voies de circuit dans les rongeurs^3,4. Toutefois, dans le contexte de la douleur, l’utilisation de la pharmacologie in vivo intracrânienne est absent.

Les injections intracrâniennes permettent une injection précise d’un médicament dans une zone spécifique du cerveau. Par ailleurs, les récepteurs et les voies spécifiques peuvent être ciblés à l’aide de médicaments hautement sélectifs. La combinaison d’un système de prestation intracrânienne avec des médicaments de précision nous permet de viser des cibles moléculaires et cellulaires pour la douleur. Après administration intracrânienne de ces medicaments, chercheurs peuvent observer les effets immédiats dans le comportement des rongeurs. Des expériences menées, les comportements des rongeurs peuvent être reliés à la pharmacologie.

Dans ce protocole, nous avons utilisé l’exemple d’AMPAkine infusion dans le cortex préfrontal (PFC) pour démontrer le mécanisme du glutamate corticale de signalisation dans le règlement de la douleur. AMPAkines sont des composés synthétiques qui sont connus des modulateurs allostériques. Ils ont montré la capacité à soulager aiguë et la douleur chronique chez les animaux modèles^5,6. Des études antérieures suggèrent que les sites susceptibles d’action des AMPAkines sont dans le cerveau^5,6. Le CFM est une région du cerveau qui expose la descendante de contrôle aux régions sous-corticales pour réguler l’humeur et le comportement. Certains de ces projections sortie ont démontré être clé en douleur règlement^1,2,7. Plus précisément, glutamate de signalisation dans le PFC s’est avéré de réglementer la douleur. Ainsi, le PFC a été choisi comme une zone du cerveau ciblés pour l’étude des AMPAkines dans la douleur.

Protocole

Toutes les procédures dans la présente étude ont été approuvées par la New York University School of médecine institutionnelle Animal Care et le Comité d’utilisation (IACUC) comme conforme au Guide National Institute of Health (NIH) pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. stéréotaxiques canule Implantation

1. Utiliser 10-12 semaines vieux mâles rats Sprague-Dawley.
2. Comme décrit précédemment, anesthésier les animaux avec 1,5 à 2 % isoflurane^1,3,5. Une fois que l’animal ne répond pas à une forte pincée avec une pince forte, effectuer la chirurgie. Veillez à stériliser tous les instruments, utilisez des gants chirurgicaux stériles et ajouter pommade ophtalmique aux yeux de l’animal pour éviter tout dommage.
3. Implant stereotaxically canules bilatéraux calibre 26 guide dans le PFC à 12,5 degrés avec coordonnées AP : +2,9 mm ; ML : + / −1.6 mm ; DV : −2, 1 mm. Afin d’y insérer les canules, percer des trous dans le crâne au point de coordonnées souhaité, avec le diamètre du trou selon la taille des canules utilisées.
   NOTE : Ici, le PFC a été étudiée comme la cible potentielle pour les implants intracrâniennes en raison de son rôle important dans le traitement de la douleur, qui a été démontré dans un certain nombre de précédents études^1,2,7. Pour étudier la fonction des autres zones spécifiques du cerveau, les chercheurs peuvent utiliser différentes coordonnées selon l’atlas du cerveau. Pour plus de détails sur l’exécution d’une intervention intracrânienne, s’il vous plaît voir Goffer et coll. (2013)³, Lee et coll. (2015)¹et soleil et coll. (2017)¹⁰.
4. Permettre à des rats récupérer d’une chirurgie pour au moins 1 semaine. Après une intervention chirurgicale, injecter des fluides sous-cutanés avant la reprise pour aider à soutenir les besoins métaboliques et appliquez la bupivacaïne topique dans l’incision fraîchement fermée. Placer l’animal sur une dalle chaude jusqu'à ce qu’ils réveillent et contrôler le fonctionnement de post animale pendant 3 jours pour assurer la bonne santé et une bonne récupération.
5. Une fois que les animaux ont complètement remis de la chirurgie, commencer les injections (étape suivante).

2. intracrâniennes et intrapéritonéales d’Injections

1. Pour injections intracrâniennes, utiliser des tubes PE-50 attaché à une extrémité pour 10 μL Hamilton seringues avec canule de calibre 33 injecteur qui s’étendent de 1,0 mm au-delà les guides implantés.
2. Injecter 0,5 μL (ou moins si vous le souhaitez) du médicament à l’étude ou du sérum physiologique dans le PFC de ces rats. Parce que le PFC est une région plus étendue chez les rats, ce montant s’étendra pas à d’autres régions. Toutefois, pour les plus petites régions du cerveau ou souris, utiliser un plus petit volume. La quantité injectée dépend de la région du cerveau et des espèces animales.
   Remarque : Veuillez noter qu’une solution saline doit être utilisée comme un contrôle au lieu de DMSO DMSO étant neurotoxique. Cependant, une très petite quantité de DMSO peut être sans danger pour l’infusion, car des études ont montré que moins de 50 % de que DMSO (c'est-à-dire inférieure à un volume total de 0,3 μL, comme en l’espèce) ne peut pas interférer avec le comportement études^8,9.
3. Injecter le volume bilatéralement sur une période de 100 canules d’injecteur s et le maintenir en place pendant une supplémentaire 60 s avant l’enlèvement permettre une diffusion lente de cette solution.
4. Pour l’étude des effets pharmacologiques synergiques, administrer un autre médicament par le biais de méthodes systémiques. Dans ce cas, injecter la drogue souhaitée ou le contrôle des données et administrer un médicament supplémentaire par voie intrapéritonéale immédiatement après. À titre d’exemple, dans cette étude, nous avons étudié les effets de synergie analgésiques de la morphine et Ampakines à tester pour un effet additif. Nous avons infusé un AMPAkine données, en combinaison avec livraison intrapéritonéale de 1 mg/kg de morphine (une dose sécuritaire de systémique)¹⁰.
   Remarque : Il est recommandé que les injections intracrâniennes sont font tout d’abord, car ils sont plus difficiles à effectuer que des injections intrapéritonéales.

3. évaluation et essais de l’analgésie

1. Pour étudier l’effet des injections intracrâniennes sur le comportement de la douleur aiguë chez le rat, utiliser le test plantaire (essais de Hargreaves) pour calculer le temps de latence de retrait en réponse à des stimuli thermiques. Appareillage de la Hargreaves concentre un faisceau infrarouge à travers un plan de verre sur pied le rat ; le rat est permanent et se déplaçant librement au-dessus du plan de verre. Lorsque vous effectuez le test de Hargreaves, concentrer le faisceau infrarouge sous la zone plantaire du pied du rat.
   1. Commencez par les tests de base Hargreaves avant les injections, d’établir une valeur de référence pour la comparaison.
2. Ne pas injecter une drogue quelconque avant d’établir une valeur de référence. Mener des essais de bonnes 5, 5 min d’intervalle. Un bon procès est indiqué par un retrait clair, c'est-à-dire lorsque le rat plie son genou et soulève son pied vers le haut et dans le corps.
   Remarque : Assurez-vous que les épreuves sont à 5 min d’intervalle pour empêcher une sensibilisation du rat. Appareil de la Hargreaves enregistre automatiquement au moment du retrait, une fois que le faisceau infrarouge est cassé. Par conséquent, n’oubliez pas de remise des essais de locomotion, transfert de poids, etc. en cas d’un procès réduit, attendre 5 min et répéter l’essai.
3. Calculer les seuils de retrait en calculant la moyenne des 5 essais.
4. Après avoir obtenu une moyenne de base, commencer l’expérience pour obtenir des délais d’attente après la perfusion de médicaments. Essais de Hargreaves peuvent être effectué 20-30 min après injection intracrânienne, bien que le calendrier précis pourrait dépendre de la pharmacocinétique des agents spécifiques. Il s’agit de veiller à ce que le rat a absorbé le médicament et connaît ses effets. Faire cette expérience de la même manière que l’étape 3.1.
5. Calculer les seuils de retrait tel que mentionné à l’étape 3.2.

Résultats

À titre d’exemple, nous avons infusé un AMPAkine dans le PFC par l’intermédiaire de canules (Figure 1). Nous avons également infusé morphine systémique afin d’évaluer les effets analgésiques synergiques entre AMPAkines et de la morphine. Ces résultats montrent que les AMPAkines et la morphine ont un effet analgésique additif. Il montre également que les injections intracrâniennes ont le pouvoir de découvrir, au moins en partie, un mécanism...

Discussion

Dans cette étude, nous avons démontré que pharmacologie intracrânienne est un outil puissant pour étudier les mécanismes de la douleur et a un potentiel comme un système de diffusion thérapeutique. Dans notre protocole, nous avons livré AMPAkines directement dans le PFC et a constaté que, en améliorant la signalisation dans le PFC, AMPAkines fourni soulagement de la douleur de glutamate. Nous avons pu démontrer cela grâce à l’utilisation des injections intracrâniennes combinées avec des injections intra...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterotaxic Cannula	PlasticsOne	8I26GA8MMKIT
Digital Syringe	Hamilton	8440
AMPAkine	Sigma Aldrich	C-271
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D4540
Hargreaves Apparatus	Ugo Basile	37370
Male Sprague-Dawley rats	Taconic Farms	NTac:SD
Sterile Surgical gloves	Dynarex	6535