Внутричерепных фармакотерапии и боль Assays грызунов

Резюме

Здесь мы представляем протокол к внутричерепной фармакологические эксперименты, следуют боль поведение анализов в грызунов. Этот протокол позволяет исследователям доставить молекулярных и клеточных целей в головном мозге, для фармакологических агентов в лечении боли.

Аннотация

Боль является характерной чувственный опыт с эмоциональные и когнитивные аспекты. Однако Центральный механизмы боли остаются плохо понимали, что препятствует развитию эффективной терапии. Внутричерепных фармакологии представляет важным инструментом для понимания молекулярных и клеточных механизмов, боли в мозг, а также Роман лечения. Здесь мы представляем протокол, который интегрирует внутричерепных фармакологии боли поведение тестирования. В частности мы покажем, как на настаиваться болеутоляющие препараты в регион выберите мозга, которые могут быть ответственны за боль модуляции. Кроме того чтобы определить эффект препарата кандидат в центральной нервной системе, боль анализы выполняются после внутричерепного лечения. Наши результаты показывают, что внутричерепных отправления болеутоляющие препараты в целевом регионе могут обеспечить облегчение боли в грызунов. Таким образом наш протокол успешно демонстрирует, что внутричерепных фармакологии, в сочетании с болью поведение тестирования, может быть мощным инструментом для изучения механизмов боли в мозг.

Введение

Известно, что центральной нервной системы играют ключевую роль в регуляции боли. Например глютамат сигналов в мозг имеет регулирующей роли в контексте боли^1,2. Следовательно существует необходимость изучения клеточном и молекулярном сигнальных путей в головном мозге в отношении боли. Кроме того необходимо понять, если молекулярных целей в конкретных мозга могут быть изменены для лечения боли. Текущие исследования боли в мозг положиться в vitro исследования электрофизиологии в сочетании с системными (внутрибрюшной) доставки фармакологических агентов. В vitro исследования имеют очевидный дефицит в раскрытии в естественных условиях механизмы боли. Тем временем системных лекарств не разграничить точные клеточных мишеней. В естественных условиях внутричерепных инъекции химических и биологических агентов стали мощным инструментом для изучения неврологические и молекулярные пути в головном мозге. В последние годы другие поля использовали в vivo внутричерепных инъекции успешно изучать поведение наркомании и вознаграждение и замыкания путей в грызунов^3,4. Однако в контексте боли, использование в vivo внутричерепных фармакологии отсутствует.

Внутричерепных инъекции позволяют точно инъекций препарата в конкретной области мозга. Кроме того конкретные пути и рецепторы могут быть направлены с использованием высокоселективных наркотиков. Сочетание внутричерепных системы доставки с точностью препаратами позволяет нам ориентироваться на молекулярном и клеточном цели для боли. После внутричерепных доставки этих лекарств исследователи могут наблюдать непосредственных последствий в поведении грызунов. От хорошо проведенных экспериментов грызунов поведения могут быть связаны с фармакологии.

В этом протоколе мы использовали пример ампакины вливания в префронтальной коре (PFC) продемонстрировать механизм корковых глутамата сигнализации в регуляции боли. AMPAkines являются синтетическими соединениями, которые известны аллостерический модуляторы. Они показали способность облегчить острые и хронические боли в животных моделей^5,6. Предыдущие исследования показывают, что вероятность сайты действий AMPAkines в мозг^5,6. PFC — это область в мозге, что экспонаты сверху вниз управления подкорковых областей регулировать настроение и поведение. Некоторые из этих прогнозов вывода было показано, чтобы быть ключом в боль правилам^1,2,7. Говоря более конкретно глютамат сигнализации в ПФУ было показано регулируют боли. Таким образом ПФК был выбран как мозг целевой области для изучения AMPAkines в государствах боль.

протокол

Все процедуры в этом исследовании были утверждены Нью-Йорка университета Школа медицины институциональных животных ухода и использования Комитет (IACUC) в соответствии с руководством Национального института здравоохранения (НИЗ) для ухода и использования лабораторных животных.

1. Стереотаксическая канюля имплантации

1. Используйте 10-12 неделя старый крысах Sprague-Dawley.
2. Как описывалось ранее анестезировать животных с 1,5-2% изофлюрановая^1,3,5. Как только животное становится не реагирует на щепотку сильным с острыми щипцами, выполните операцию. Быть уверены в автоклаве всех инструментов, используйте стерильные хирургические перчатки и добавить глазной мази в глаза животного для предотвращения повреждения.
3. Stereotaxically имплантата двусторонних 26-калибруйте руководство канюли в ПФУ на 12,5 градусов с координатами AP: +2.9 мм; МЛ: +/ −1.6 мм; DV: −2.1 мм. Чтобы вставить канюли, сверлить отверстия в черепе координатами желаемого, с диаметром отверстия в зависимости от размера используемых канюли.
   Примечание: Здесь, ПФК был изучен как потенциальной мишенью для внутричерепных имплантатов из-за его важную роль в обработке боль, которая была продемонстрирована в ряде предыдущих исследований^1,2,7. Для изучения функции других областях конкретных мозга, исследователи могут использовать различные координаты согласно Атлас мозга. Для более подробной информации о выполнении внутричерепных хирургии смотрите Гоффер et al (2013)³, Lee et al (2015)¹и Sun et al (2017)¹⁰.
4. Разрешить крысы, чтобы оправиться от операции по крайней мере за 1 неделю. После операции придать подкожной жидкости до восстановления, чтобы помочь поддержать метаболические требования и применять актуальные бупивакаин в свеже закрытой разрез. Поместите животное на площадку теплой до тех пор, пока они просыпаются и контролировать операции животных post для 3 дней, чтобы обеспечить хорошее здоровье и правильное восстановление.
5. Когда животные полностью оправиться от операции, начать инъекции (следующий шаг).

2. внутричерепное и внутрибрюшной инъекции

1. Для внутричерепных инъекции, использование труб PE-50 придает на одном конце для 10-мкл Гамильтон шприцы с 33-го калибра инжектор канюля, которые расширяют 1,0 мм за пределы имплантированных гидов.
2. Придать 0.5 мкл (или меньше при желании) исследования наркотиков или физиологического раствора в ПФК этих крыс. Потому что ПФУ большого региона в крыс, эта сумма не будет распространяться на другие регионы. Однако для небольших регионов мозга или для мышей, используйте меньший объем. Вводится сумма будет зависеть от региона мозга и видов животных.
   Примечание: Обратите внимание, что солевой раствор следует использовать в качестве элемента управления вместо ДМСО потому что ДМСО нейротоксическое. Однако очень небольшое количество ДМСО может быть безопасным для инфузии, поскольку исследования показали, что меньше чем на 50% ДМСО (то есть, меньше, чем общий объем 0,3 мкл, как в данном случае) не могут вмешиваться с поведением исследования^8,9.
3. Придать объем на двусторонней основе в течение 100 s и держать инжектор канюли в место для дополнительных 60 s перед удаления разрешить медленного распространения этого решения.
4. Для исследования синергетических фармакологических эффектов, совместно управлять другой препарат через системные методы. В этом случае придать желаемый наркотиков или управления интракраниально и администрировать дополнительные наркотиков внутрибрюшинно сразу же после этого. Например в этом исследовании мы изучали синергических обезболивающий эффекты морфина и Ampakines для проверки аддитивный эффект. Мы проникнуты ампакины интракраниально, в сочетании с внутрибрюшинного доставки 1 мг/кг морфина (безопасного системного доза)¹⁰.
   Примечание: Рекомендуется, что внутричерепных инъекции делаются во-первых, как они более сложны, чем внутрибрюшинной инъекции.

3. Обезболивание анализы и оценки

1. Для изучения влияния внутричерепных инъекции на острой боли поведение крыс, используйте подошвенной теста (Hargreaves тесты) вычислить задержку вывода в ответ на тепловых раздражителей. Харгривз аппарат фокусируется инфракрасный луч через плоскость стекла на ноги крыса; Крыса стоит и свободно движущихся выше плоскости стекла. При выполнении теста Харгривз, фокус инфракрасный луч в подошвенной области стопы крыса.
   1. Начните с выполнения тестов базовой Харгривз до инъекции, чтобы создать базовое значение для сравнения.
2. Не вводить каких-либо наркотиков любого рода до создания базового значения. Проведение 5 хороших испытаний, 5 минут друг от друга. Пробу хороший обозначается четкий вывод, т.е., когда крысы изгибов ее колена и поднимает его ноги вверх и в тело.
   Примечание: Убедитесь, что судебные процессы являются 5 минут друг от друга для предотвращения сенсибилизации крысы. Харгривз аппарат автоматически записывает время вывода, когда нарушается инфракрасный луч. В результате не забудьте скидка испытания от локомоции, смещение веса и т.д. , если пробу со скидкой происходит, подождать 5 минут и повторить процесс.
3. Вычислить вывода порогов, принимая в среднем 5 испытаний.
4. После получения базового среднего, начните эксперимент, чтобы получить вывод раз после вливания лекарственных препаратов. Харгривз тесты могут быть осуществляется 20-30 мин после инъекции внутричерепной, хотя точные сроки могут быть зависимыми от фармакокинетики конкретных агентов. Это необходимо для того, что крысы впитала препарата и переживает его последствия. Провести этот эксперимент в так же, как шаг 3.1.
5. Вычислить вывода пороговые значения, как указано в шаге 3.2.

Результаты

В качестве примера мы проникнуты ампакины в ПФК через канюли (рис. 1). Мы также проникнуты морфина системно оценить синергических обезболивающий эффекты между AMPAkines и морфин. Эти результаты показывают, что AMPAkines и морфина имеют добавки обезболивающий эф?...

Обсуждение

В этом исследовании мы продемонстрировали, что внутричерепных фармакологии является мощным инструментом для изучения боли механизмов и имеет потенциал как терапевтические системы доставки. В нашем протокол Мы доставлено AMPAkines непосредственно в ПФУ и обнаружили, что путем повышения г...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterotaxic Cannula	PlasticsOne	8I26GA8MMKIT
Digital Syringe	Hamilton	8440
AMPAkine	Sigma Aldrich	C-271
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D4540
Hargreaves Apparatus	Ugo Basile	37370
Male Sprague-Dawley rats	Taconic Farms	NTac:SD
Sterile Surgical gloves	Dynarex	6535