Comment quantifier la Fraction des protéines fluorescentes photoactivation en vrac et dans des cellules vivantes

Résumé

Nous présentons ici un protocole qui implique de photoactivatable spectralement distincte génétiquement couplé et des protéines fluorescentes. Ces chimères de la protéine fluorescente permettent de quantification de la fraction de PA-FP est photoactivation être fluorescents, c'est-à-dire l’efficacité de photoactivation. Le protocole indique que les différents modes de photoactivation rendement photoactivation différentes efficacités.

Résumé

Photoactivatable et - protéines fluorescentes convertibles (PA-FPs) ont été utilisés en microscopie de fluorescence cellules vivantes pour analyser la dynamique des cellules et des ensembles de protéines. Jusqu’ici, aucune méthode n’a été disponible à quantifier en vrac et en live cellules exprimé combien du PA-SFP sont photoactivation de fluorescence.

Ici, nous présentons un protocole mettant en cause des règles internes, c'est-à-dire génétiquement couplés protéines fluorescentes spectralement distinctes (photoactivatable), à ratiometrically quantifier la fraction de tous les PA-MF intégré à une cellule qui s’allument pour être fluorescent. Utilisant ce protocole, nous montrons que les différents modes de photoactivation donné photoactivation différentes efficacités. Courte photoactivation haute puissance avec un confocal laser scanning microscope (CLSM) a entraîné jusqu'à quatre fois plus faible photoactivation efficacité que des centaines d’expositions bas niveau appliquées par CLSM ou une brève impulsion appliquée par widefield illumination. Alors que le protocole a été exemplifié ici pour GFP (PA-) et Cherry (PA-), il peut en principe être appliqué à n’importe quelle paire de protéine fluorescente photoactivatable ou et spectralement distinctes et tout montage expérimental.

Introduction

En 2002, le premier largement applicable photoactivatable (PA-GFP¹) et des protéines fluorescentes et (Kaede²) ont été décrits. Ces protéines fluorescentes surligneur optique modifier leurs propriétés spectrales lors de l’irradiation UV-lumière, c'est-à-dire, ils deviennent lumineux (protéines fluorescentes photoactivatable, c.-à-d., PA-FPs), ou changer leur couleur (et Images/s). A ce jour, plusieurs réversibles et irréversibles photoactivatable et et protéines fluorescentes ont été développés^3,4. Dans les études d’ensemble ou en vrac, surligneurs optiques ont été utilisés pour étudier la dynamique des cellules entières ou des protéines et la connectivité des compartiments subcellulaires. En outre, surligneurs optique activées seule molécule basée superrésolution imaging techniques telles que PALM⁵ et⁶de la FPALM.

Bien que la photochimique traite pendant photoactivation ou - conversion ont été décrits pour de nombreuses optiques surligneurs et structures cristallographiques même avant et après photoactivation / - conversion ont disponible^{7 , 8}, le mécanismephysique sous-jacent de photo de photoactivation et - conversion n’est pas complètement élucidé. En outre, jusqu’ici seulement brutes estimations existent de l’efficacité de photoactivation et - conversion, c'est-à-dire la fraction des protéines fluorescentes exprimées autrement dit effectivement photoconverted ou photoactivation être fluorescent. Des études in vitro ensemble ont été signalés à quantifier la Maj dans les spectres d’absorption et de la quantité de natif et activé des protéines dans un gel^9,10,11.

Nous présentons ici un protocole impliquant les chimères de la protéine fluorescente afin d’évaluer la fraction des protéines fluorescentes photoactivation en vrac et dans des cellules vivantes. Chaque fois que travaillant avec des protéines fluorescentes génétiquement encodés, la quantité absolue de la protéine exprimée varie de cellule en cellule et ne connaît pas. Si une cellule exprimant une PA-FP présente un signal plus clair après photoactivation qu’une autre cellule, on ne peut pas différencier si ce signal lumineux est due à une expression plus élevée de la PA-FP ou une photoactivation plus efficace du PA-FP. Pour uniformiser le niveau d’expression dans les cellules, nous introduisons des règles internes de protéines fluorescentes spectralement distinctes génétiquement couplés. Par couplage de l’information génétique d’une protéine fluorescente photoactivatable à un spectralement distincts toujours en protéines fluorescentes, règles internes sont créés qui sera toujours exprimé pour un montant inconnu, mais dans une quantité relative fixe et connue de 1 : 1. cette stratégie permet la caractérisation quantitative des différents régimes photoactivation lumière UV, c'est-à-dire l’évaluation de la quantité relative de PA-FPs pouvant être photoactivées avec différents modes de photoactivation, et permet donc pour définir des schémas de photoactivation qui sont plus efficaces que d’autres. En outre, cette stratégie permet en principe de l’évaluation de la quantification absolue de la fraction de photoactivation PA-FP. À cette fin, il est important de réaliser que les études d’ensemble présenté sont fondés sur l’intensité qui rend l’analyse plus complexe comme décrit dans le présent protocole. Paramètres déterminant l’intensité de fluorescence mesurée, c'est-à-dire différentes luminosité moléculaire, absorbance et spectres d’émission et effets de la frette, doivent être examinées lors de la comparaison des intensités de fluorescence de différentes protéines fluorescentes.

La quantification de basé sur l’intensité ratiométrique présenté de photoactivation efficacité est illustrée pour PA-GFP et PA-Cherry dans des cellules vivantes, mais est en principe largement applicables et peut être utilisée pour n’importe quelle protéine fluorescente photoactivatable sous aucune conditions expérimentales.

Protocole

1. Construction de plasmide

1. Générer des sondes de la fusion de deux couleurs. Utiliser un vecteur d’expression de cellules de mammifères (voir Table des matières) dans lequel mCherry1¹² et PA-mCherry1,¹³ ont été insérés avec la restriction sites AgeI et BsrGI.
2. Commande personnalisée oligo-nucléotides pour amplifier les variantes monomères d’eGFP et PA-eGFP contenant l’A206K mutation, c'est-à-dire, mEGFP PA-mEGFP¹⁴ sans un codon d’arrêt comme un fragment de SalI-BamHI . Utiliser le primaire N-terminal 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' et le C-terminal apprêt 5'-AAT ATA TGG ATC GCC CTT GTA CAG CCT GTC CAT GC 3' et insérez ce fragment SalI-BamHI dans le site multiple de clonage du vecteur d’expression. Cela va créer l’éditeur de liens de cinq acides aminés RNPPV entre la protéine fluorescente verte et rouge. Nous appellerons les chimères du fluorophore comme GFP — cerise, PA-GFP — cerise et GFP — PA-cerise pour le reste de cet article.
   Remarque : Le couplage des fluorophores et création des souverains internes pour évaluer l’efficacité de photoactivation peuvent être faits avec n’importe quelle paire de fluorophore spectralement distinctes, par exemple superfolder PA-GFP ¹⁵/ PA-TagRFP ¹⁶, etc. Bon nombre des protéines fluorescentes photoactivatable proviennent de GFP. Par conséquent, la séquence d’amorce fournie ci-dessus peut être utilisée pour plusieurs protéines fluorescentes pour construire une chimère fluorophore dans un vecteur d’expression de cellules de mammifères.

2. Culture et Transfection des cellules

1. Utilisez soit n’importe quelle ligne de cellule standard tels que HeLa, NRK, Cos-7 ou une lignée cellulaire spécifique à utiliser pour des expériences de photoactivation spécifiques. Utilisez DMEM (additionné de sérum de veau fœtal 10 % et de 2 mM de glutamine) et la trypsine sans rouge de phénol (voir Table des matières) pour réduire la fluorescence de fond.
2. Détacher les cellules d’une culture anastomosée à la trypsine, compter le nombre de cellules en suspension de cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer et semences 5 000 – 10 000 cellules par puits. Alternativement, utilisez 1 goutte d’une pipette de 2 mL d’une suspension cellulaire de 10 mL d’une culture de cellules confluentes cultivée dans un flacon de culture cellulaire-25 T ou 3 gouttes d’une suspension de cellules de 5 mL d’une culture confluente, cultivée dans un flacon de culture cellulaire-12,5 T.
3. La croissance de cellules dans des chambres de 8 puits à 1.0 # couvercle en verre (voir Table des matières) pour la microscopie de fluorescence cellules vivantes.
4. Transfecter cellules 24h après ensemencement à l’aide de réactifs commerciaux (voir la Table des matières) selon le protocole du distributeur avec la GFP — cerise, PA-GFP — cerise et GFP — chimères PA-Cherry.
5. Cellules d’image après un total de 20 h après transfection permettant l’expression de la protéine, le pliage et la maturation.

3. imagerie et Photoactivation

1. Cellules d’image dans une chambre environnementale humidifiée et chauffage à 37 degrés Celsius. Pour les médias de la cellule de la mémoire tampon à pH physiologique et à le rendre CO₂-indépendant, ajouter 20 mM HEPES, ou fonctionnant au gaz de₂ CO 5 % débit la valeur.
2. Tout d’abord, l’image des cellules exprimant la GFP — construction de cerise. Définir les paramètres qui définissent l’intensité du laser intégrée dans le temps par pixel dans une image confocale, c'est-à-dire, les temps de pause pixel en microsecondes, transmission filtre accordable acousto-optique (AOTF) en pour cent et un zoom numérique.
   Remarque : En utilisant un objectif 60 x et un zoom numérique 3 x permet l’imagerie d’une cellule dans son intégralité, tout en offrant un grossissement suffisant. Valeur temps de pause de pixel 2-4 μs et transmission AOTF pour le laser 488 nm et 561 nm tel que les images montrent un bon rapport signal sur bruit sans aucun blanchiment et aucun pixel indiquant la saturation intensité de fluorescence.
3. L’image, à l’aide de set laser puissance, transmission AOTF, temps de pause de pixel et zoom numérique, 15-20 cellules exprimant GFP — cerise.
4. Ensuite, l’image avec la même puissance de laser de réglage et temporisation pixel, transmission AOTF zoom numérique cellules exprimant GFP — PA-Cherry et PA-GFP — cerise. Recherche pour exprimer des cellules de la couche verte ou le canal rouge, respectivement. Éviter la longue exposition des cellules au cours de la recherche pour exprimer des cellules afin de ne pas javelliser les protéines fluorescentes.
5. Mettre en place une série de mini-temps avec une seule image de préactivation et trois images après activation. Les images après activation permettra d’identifier les éventuels états transitoires de sombres en raison de l’exposition aux rayons UV.
   Remarque : Dans nos mains, changements dans l’intensité de la fluorescence détectée en raison des États sombres transitoires étaient < 1 % et pourrait être négligé, mais ces États sombres devraient être évalués pour chaque montage expérimental.
6. Pour déterminer l’efficacité de photoactivation, c'est-à-dire, la fraction de PA-FPs qui est allumé pour être fluorescent, dans les expériences de photoactivation spécifiques qui ont déjà été établis, appliquer les mêmes paramètres de photoactivation de 15 à 20 cellules qui expriment les dirigeants internes introduites ici et de procéder à l’analyse d’image (section 4). Si commence à mettre en place des expériences de photoactivation, trouver ici quelques réglages différents basés sur notre expérience expérimentale avec PA-GFP et PA-Cherry ; modifier au besoin.
   1. Pour les instantanés photoactivation de PA-GFP et PA-Cherry utilisant un confocal laser scanning microscope (CLSM), s’appliquent μW 90 de 405 nm lumière laser dans 3 ou 5 itérations, respectivement.
      Remarque : Avec notre système microscopique, à l’aide d’une transmission de AOTM 38 % et un temps de pause de pixel 2 μs, nous avons mesuré cette puissance de laser de 405 nm en mode de balayage linéaire à la lentille de l’objectif. Avec ces paramètres, environ 8 % et 16 % des PA-GFP et PA-Cherry exprimées peuvent être photoactivation être fluorescent. La série de titrage complet à l’aide de CLSM de photoactivation instantanée a été publiée précédemment¹⁷.
   2. Si une fraction plus élevée de photoactivation PA-GFP et PA-Cherry fluorophores est avantageux par exemple pour obtenir un rapport signal-bruit plus élevé, et photoactivation n’a pas à être immédiat, appliquez 40 μW de 405 nm laser avec un temps de pause pour le pixel μs et 6 % 2 Transmission de AOTF pour 450 itérations. Puis, photoactivation prendra jusqu'à 4 min par opposition à seulement 1-2 secondes, mais efficacité de photoactivation pour PA-GFP sera de 29 % au lieu de 8 %, ce qui permet un rapport signal-bruit plus élevé.
7. S’il existe un système d’éclairage numérique de mosaïque qui contient des tableaux de micro miroir dans un modulateur spatial de lumière, lumière de 405 nm laser peut être utilisée pour widefield-photoactivation. Cela permet de photoactivation efficace quelques millisecondes.
   Remarque : Avec la puissance de laser de mW en 1,6 telle que mesurée à la lentille d’objectif et un temps d’exposition de 250 ms, 29 % des PA-GFP peut être photoactivation être fluorescent.
8. Image avec tous les paramètres set photoactivation de 15 à 20 cellules exprimant PA-GFP — cerise et GFP — PA-Cherry, respectivement.
9. Étant donné que le pH, les espèces réactives de l’oxygène et les autres facteurs environnementaux peuvent influencer l’efficacité de photoactivation, il peut être important d’évaluer les efficacités de photoactivation du PA-SFP dans le micromilieu subcellulaire respectif où la protéine d’intérêt est situé. En couplant les chimères du fluorophore à la protéine d’intérêt, comme les auteurs l’ont fait avec la membrane plasmique protéine VSVG ¹⁸, photoactivation efficacité peut être évaluée dans le compartiment subcellulaire spécifique d’intérêt.

4. image Analysis and algorithme pour ratiométrique fondés sur l’intensité de Quantification de Photoactivation efficacité

1. Analyse d’image peut être fait avec le plates-formes ImageJ ou Fidji de traitement d’image open source. Déterminer l’intensité de fluorescence de fond dans les cellules non transfectées dans le vert (B₁) et le canal (B₂) rouge. Évitez périnucléaire ou toutes les zones montrant une augmentation automatique-fluorescence.
2. Pour déterminer l’intensité de fluorescence dans une cellules transfectées, décrire le corps de la cellule avec l’outil de sélection à main levée. Encore une fois, éviter périnucléaire ou toute autre zone liste auto-fluorescence.
3. Soustraire l’arrière-plan de l’intensité de la fluorescence mesurée dans chaque canal.
   J’ai_G = I_{Green_measured} – B₁
   J’ai_R = I_{Red_measured} – B₂
4. Utilisation de la GFP — cerise construct pour calculer le ratio de rouge-à-vert (RtoGr) et de corriger les donateurs-piégeage en raison du transfert d’énergie de fluorescence par résonance (FRET). L’efficacité de la frette E a été établie à 0,3 dans des expériences antérieures de la GFP — construction de cerise à l’aide de l’éditeur de liens du même acide aminé entre les deux fluorophores¹⁸.
   RtoGr = (j’ai_{Red_measured} – B₂) / (j’ai_{Green_measured} – B₁)
   RtoGr_corr = RtoGr * (1-E)
   Remarque : Dans cette approche de base intensité, donneur trempe pour mEGFP et PA-mGFP peut être différent compte tenu des propriétés spectrales distinctes possibles qui n’ont pas été caractérisées. Le taux de FRET (kET) et la distance de Foerster (R0) dépendent du rendement quantique du donneur qui n’a pas été déterminé pour mEGFP et PA-mGFP.
5. Utilisation de la GFP — construction de PA-Cherry afin d’évaluer la fraction de photoactivation PA-Cherry. Déterminer l’intensité de fluorescence attendue de PA-Cherry en multipliant l’intensité de la fluorescence verte inassouvie mesurée de la GFP — PA-Cherry construire préalable de photoactivation avec le corrigé rouge-à-vert-ratio (RtoGr_corr ).
   J’ai_{Red_expected} (I_{Green_measured} -B,₁) = * RtoGr_corr
   Remarque : Comme indiqué ci-dessus, la luminosité moléculaire de la FP toujours sur et la photoactivatable FP peut être différente. Voir la Discussion pour plus d’informations sur la façon de tenir compte de ces différences.
6. Calculer l’efficacité de photoactivation de PA-Cherry comme une fraction de l’intensité de fluorescence rouge mesurée après photoactivation et l’intensité de fluorescence attendus dans le canal rouge.
   (F_PA-Cherry) = (j’ai_{Red_measured} – B₂) / j’ai_{Red_expected}
7. Utiliser le PA-GFP — cerise construct afin d’évaluer la fraction de photoactivation PA-GFP. Déterminer l’intensité de fluorescence attendue de PA-GFP en divisant l’intensité de la fluorescence rouge mesurée de la PA-GFP — cerise construire préalable de photoactivation par le rouge-à-vert-ratio (RtoGr). Ici, le RtoGr n’a pas besoin d’être corrigé pour la trempe, des donneurs car GFP et PA-GFP sont passibles de donateurs trempe au même montant.
   J’ai_{Green_expected} = (j’ai_{Red_measured} – B₂) / RtoGr
8. Calculer l’efficacité de photoactivation de PA-GFP comme une fraction de l’intensité de fluorescence verte mesurée après photoactivation et l’intensité de fluorescence attendus dans le canal vert.
   (F_PA-GFP) = (j’ai_{Green_measured} – B₁) / j’ai_{Green_expected}

Résultats

Le protocole présenté ici montre la quantification logométrique de la fraction des protéines fluorescentes qui sont photoactivées d’être fluorescente (Figure 1). Cette fraction est différent selon le mode de photoactivation.

Le résultat typique à l’aide de photoactivation de haute puissance peu de temps avec un confocal laser scanning microscope (CLSM) est affiché à la

Discussion

Jusqu’ici, aucune méthode n’existait pour déterminer, en vrac, la fraction de PA-FPs exprimées dans des cellules vivantes qui est photoactivées d’être fluorescente. Le protocole présenté peut être utilisé pour n’importe quelle paire de protéine fluorescente spectralement distinctes. Bien qu’illustrée ici pour l’irréversible PA-FPs PA-GFP et PA-cerise, cette approche est en principe applicable aux protéines et ainsi. La protéine fluorescente spectralement distincte, toutefois, doit être sélecti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
pEGFP-N1 mammalian cell expression vector	Clontech
DMEM w/o phenol red	Thermo Fisher Scientific	11054020
Trypsin w/o phenol red	Thermo Fisher Scientific	15400054
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080
LabTek 8-well chambers #1.0	Thermo Fisher Scientific	12565470
Fugene 6	Promega	E2691