La distribution d'eau de Xylem dans les usines ligneuses visualisée avec un microscope électronique cryo-scanné

Résumé

L'observation de la distribution d'eau dans le xylisme fournit des informations significatives sur la dynamique du débit d'eau dans les plantes ligneuses. Dans cette étude, nous démontrons l'approche pratique pour observer la distribution d'eau de xylée in situ en utilisant un cryostat et cryo-SEM, qui élimine les changements artifactual dans l'état de l'eau pendant la préparation de l'échantillon.

Résumé

Un microscope électronique à balayage installé cryo-unité (cryo-SEM) permet l'observation des spécimens à des températures inférieures à zéro et a été utilisé pour explorer la distribution d'eau dans les tissus végétaux en combinaison avec des techniques de fixation du gel à l'aide d'azote liquide (LN ₂). Pour les espèces ligneuses, cependant, les préparations pour l'observation de la surface transversale du xylisme impliquent certaines difficultés en raison de l'orientation des fibres de bois. En outre, une tension plus élevée dans la colonne d'eau dans les conduits de xylée peut parfois provoquer des changements artificiels dans la distribution de l'eau, en particulier lors de la fixation et la collecte de l'échantillon. Dans cette étude, nous démontrons une procédure efficace pour observer la distribution d'eau dans le xylisme des plantes ligneuses in situ en utilisant un cryostat et cryo-SEM. Dans un premier temps, lors de la collecte de l'échantillon, la mesure du potentiel d'eau xylée devrait déterminer si une tension élevée est présente dans les conduits de xylisme. Lorsque le potentiel d'eau du xylée est faible (lt; vers 0,5 MPa), une procédure de relaxation de tension est nécessaire pour faciliter une meilleure préservation de l'état de l'eau dans les conduits de xylée pendant la fixation du gel de l'échantillon. Ensuite, un collier étanche est fixé autour de la tige de l'arbre et rempli de LN₂ pour la fixation de gel de l'état de l'eau du xylème. Après la récolte, il faut veiller à ce que l'échantillon soit conservé congelé tout en complétant les procédures de préparation à l'observation de l'échantillon. Un cryostat est utilisé pour exposer clairement la surface transversale du xylisme. Dans les observations cryo-SEM, l'ajustement du temps pour le gel-gravure est nécessaire pour enlever la poussière de gel et d'accentuer le bord des parois cellulaires sur la surface d'observation. Nos résultats démontrent l'applicabilité des techniques cryo-SEM pour l'observation de la distribution d'eau dans le xylisme aux niveaux cellulaire et subcellulaire. La combinaison de cryo-SEM avec des techniques d'observation in situ non destructive améliorera profondément l'exploration de la dynamique du débit d'eau des plantes ligneuses.

Introduction

La disponibilité des ressources en eau (c.-à-d. précipitations, teneur en eau du sol) détermine strictement la mortalité et la répartition géographique des espèces végétales, puisqu'elles doivent absorber l'eau du sol et la transporter vers les feuilles pour la production photosynthétique. Les usines doivent maintenir leur système de transport d'eau sous des approvisionnements fluctuants en eau. En particulier, les plantes ligneuses génèrent de fortes tensions dans leurs conduits le long des cours d'eau de transpiration car, dans certains cas, elles doivent tenir leur couronne à plus de 100 m au-dessus du sol. Pour maintenir des colonnes d'eau sous une pression négative aussi élevée, les conduits de xylée se composent d'un continuum de cellules tubulaires avec des parois cellulaires rigides et hydrophobes lignifiées¹. La vulnérabilité au dysfonctionnement du xylée des conduits de xylisdans chaque espèce est un bon déterminant de la survie de l'espèce sous l'approvisionnement fluctuant en eau². En outre, l'étude de l'état de l'eau des conduits de xylée est importante pour l'évaluation de l'état de santé des arbres individuels soumis à des stress abiotiques ou biotiques. La mesure du débit de sève ou du potentiel d'eau peut fournir des estimations de l'état de l'eau d'une usine ligneuse en raison de la fonction hydraulique intégrée des conduits de xylisme. En outre, la visualisation de la distribution de l'eau dans les cellules xylées peut clarifier l'état des composants individuels du système hydraulique xylée.

Plusieurs techniques de visualisation de l'état de l'eau des conduits de xylage existent³. Les méthodes classiques et utiles pour observer les voies d'eau dans les tissus ligneux impliquent de tacher la colonne d'eau en plongeant les extrémités des branches coupées dans un colorant ou en injectant un colorant dans les tiges d'arbres debout⁴. La photographie aux rayons X souple permet également la visualisation de la distribution de l'eau des disques de bois tranchés en raison de l'intensité différentielle d'absorption des rayons X de l'humidité dans le xylisme^5,6. Ces méthodes, cependant, ne fournissent que des traces de mouvement de l'eau ou démontrent des distributions macroscopiques de l'eau. Récemment, les techniques d'observation non destructives, telles que la tomographie calculée par rayons X micro focus (CT)^7,8,9,10et l'imagerie par résonance magnétique (IRM)^{11, 12}, ont été considérablement améliorés pour permettre l'observation de l'eau dans les conduits de xylage dans les jeunes arbres intacts. Ces méthodes non destructives ont de grands avantages en ce que nous pouvons observer l'état de l'eau du xylèm sans effets de coupe artificielles, et nous pouvons suivre la dynamique du débit d'eau par imagerie séquentielle ou l'introduction d'un agent de contraste¹⁰. Cependant, nous devons utiliser une IRM personnalisée pour l'imagerie végétale ou une installation spécialisée pour l'OstT à base de synchrotron afin d'obtenir les images qui peuvent identifier la teneur en eau au niveau cellulaire. En outre, bien que le système de TCT à base de synchrotron ait permis d'obtenir des images fines avec une haute résolution spatiale, ce qui est comparable à la microscopie légère^7,8,9, les cellules vivantes peuvent être blessées par le rayonnement de rayons X à haute énergie^13,14. L'utilisation d'un microscope électronique à balayage dans lequel des cryo-unités sont installées (cryo-SEM) est une méthode très utile pour localiser précisément l'eau dans le xylisme au niveau cellulaire, bien que cela nécessite la récolte destructrice de l'échantillon pour l'observation. Pour fixer l'eau dans les conduits de xylème, une partie des tiges (c.-à-d. brindilles, branches ou tiges) sont congelées in situ par l'azote liquide (LN₂). Les observations de la surface des spécimens congelés et taillés par cryo-SEM fournissent des images très amples de la structure du xylisme à partir de laquelle nous pouvons identifier l'eau dans les conduits de xylée comme de la glace. Une limitation importante de cette méthode est qu'il est impossible d'observer séquentiel la movabilité de l'eau dans le même échantillon. Cependant, l'application de l'ItC ou de l'IRM pour l'observation séquentielle des arbres qui vivent dans un champ est extrêmement difficile parce que ces instruments ne sont pas portables. En revanche, cryo-SEM a un potentiel pour utiliser cette technique sur les grands arbres dans les expériences sur le terrain pour visualiser clairement le contenu de l'eau non seulement au niveau cellulaire, mais aussi à un niveau de structure plus fine, par exemple, l'eau dans les fosses intervasculaires¹⁵, l'eau dans espaces intercellulaires¹⁶, ou bulles dans la colonne d'eau¹⁷.

Beaucoup d'études observant l'eau de xylem par cryo-SEM ont été rapportées ^{5,12,18,19,20,21,23}. Utsumi et coll. (1996) ont d'abord établi le protocole d'observation du xylème in situ par congélation d'un tronc vivant en remplissant le LN₂ dans un récipient fixé sur la tige²¹. La température de l'échantillon a été maintenue en dessous de -20 oC pendant la collecte de l'échantillon et pendant la préparation cryo-SEM afin d'éviter de faire fondre la glace dans des conduits de xylisme. Cette méthode a été utilisée pour observer l'eau dans le xylisme afin de clarifier la distribution de l'eau sous le régime changeant de l'eau^{11,12,24,25,26, 27,28}, la variation saisonnière de la distribution d'eau^21,29,30, l'effet des cycles de gel-dégel^{17,31, 32}, la distribution de l'eau dans le bois humide⁵, les changements dans la distribution de l'eau au cours de la transition du bois de sève au bois de coeur²⁰, le cours saisonnier de temps de l'activité cambiale et la différenciation des navires³³, et la cavitation induite par certains stress biotiques^23,34. La conductivité hydraulique et la vulnérabilité des conduits à la cavitation ont également été vérifiées à l'aide de cryo-SEM^35,36. Cryo-SEM équipé d'une spectrométrie de rayons X dispersive séduismnisée (EDX ou EDS) a été utilisé pour étudier la distribution des éléments à la surface d'un spécimen contenant de l'eau³⁷.

La fixation par congélation d'un tronc vivant qui contient des conduits sous haute tension hydraulique provoque parfois des cavitations artificielles qui sont observées par cryo-SEM comme cristaux de glace fracturés dans le lumen des conduits^38,39. En particulier, les espèces à larges deleurs avec des conduits plus longs et plus larges sont vulnérables aux artefacts induits par la tension, tels que la cavitation causée par la coupe d'échantillons, même si elle est menée sous l'eau^3,40. Les artefacts de cavitation deviennent visibles après l'échantillonnage d'un arbre qui transpire (c.-à-d. l'échantillonnage pendant la journée) ou dans de graves conditions de sécheresse et ils peuvent induire en erreur une surestimation de l'occurrence de cavitation^{3,38, 39}. Par conséquent, la tension de travail dans les conduits doit être libéré afin d'éviter la cavitation artifactual^3,12,39.

La technique de congélation-fracture à l'aide d'un couteau installé dans une chambre de spécimen est souvent employée pour exposer la surface de spécimen pour l'observation cryo-SEM. Cependant, les plans gelés des tissus végétaux ligneux, en particulier les sections transversales du xylisme secondaire, sont trop rugueux pour observer clairement les caractéristiques anatomiques et l'eau dans le tissu⁶. L'application d'un cryostat pour l'élagage d'un spécimen permet une préparation rapide et de haute qualité des surfaces d'échantillon^20,23. L'objectif global de cette méthode est de fournir des preuves avec la résolution de microscopie électronique de la distribution de l'eau dans divers types de cellules xylées in situ sans l'occurrence d'artefacts d'échantillonnage. Nous introduisons notre procédure mise à jour, qui a été régulièrement améliorée depuis que nous l'avons adoptée pour la première fois, en ce qui concerne l'échantillonnage, la coupe et le nettoyage de la surface du spécimen pour obtenir des micrographes électroniques de haute qualité d'échantillons cryo-fixes de xylisme.

Protocole

REMARQUE : Un tableau schématique de ce protocole est affiché à la figure 1.

1. Échantillonnage : Relaxation de tension dans la colonne d'eau des conduits de Xylem

REMARQUE : Le traitement suivant de relaxation de tension est recommandé avant l'application de LN₂ pour éviter les artefacts de congélation et de tension-induits dans la distribution d'eau de xylème.

1. Enfermer une branche et des feuilles pour l'échantillonnage avec un sac en plastique noir pour équilibrer le potentiel d'eau entre le xylisme et les feuilles plus de deux heures avant l'échantillonnage.
2. Déterminer le potentiel hydrique d'au moins deux feuilles de l'échantillon à l'aide d'une chambre de pression ou d'un psychromètre. Lorsque le potentiel d'eau est supérieur à environ 0,5 MPa (c.-à-d. qu'il n'existe pas ou qu'il n'y a pas de tension très faible), un échantillon peut être récolté après congélation (voir à la section 2 : fixation dugel). Lorsque le potentiel d'eau est inférieur à 0,5 MPa, un traitement de relaxation est nécessaire comme décrit ci-dessous.
3. Fixer un collier étanche autour de la tige afin d'être rempli d'eau. Une tasse en plastique sans fond peut servir de collier étanche. Il faut prendre soin de sceller étroitement les espaces entre la tige et le collier à l'aide d'un ruban adhésif pour prévenir les fuites de supports liquides qui sont utilisés par la suite. Pour la récolte de tiges flexibles comme les branches minces ou les brindilles, couler une partie de coupe dans un seau rempli d'eau en pliant la tige. Couper sous la surface de l'eau à l'aide de cisailles ou d'une scie. Transférer l'échantillon dans un autre récipient d'eau le plus rapidement possible afin de minimiser l'exposition de l'extrémité coupée à l'air.
4. Gardez l'extrémité coupée de l'échantillon sous l'eau. Pour les espèces à larges deleurs, assurez-vous que la longueur de l'endroit où un cryo-échantillon pour seM sera obtenu jusqu'au bord coupé de la tige récoltée est plus longue que la longueur maximale du récipient des échantillons afin d'éviter les artefacts induits par la tension dans l'échantillon cryo.
5. Couvrir l'échantillon contenant des feuilles avec un sac en plastique noir pour réduire la transpiration. Gardez l'extrémité coupée de l'échantillon dans l'eau et maintenez cette condition pendant environ 30 min afin de détendre la tension du xylisme. Éviter un temps de relaxation plus long (à 1 h) en raison d'un éventuel remplissage artificiel des conduits cavitated¹².
6. Mesurer à nouveau le potentiel d'eau pour confirmer la relaxation de la tension du xylée (près de 0 MPa).
   REMARQUE : Avant l'échantillonnage, la longueur maximale du navire de l'espèce cible devrait faire l'objet de recherches ou d'échantillons semblables selon la méthode d'injection d'air. Lors de l'échantillonnage d'un grand arbre, ou d'une grande branche, il est difficile de mener les procédures de tension-relaxation décrites ci-dessus. Par conséquent, les échantillons de grands arbres doivent être prélevés au cours de la période avant l'aube lorsque le potentiel d'eau xylée est plus élevé.

2. Congeler la fixation avec LN₂

1. Couper et ouvrir un côté d'un collier étanche avec des ciseaux ou un couteau utilitaire. Attachez fermement le collier autour de la tige avec un ruban adhésif tout en tenant l'ouverture horizontalement.
2. Portez des gants isolants/mitten, mais assurez-vous de tenir la bouteille de LN₂ en toute sécurité, et exécutez LN₂ dans le col pour le remplir avec LN₂. Gardez-le rempli en ajoutant régulièrement LN₂ pour geler complètement l'eau dans le xylème. Le temps nécessaire au gel dépend de la taille de l'échantillon; 1 min après l'ébullition de la LN₂ versée est suffisante pour une petite brindille ou un semis, tandis que plus de 20 min est nécessaire pour une tige d'un arbre plus grand²⁰. Ajouter le LN₂ en continu pendant le gel car il s'évapore rapidement en raison de grandes différences de température entre l'An₂ et les températures ambiantes.
3. Détachez le collier de la partie congelée de la tige de l'échantillon afin d'enlever le LN₂ après le temps de congélation suffisant. Assurez-vous de porter des gants isolants pour éviter tout contact avec d'éventuels déversements de LN₂ causés par le détachement du col.
4. Récoltez l'échantillon immédiatement avec une fine scie à main.
5. Couvrez l'échantillon congelé d'un morceau de papier d'aluminium ou mettez-le dans un tube d'échantillon, sur lequel les numéros d'iD d'échantillon sont écrits. Placez rapidement l'échantillon récolté dans un contenant rempli de LN₂ ou emballez-le dans une boîte isolée remplie de glace sèche.
6. Conserver les échantillons dans un congélateur profond jusqu'à l'observation. La température de stockage préférée est de 80 oC afin d'éviter la sublimation de la glace et sa recristallisation pendant le stockage.

3. Préparation des spécimens

REMARQUE : Pour l'observation, un échantillon doit être coupé et sa surface pour observation doit être rabotée à une température inférieure à zéro afin de maintenir la distribution d'eau dans son xylisme in situ. Un microtome biologique avec un système cryostat (cryostat) est idéal pour tailler et exposer la surface d'un spécimen dans ce type d'observation par cryo-SEM.

1. Fixer la température de la chambre de spécimen du cryostat à 30 oC, qui est habituellement assez froide pour maintenir la sève de xylée de la plupart des plantes dans un état gelé.
2. Couper un échantillon en un petit morceau (environ 2 cm de hauteur et environ 1 cm de largeur ou de diamètre) qui peut être ajusté pour le porte-échantillon d'un cryo-SEM. Utilisez un couteau pointu ou une scie à denté fine pour le rognage afin d'éviter de briser la glace dans le spécimen. Dans le cas d'un échantillon plus gros qui ne peut pas être coupé avec un couteau, pré-couper rapidement avec une scie refroidie dans une boîte de congélation.
3. Fixez la pièce taillée à un mandrin, un support pour un cryostat en montant sur un milieu d'intégration de congélation de tissu (par exemple, composé d'OCT) pour la cryo-sectionnement. Puis, attachez le mandrin à un spécimen titulaire d'un microtome du cryostat.
4. Couper la surface en rasant à plusieurs reprises avec des sections de 5 à 7 m d'épaisseur. Le découpage en coupant plus de 1 000 à 2 000 m, en profondeur totale par rapport à la surface initiale de la collecte de l'échantillon, est utile pour éliminer la partie endommagée de l'échantillon causée par le précoupement à l'avance avec un couteau ou la scie décrite à l'étape 3.2.
5. Après avoir grossièrement coupé une surface de l'échantillon, ajuster une partie inutilisée de la lame de microtome au-dessus de la surface du spécimen. Ne laissez pas la lame toucher l'échantillon qui dépasserait le réglage de l'épaisseur.
6. Avant la première coupe par la partie lame inutilisée, élargir légèrement la distance entre la surface du spécimen et la lame.
7. Couper la surface de l'échantillon seulement une ou deux fois. De plus, faites glisser la lame en ajustant à nouveau une partie de lame inutilisée sur la surface du spécimen.
8. Répétez les étapes 3.6 et 3.7 trois ou quatre fois. Ceci est important pour obtenir une surface claire sans « marques de couteau » (figure 4).
9. Après la coupe finale, placez la position de la lame loin de l'échantillon pour empêcher la poussière de coller sur l'échantillon.
10. Détachez le mandrin du porte-échantillon et détachez le spécimen du mandrin en enlevant le milieu d'intégration congelé à l'intérieur d'un couteau pointu. Assurez-vous que le spécimen est placé dans la chambre cryostat pour empêcher sa surface rabotée de la poussière de gel.
11. Attachez le spécimen à un porte-échantillons cryo-SEM avec un milieu d'intégration de congélation de tissu dans la chambre de cryostat.

4. Transfert à la chambre de spécimen Cryo-SEM

REMARQUE : Le spécimen préparé à la surface doit être protégé contre une augmentation de la température ou une accumulation de gel pendant le transfert de la chambre cryostat à l'étape d'observation dans la chambre de spécimen cryo-SEM.

1. Maintenir la température du stade froid dans la chambre de spécimen cryo-SEM à moins de 120 oC avec Le LN₂ selon le manuel d'utilisation de l'équipement.
2. Placer le porte-échantillons avec le spécimen préparé dans un récipient isolant rempli de LN₂ dans la chambre cryostat.
3. Tenez le porte-échantillon avec un spécimen échangeant la tige sous le LN₂. Évitez d'exposer le porte-échantillons à l'air dans la mesure du possible.
4. Installez rapidement le porte-échantillons dans la chambre de pré-évacuation de la chambre de spécimen cryo-SEM dès le début de l'évacuation de la chambre de pré-évacuation. Ensuite, placez le porte-échantillons sur la scène froide après l'évacuation complète de l'air. Bien qu'un peu d'accumulation de gel soit inévitable, la procédure de « gel-gravure » (étape 6) peut l'enlever.

5. Réglage dans SEM

REMARQUE : Le paramètre typique de l'observation est décrit ci-dessous. Certaines modifications sont nécessaires en fonction de l'état du vide ou du faisceau d'électrons.

1. Définiz les paramètres SEM pour l'observation comme suit :
   Tension d'accélération : 3 à 5 kV
   Température de l'étape du spécimen : 'lt; '120 'C
   Détecteur : Émission secondaire

6. Congélation

REMARQUE : Le gel-gravure est la procédure pour accentuer le bord des parois cellulaires de l'échantillon par la sublimation légère de cristal de glace. Le gel-gravure implique également l'élimination des poussières de gel de surface.

1. Allumez la tension d'accélération du pistolet électrique pendant le gel-gravure. Il est préférable d'effectuer des congélations pendant l'observation du spécimen.
2. Augmenter la température de l'étape du spécimen à 100 oC.
3. Attendez plusieurs minutes jusqu'à ce que la poussière de gel soit enlevée et que le niveau de surface de la glace dans les cellules xylées ait légèrement diminué par rapport aux parois cellulaires.
4. Abaisser la température de l'étape du spécimen à 120 oC.
   REMARQUE : S'il n'y a pas de contrôleur de température installé pour l'étape du spécimen, maintenez le spécimen à l'aide de la tige d'échange et détachez-le de l'étape du spécimen pendant quelques minutes. Observez le spécimen plusieurs fois au cours de ce processus de congélation afin de vérifier l'état de sublimation du spécimen.

7. Revêtement métallique (facultatif)

REMARQUE : Les améliorations récentes apportées à l'instrument SEM et au traitement de l'image peuvent fournir des images de haute qualité de spécimens isolants électriques sans revêtement métallique. Cependant, les spécimens non conducteurs, tels que les matériaux biologiques, sont parfois sujets à charge; une luminosité plus élevée à des positions spécifiques du spécimen en raison de l'accumulation d'électrons (« charge »). L'exposition du spécimen à des faisceaux d'électrons pendant une plus longue période ou pour un grossissement élevé, augmente les effets de charge. Le revêtement de la surface du spécimen avec des matériaux métalliques électriques-conducteurs empêche l'apparition de la charge. Utilisez le système de revêtement sous vide qui est installé dans l'unité cryo-SEM afin d'empêcher la température du spécimen d'augmenter pendant le revêtement.

1. Assurez-vous que le matériau de revêtement est installé à une tête d'évaporateur désignée du système de revêtement.
2. Maintenir la température de l'étape froide dans le système de revêtement en dessous de 170 oC.
3. Placez le porte-échantillon sur le stade froid du système de revêtement après un gel suffisant.
4. Ouvrez une cloison entre le stade froid et la tête de l'évaporateur.
5. Définir la valeur actuelle et la valeur de tension de la tête de l'évaporateur à environ 30 mA et 5 V, respectivement.
6. Évaporer le matériau de revêtement pendant environ 30 s pour enrober la surface du spécimen.
7. Définir à la fois les valeurs de courant et de tension de la tête de l'évaporateur à zéro et fermer la partition.
8. Placez le porte-échantillons sur le stade froid de la chambre du spécimen pour observation.

Résultats

Des images représentatives des surfaces transversales du xylée d'arbre conifère et à feuilles larges, observées par cryo-SEM, sont montrées à la figure 2. Au faible grossissement, la zone noire des images indique les cavités d'où disparaît entièrement ou partiellement l'eau, et la zone grise indique les parois des cellules xylées, le cytoplasme et l'eau (Figure 2A). Au grossissement élevé, il est é...

Discussion

Les méthodes d'observation cryo-SEM introduites dans ce document sont pratiques pour visualiser clairement la distribution de l'eau à l'échelle cellulaire. Grâce à cette méthode, l'exploration des changements dans la distribution de l'eau dans le xylisme peut potentiellement aider à clarifier le mécanisme de tolérance des espèces d'arbres au stress abiotique (pénurie d'eau ou de congélation) ou au stress biotique (maladie des arbres).

L'étape la plus cruciale de cette méthode est...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
coating material	JOEL Ltd., Japan	Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499
cryo scanning electron microscope	JOEL Ltd., Japan	JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX70
microtome blade	Thermo Scientific	HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium	Thermo Scientific	Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006