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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le but de ce protocole est de décrire une chambre parallèle modifiée d'écoulement de plaque pour l'usage en étudiant l'activation en temps réel des canaux d'ion mechanosensitive par le stress de cisaillement.

Résumé

Le stress de cisaillement de fluide est bien connu pour jouer un rôle important dans la fonction endothéliale. Dans la plupart des lits vasculaires, le stress élevé de cisaillement des augmentations aigues du flux sanguin déclenche une cascade de signalisation ayant pour résultat la vasodilatation atténcitant ainsi le stress mécanique sur la paroi vasculaire. Le modèle de l'effort de cisaillement est également bien connu pour être un facteur critique dans le développement de l'athérosclérose avec l'effort laminaire de cisaillement étant atheroprotective et le stress perturbé de cisaillement étant pro-atherogenic. Bien que nous ayons une compréhension détaillée des différentes voies intermédiaires de signalisation cellulaire, les récepteurs qui traduisent d'abord le stimulus mécanique en médiateurs chimiques ne sont pas complètement compris. Les canaux ioniques mécanosensibles sont essentiels à la réponse au cisaillement et régulent la signalisation cellulaire induite par le cisaillement contrôlant ainsi la production de médiateurs vasoactifs. Ces canaux sont parmi les premiers composants de signalisation activés à cisaillement et ont été liés à la vasodilatation induite par le cisaillement par la promotion de la production d'oxyde nitrique (p. ex., rectification intérieure de Ket potentiel récepteur transitoire [TRP] canaux) et facteur d'hyperpolarisation de l'endothélium (p. ex., canaux K et K activés par le calcium) et vasoconstriction induite par le cisaillement par un mécanisme indéterminé qui implique des canaux piézoïdes. Comprendre le mécanisme biophysique par lequel ces canaux sont activés par des forces de cisaillement (c.-à-d. directement ou par un récepteur mécano-récepteur primaire) pourrait fournir de nouvelles cibles potentielles pour résoudre la pathophysiologie associée au dysfonctionnement endothélial et l'athérogenèse. Il est encore un défi majeur d'enregistrer l'activation induite par le flux des canaux ioniques en temps réel en utilisant l'électrophysiologie. Les méthodes standard pour exposer les cellules à un stress bien défini, comme le rhéomètre de cône et de plaque et la chambre d'écoulement parallèle fermée de plaque ne permettent pas l'étude en temps réel de l'activation de canal d'ion. Le but de ce protocole est de décrire une chambre de flux de plaque parallèle modifiée qui permet l'enregistrement électrophysiologique en temps réel des canaux ioniques mécanosensibles sous le stress bien défini de cisaillement.

Introduction

Les forces hémodynamiques générées par le flux sanguin sont bien connues pour jouer des rôles majeurs dans la fonction endothéliale et vasculaire1,2. Il est également bien connu que plusieurs types de canaux ioniques répondent vivement aux changements dans le stress de cisaillement3,4,5 conduisant à l'hypothèse que les canaux ioniques peuvent être des capteurs de stress de cisaillement primaire. Plus récemment, nous et d'autres avons montré que les canaux ioniques mécanosensibles jouent des rôles critiques dans plusieurs fonctions vasculaires sensibles au stress de cisaillement, y compris la réponse vasoactive au stress de cisaillement6,7,8 , et l'angiogenèse développementale9. Les mécanismes de la sensibilité de cisaillement-stress des canaux d'ion, cependant, sont presque totalement inconnus. Cette lacune de connaissances est probablement due à la difficulté technique d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous un stress bien défini. Dans cet article, par conséquent, nous fournissons un protocole détaillé étape par étape régulièrement effectué dans notre laboratoire pour atteindre cet objectif6,7,10,11.

L'objectif global de cette méthode est de permettre l'investigation en temps réel de la mécanactivation du canal ionique sous un stress bien défini dans la gamme physiologique. Ceci est réalisé en modifiant une chambre parallèle standard d'écoulement de plaque pour permettre à une pipette électrophysiologique d'être abaissée dans la chambre et aux cellules d'accès cultivées sur la plaque inférieure pendant l'exposition en temps réel au flux, fournissant une approche unique pour réaliser ceci but6,7,11. En revanche, les chambres parallèles standard d'écoulement de plaque, décrites dans les publications précédentes peuvent être employées pour l'analyse en temps réel d'imagerie des cellules exposées aux forces de cisaillement12 ou à d'autres approches non-invasives13,14 mais pas pour Électrophysiologie. De même, l'appareil de cône et de plaque, une autre approche puissante pour exposer des cellules au stress de cisaillement15,16 n'est pas non plus approprié pour des enregistrements électrophysiologiques. Ainsi, ces dispositifs de débit ne permettent pas l'enquête sur la sensibilité au stress de cisaillement des canaux ioniques. La difficulté d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous le flux est la principale raison du manque d'informations sur les mécanismes responsables de ces effets cruciaux.

Pour ce qui est des approches alternatives pour atteindre le même objectif, il n'y en a aucune qui soit aussi précise ou contrôlée. Certaines études antérieures ont tenté d'enregistrer l'activité des canaux ioniques sous le flux en exposant les cellules à un flux de liquide provenant d'une autre pipette apportée à proximité d'une cellule de plus de17,18. C'est très non physiologique, car les forces mécaniques générées dans ces conditions ont peu en commun avec les profils physiologiques du stress de cisaillement dans les vaisseaux sanguins. Des préoccupations similaires s'appliquent aux tentatives de simuler le stress physiologique du cisaillement par perfusion de chambres ouvertes. Comme nous l'avons vu en détail dans notre étude précédente10, une interface à ciel liquide ouvert crée de multiples perturbations et recirculation, qui ne sont pas physiologiques. Pour répondre à toutes ces préoccupations, nous avons conçu une chambre de débit de plaque parallèle modifiée (MPP), également appelée « dispositif d'écoulement mini-invasif » dans nos études antérieures6,7,10,11, faite de l'acrylique et largement utilisé dans notre laboratoire. Cependant, en dépit du fait que la description originale de la conception a été publiée il y a près de 20 ans et qu'elle est le seul dispositif d'écoulement qui permet d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous un stress bien défini, cette méthodologie n'a pas été adopté par d'autres laboratoires et il n'y a que très peu d'études qui tentent d'enregistrer les courants en cours d'écoulement. Nous croyons, par conséquent, que fournir une description détaillée de l'utilisation de la chambre de débit MPP sera d'une grande aide pour les chercheurs qui s'intéressent aux canaux ioniques mécanosensibles et la biologie vasculaire.

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Protocole

L'utilisation d'animaux dans nos études est approuvée par l'Université de l'Illinois au Chicago Animal Care Committee (#16-183).

1. Assemblage de la chambre de flux de plaques parallèles modifiées

REMARQUE: Veuillez consulter le tableau 1 et la figure 1 pour les pièces d'information de la chambre de circulation des députés. Veuillez consulter la figure 1 pour un schéma détaillant l'orientation des pièces de chambre pour l'assemblage.

  1. Pour adhérer au verre rectangulaire de couverture, pièce D, au fond de la pièce C, faites d'abord la solution d'élastomère de silicone en mélangeant soigneusement l'agent de durcissement d'élastomère de silicone de 500 l dans 5 ml de base d'élastomère de silicone.
  2. Appliquer une fine couche de la solution d'élastomère de silicone autour des bords de l'espace rectangulaire de la pièce C et placez délicatement la pièce rectangulaire en verre D directement sur la solution d'élastomère de telle sorte que la pièce D couvre complètement l'espace rectangulaire ouvert de la pièce C. Essuyez soigneusement l'excès de solution d'élastomère de silicone.
  3. Répétez l'étape 1.2 pour adhérer au verre de couverture rectangulaire, pièce F, au fond de la pièce E et permettre à la solution d'élastomère de silicone de guérir pendant la nuit à température ambiante.
    REMARQUE: Une fois durci, le verre rectangulaire restera respecté jusqu'à six mois avant d'avoir besoin d'être remplacé.
  4. Commençant par la pièce de chambre inférieure, pièce E, assembler la chambre d'écoulement MPP en plaçant séquentiellement chaque pièce sur le dessus de la précédente dans l'ordre suivant : pièce E (en bas), pièce C, pièce B, pièce A (en haut).
  5. Alignez les trous de vis de chaque pièce dans les coins et vissez fermement les morceaux ensemble pour éviter que des fuites ne se produisent pendant l'administration de l'écoulement vers la chambre d'écoulement du MPP.

2. Préparation cellulaire et ensemencement dans la Chambre de flux du MPP

REMARQUE: Suivez les étapes 2.1-2.7 pour les cellules endothéliales cultivées. Suivez la méthode détaillée dans les étapes 2.8-2.14 pour isoler les cellules endothéliales de l'arcade artérielle mésentérique de souris et la préparation des cellules endothéliales fraîchement isolées.

  1. Dans une plaque de 6 puits, placez quatre à cinq cercles de verre de 12 mm et des cellules de semences entre 10 % et 30 % de confluence de sorte que les cellules simples peuvent être consultées pour les enregistrements électrophysiologiques.
  2. Incuber les cellules dans des conditions de culture standard (5% CO2, 37 oC) pendant pas moins de 2 h pour permettre aux cellules d'adhérer et pas plus de 24 h que les cellules endothéliales dans l'expérience des auteurs deviennent très plat et difficile à patcher lorsqu'il est ensedu à la sous-confluence pour plus de 24 h.
  3. Retirer un verre de couverture contenant des cellules adhérentes d'un puits de la plaque de 6 puits, rincer rapidement à la saline tamponnée par le phosphate (PBS) et transférer dans un plat Petri de 35 mm contenant une solution de bain électrophysiologique de 2 ml (tableau 2) avant le transfert au débit MPP chambre.
  4. Transférer le cercle de verre de couverture sur le verre de couverture rectangulaire, pièce D, qui est adhéré à la pièce C de la chambre d'écoulement MPP étant sûr que la solution adéquate reste sur le verre de couverture de sorte que les cellules ne soient pas exposées à l'air. Ajouter la solution de bain désirée (250 l) aux cellules afin que le cercle de verre de couverture et les cellules soient complètement immergés dans la solution.
  5. Placez le cercle de verre de couverture de telle sorte qu'il repose dans la moitié la plus proche du côté du réservoir de vide de sorte que les cellules seront en ligne avec les ouvertures de fendu de la pièce B. Assurez-vous que le cercle de couverture en verre adhère à la pièce D par l'adhérence de verre de solution de sorte que l'application de l'écoulement vers la chambre ne perturbe pas la position du cercle de verre de couverture.
  6. Assembler la chambre d'écoulement du MPP en sitoyant les pièces dans l'ordre approprié, tel que décrit dans les étapes 1.4 et 1.5 et comme indiqué à la figure 1. Transférer la chambre au stade du microscope et perfuser immédiatement la chambre avec une solution de bain de sorte que la solution atteigne le réservoir de vide pour l'aspiration (10 ml).
  7. Identifiez une cellule saine pour l'expérience en identifiant une cellule avec une bordure foncée et un noyau évident. Évitez les cellules qui semblent être des taches ou des cellules qui sont en contact avec d'autres cellules.
    REMARQUE: Dans le laboratoire des auteurs, les cellules endothéliales aortiques humaines et les cellules endothéliales mésentériques primaires de souris dans la culture sont employées. Cependant, tout autre type de cellule adhérente qui est d'intérêt pour les besoins de recherche spécifiques peuvent être utilisés de la même manière.
  8. Laver l'arcade artérielle isolée dans la solution de dissociation (tableau 2). Transférer l'arcade dans un tube centrifugeur de 2 ml contenant 2 ml de solution de dissociation préréchauffée (37 oC) (recette de solution de dissociation indiquée dans le tableau 2) contenant de la protéase neutre (0,5 mg/ml) et de l'élastase (0,5 mg/mL). Incuber pendant 1 h à 37 oC en secouant doucement toutes les 10 min.
  9. Retirez 1 mL de la solution de dissociation neutre de protéase/élastase et ajoutez 1 mg/mL de collagène de type 1. Remettre la solution de collagène à la solution contenant les artères pour une concentration finale de collagène de type 1 de 0,5 mg/mL. Incuber pendant 2 h 3 min à 37 oC.
  10. À l'aide de forceps de 5 grades, déplacez rapidement l'arcade sur un plat Petri de 35 mm de diamètre contenant une goutte de 750 ll de solution de dissociation fraîche et réfrigérée. Dissocier davantage le tissu en utilisant deux aiguilles de seringue séparices de 20 G pour libérer mécaniquement les cellules endothéliales des artères enzymatiquement digérées.
  11. À l'aide d'une tuyauterie en verre Pasteur jetable de 9 po, triturate la solution cellulaire 10x avant de transférer les cellules dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 ml à l'aide de la tuyauterie en verre.
  12. Laver le plat Petri avec une autre solution de dissociation de 750 l et transférer dans le même tube. À l'aide de la pipette en verre, disperser mécaniquement les cellules en pipetting au moins 10x pour créer une suspension de cellule unique en prenant soin de ne pas introduire des bulles qui peuvent endommager l'intégrité des cellules endothéliales.
  13. Ajouter directement 750 l de la suspension des cellules endothéliales (500 à 1 000 cellules) directement à la pièce D de la chambre d'écoulement du MPP sur la moitié la plus proche du côté du vide du réservoir. Laisser les cellules endothéliales adhérer entre 45 min et 1 h à température ambiante.
  14. Assembler la chambre d'écoulement du MPP en sitoyant les pièces dans l'ordre approprié, tel que décrit dans les étapes 1.4 et 1.5 et comme le montre la figure 1. Transférer la chambre au stade du microscope et perfuser immédiatement la chambre avec une solution de bain de sorte que la solution atteint l'aspiration du vide (10 ml). Identifier les cellules endothéliales accessibles par leur phénotype rugueux et rond19,20.
    REMARQUE: Une variété de méthodes de digestion et de cocktails enzymatiques ont été utilisés pour isoler les cellules endothéliales de différents lits artériels. Voir le tableau 3 pour les descriptions détaillées des protocoles qui ont été utilisés par une variété de chercheurs pour isoler les cellules endothéliales pour l'électrophysiologie de pince patch des canaux ioniques mécanosensibles. Ces méthodes sont probablement appropriées pour une utilisation en combinaison avec la chambre de débit MPP.

3. Contrôler le stress de cisaillement à la chambre de flux de MPP pour des enregistrements électrophysiologiques des canaux mécanosensibles activés par cisaillement

  1. Mettre en place un système de perfusion gravitationnelle en connectant un cylindre de seringue gradué de 30 ml à une serrure luer à 3 voies équipée d'un tube microbore (diamètre interne : 0,05 pouce, diamètre externe : 0,09 pouce) adapté à l'insertion dans le trou d'entrée de 3 mm de diamètre de la pièce A du MPP chambre.
  2. Attachez le cylindre gradué à la face extérieure de la cage de Faraday entourant la plate-forme d'électrophysiologie (Figure 2) à l'aide de ruban à double face. Avant d'insérer le tube dans la chambre du MPP, remplissez la seringue et le tube avec une solution de bain (voir le tableau 2 pour la solution de bain utilisée pour étudier les canaux de rectification intérieure de K dans les cellules endothéliales). Insérer le tube dans le trou d'entrée de la chambre d'écoulement MPP de la pièce A.
  3. Préremplir la chambre d'écoulement MPP avec une solution telle que la solution est enlevée dans le réservoir sous vide. Arrêter le flux vers la chambre et remplir le cylindre gradué à la marque supérieure. Calculez les débits manuellement en permettant à la solution de circuler dans la chambre et en utilisant un chronomètre pour calculer les mL/s à une hauteur de cylindre de seringue donnée.
  4. Soulevez ou abaissez la seringue pour modifier le débit, et ainsi cisaillez dans la chambre, et continuez ce processus jusqu'à ce qu'un niveau désiré de stress de cisaillement soit trouvé.
  5. Calculez le stress de cisaillement dans une chambre parallèle en utilisant l'équation suivante21:
    6 Q/h2w
    où la viscosité fluide (g/cm), le débit Q et la largeur de la chambre de plaque parallèle (w - 2,2 cm) et la hauteur (h à 0,1 cm) sont des taux d'écoulement.
    REMARQUE: Dans le système actuel de perfusion gravitationnelle, à hauteur de cylindre de seringue (mesurée du haut du cylindre) de 57 cm au-dessus du stade du microscope, le débit est de 0,3 ml/s. Le cisaillement calculé dans la chambre à cette hauteur et débit de cylindre de seringue est 0.7 dyn/cm2. Il convient également de noter que d'autres systèmes de perfusion, comme une pompe péristétique, peuvent être utilisés pour contrôler le débit vers la chambre d'écoulement du MPP. Cependant, ces dispositifs peuvent ajouter la turbulence non désirée et influencer la stabilité des mesures d'électrophysiologie sous l'écoulement, ainsi, utilisant le système de perfusion de gravité décrit ici est recommandé.
  6. Transférer une chambre assemblée contenant des cellules adhérentes au stade du microscope de la plate-forme d'électrophysiologie et insérer le tube prérempli avec une solution de bain dans le trou de la pièce A. Remplir simultanément la chambre et laver les cellules avec 10 ml de solution de bain par tournant le verrou luer à trois voies de telle sorte que la solution s'écoule vers la chambre.
  7. Une fois que la configuration de patch désirée est obtenue avec succès permettent aux courants de canal de se stabiliser dans un bain statique à température ambiante. Une fois que les courants se sont stabilisés, appliquez le cisaillement d'une manière progressive permettant aux augmentations de courant de se stabiliser avant l'augmentation suivante du stress de cisaillement.
    REMARQUE: Les auteurs trouvent le plus grand succès avec la configuration perforée de correction en étudiant les canaux d'ion mécanisés dans les cellules endothéliales. Pour effectuer des configurations perforées de patchs à cellules entières, ajoutez 5 l d'un stock de 60 mg/mL d'amphotericinbb dans du sulfure de diméthyle (DMSO) à 1 ml de solution de pipette filtrée stérile de 0,2 m. Après avoir généré un joint giga-ohm dans la configuration cellulaire, des plaques de cellules entières perforées se forment dans un délai de 2 à 5 minutes.
  8. Supprimer l'exposition au cisaillement des cellules en arrêtant le flux vers la chambre, ce qui permet aux courants de canaux mécanosensibles de revenir aux courants de base observés dans le bain statique.
  9. Isoler les courants d'intérêt des canaux ioniques mécanosensibles en modifiant la valence des solutions (p. ex., 60 mM Kdans la solution de bain avec 0 Ca2 dans la solution pipette pour étudier les canaux de K ' vers l'intérieur. Le tableau 2 montre des exemples de recettes de solutions) et/ou d'inhibition pharmacologique des sources actuelles potentiellement contaminantes.

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Résultats

Plusieurs photographies montrant des vues différentes de la chambre d'écoulement du MPP à l'étape du microscope (panneau supérieur) et une représentation schématique de la chambre d'écoulement du MPP (panneau inférieur) sont présentées à la figure 1. Le schéma détaille les dimensions de l'ensemble de l'appareil et de la chambre d'écoulement. La figure 2 montre une photographie du système de perfusion gravitationne...

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Discussion

Le système vasculaire est constamment exposé aux forces hémodynamiques actives, qui activent les canaux ioniques mécanosensibles3,22 mais les rôles physiologiques de ces canaux dans la mécanotransduction induite par le stress de cisaillement est seulement commence à émerger4,6,8. Les mécanismes responsables de la méchanosensibilité des canaux activés par le s...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ces travaux ont été financés par le National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL073965, IL) et (T32 HL007829-24, ISF). Les auteurs aimeraient également remercier le Scientific Machine Shop de l'Université de l'Illinois à Chicago pour avoir généré nos dernières chambres de flux mPP.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm sterile syringe filtersVWR28145-501Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution
5 grade forcepsFine Scientific Tools1252-30Used for transferring digested arteries to fresh solution
9" Pasteur PipetFisher Scientifc13-678-20DUsed for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells 
12 mm diameter Cover glass circlesFisher Scientifc12-545-80For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses
24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glassSigma-AldrichCLS2975224Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)
24 mm x 50 mm Rectangular Cover glassSigma-AldrichCLS2975245Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)
20 G syringe needlesBecton Dickinson and Co305175For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries
35 mm Petri dishGenesee Scientific32-103For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries
Amphotericin B solubilizedSigma-AldrichA9528-50MGUsed for generating the perforated whole-cell patch configuration.
Collagenase, type IWorthington Biochemical100 mg - LS004194Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher Scientifc67-68-5Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp
Elastase, lyophilizedWorthington Biochemical25 mg - LS002290 Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.
Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid Corning353046For use with studies involving cultured cells and multiple treatments
Neutral protease/dispaseWorthington Biochemical10 mg- LS02100 50 mg - LS02104Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation
SylGard World Precision InstrumentsSYLG184Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)
Tygon ND 10-80 tubingMicrobore TubingAAQ04133ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber

Références

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