Isolement du fibroblaste primaire adulte à ultrasons

Résumé

Nous présentons un protocole pour isoler les fibroblastes adultes primaires d'une manière facile, rapide et fiable, performable par les débutants (p. ex., les étudiants). La procédure combine la digestion des tissus enzymatiques et l'agitation mécanique avec des ondes ultrasoniques pour obtenir des fibroblastes primaires. Le protocole peut facilement être adapté à des exigences expérimentales spécifiques (p. ex., tissus humains).

Résumé

Les fibroblastes adultes primaires sont devenus un outil important pour étudier la fibrose, les interactions de fibroblaste et l'inflammation dans tous les tissus du corps. Puisque les fibroblastes primaires ne peuvent pas se diviser indéfiniment en raison de la différenciation ou de l'induction de la sénescence myofibroblaste, de nouvelles cultures doivent être établies régulièrement. Cependant, il y a plusieurs obstacles à surmonter au cours des processus de développement d'un protocole d'isolement fiable et d'isolement primaire du fibroblaste lui-même : le degré de difficulté de la méthode (surtout pour les débutants), le risque de contamination bactérienne, le temps nécessaire jusqu'à ce que les fibroblastes primaires puissent être utilisés pour des expériences, et la qualité et la viabilité cellulaires subséquentes. Dans cette étude, un protocole rapide, fiable et facile à apprendre pour isoler et culture les fibroblastes adultes primaires du cœur de souris, du poumon, du foie et du rein combinant digestion enzymatique et agitation ultrasonique est fourni.

Introduction

Les fibroblastes sont des cellules plates en forme de fuseau avec de multiples processus stellate et un vaste réticulum approximatif brut^1,2. Un fibroblaste moyen mesure 30 à 100 m et a une durée de vie de 57 à 3 jours^1,3. La durée moyenne du cycle cellulaire des fibroblastes humains varie de 16 à 48 h selon les conditions de culture⁴. Il est prouvé que la capacité réplicative et la qualité fonctionnelle des fibroblastes primaires cultivés sont en corrélation négative avec l'âge du donneur, ce qui suggère que les donneurs plus jeunes (animaux ou patients) devraient être préférés si possible^5,6 .

Les fibroblastes constituent un type cellulaire prédominant de la plupart des tissus du corps des mammifères. Malgré leur présence omniprésente, l'identification moléculaire des fibroblastes reste un défi⁷. Les fibroblastes migrent vers des tissus et des organes en développement provenant de différentes sources au cours du développement embryonnaire⁸. Pour cette raison, il existe une pléthore de protéines marqueurs que l'on peut trouver dans les fibroblastes alors que les protéines marqueurs uniques, qui sont présentes dans toutes les populations de fibroblastes et exclusives pour les fibroblastes, sont toujours manquantes. Ainsi, les modèles d'expression de plusieurs marqueurs reconnus sont habituellement utilisés pour identifier les fibroblastes. Parmi les marqueurs les plus reconnus sont la vimentine, la protéine de surface du fibroblaste humain (hFSP), le récepteur du domaine discoidin 2 (DDR2) et l'actine musculaire alpha lisse (SMA).

Les fibroblastes sont le type de cellule productrice de cellules productrices de matrice extracellulaire (ECM). Par conséquent, les fibroblastes maintiennent une architecture detissu ordonnée et fournissent le soutien mécanique pour les cellules voisines 1. L'équilibre entre la synthèse et la dégradation de l'ECM est un processus bien réglementé. Les changements vers la synthèse marquent le début d'un dépôt excessif d'ECM qui, s'il n'est pas terminé, conduit à la fibrose. La fibrose est médiée par les myofibroblastes, qui proviennent de fibroblastes activés subissant des changements moléculaires et phénotypiques. Une caractéristique des myofibroblastes est la sécrétion améliorée de l'ECM et des cytokines et l'expression de microfilaments arrangés par ordre⁹.

Les fibroblastes primaires ont été à l'honneur lors de recherches récentes portant sur la fibrose, l'inflammation des tissus et les interactions fibroblaste-cancer-cellule^10,11. Cependant, pour étudier efficacement les propriétés du fibroblaste dans la santé et la maladie, il est nécessaire d'isoler les fibroblastes adultes primaires viables sur une base régulière. Il existe plusieurs méthodes disponibles pour isoler les fibroblastes^12,13,14. Les trois principales méthodes d'isolement de fibroblaste sont la croissance des morceaux de tissu^12,digestion de tissu enzymatique^15,et perfusion enzymatique des organes creux^9,13,16. L'avantage de la croissance est un processus d'isolement doux sans dégradation cellulaire enzymatique. D'autre part, les cultures de croissance exigent habituellement des périodes de culture prolongées jusqu'à ce que les cellules puissent être employées pour des expériences. La digestion enzymatique commune est rapide mais comporte un risque de contamination avec d'autres types de cellules (par exemple, cellules endothéliales) ou des bactéries dans le processus d'agitation, qui est nécessaire pour dissoudre mécaniquement le tissu. En outre, ces méthodes sont souvent élaborées et nécessitent du temps et des compétences pour apprendre.

En ce qui concerne l'importance des fibroblastes primaires dans la recherche, il est encore nécessaire d'optimiser les approches existantes d'isolement cellulaire en termes de rapidité, de simplicité et de fiabilité. Ici, une nouvelle méthode d'isolement enzymatique enzymatique de fibroblaste à base d'ultrasons fournissant des cellules de haute qualité est fournie.

Protocole

Le protocole suivant suit les directives institutionnelles de soins aux animaux de Technische Universitàt Dresde, Allemagne (Numéro de dossier : T 2014/4) ainsi que les directives internationalement acceptées de soin animal (FELASA)¹⁷. La figure 1 visualise le processus d'isolement cellulaire.

1. Préparation de la configuration, du matériel et des médias

1. Préparer le milieu de culture cellulaire, la solution PBS, la solution de stock de mélange de collagène (reconstituer 50 mg de mélange de collagène lyophilisé dans 12 ml d'eau ultrapure stérile), et la solution de trypsine de 0,25 %.
2. Réchauffez le milieu, le PBS et la solution trypsine à 37 oC.
3. Préchauffer le bain d'eau à ultrasons à 37 oC.
4. Désinfecter les forceps, une spatule en acier inoxydable, des scalpels (2 x scalpels par organe) et 2 béchers en verre avec 70% d'éthanol et placent ces matériaux sous le capot de culture cellulaire.
5. Remplissez un bécher avec 70% d'éthanol et l'autre avec de l'eau stérile ou une solution PBS. Ces béchers sont nécessaires pour désinfecter et laver l'instrument après chaque procession d'orgue.
6. Placer les tubes en plastique stériles de 15 ml contenant du PBS froid sur de la glace humide. Le nombre de tubes dépend du nombre d'organes dont vous voulez isoler les fibroblastes.

2. Dissection de souris et enlèvement d'organe

1. Portez deux paires de gants l'une au-dessus de l'autre, de sorte que la première paire peut être enlevée dès que l'animal a été disséqué.
   REMARQUE : Cette procédure empêche les bactéries de la fourrure et de la peau de l'animal de se propager sur les organes.
2. Euthanasiez la souris (p. ex., dislocation cervicale) et épinglez la carcasse avec des aiguilles à chaque membre à un tampon en polystyrène.
3. Désinfecter la carcasse de souris à l'aide d'un vaporisateur d'éthanol à 70 %. Assurez-vous que la fourrure est trempée dans l'éthanol afin que les cheveux ne tourbillonnent pas.
4. Couper la fourrure juste au-dessus du tractus urogénital à l'aide de forceps chirurgicaux et de ciseaux atraumatic. Couper la peau le long de la ligne médiane du point de l'incision initiale au cou (3 - 4 cm) et ajouter des coupes de soulagement aux membres.
   CAUTION: Ne pas perforer la couche musculaire à cette étape pour éviter la contamination bactérienne!
5. Épinglez la peau sur le coussinet en mousse de polystyrène pour avoir un accès optimal à la musculature couvrant la cavité abdominale.
6. Désinfecter la musculature abdominale deux fois en utilisant 70% d'éthanol. Laissez sécher l'éthanol avant de passer à l'étape suivante.
7. Retirer la première paire de gants. Utilisez un nouvel ensemble stérile de forceps et de ciseaux.
8. Ouvrez la cavité abdominale et le thorax en incisant la couche musculaire avec des ciseaux chirurgicaux pour enlever délicatement les organes de choix. Par conséquent, maintenez l'organe doucement avec des forceps chirurgicaux (ne percez pas l'organe, utilisez une pression minimale) et coupez les vaisseaux sanguins approvisionnements près du point d'entrée à l'organe avec des ciseaux.
9. Mettez les organes dans les tubes stériles contenant du PBS froid. Fermez les tubes hermétiquement. Placer les tubes sur la glace humide jusqu'à ce qu'ils continuent avec l'étape 3.1.

3. Le mincing de tissu, la digestion et l'extraction de cellules

1. Transférer les tubes sous le capuchon de culture cellulaire stérile.
   CAUTION: Portez une paire de gants frais et désinfectez les tubes avec 70% d'éthanol avant de les transférer sous le capot!
2. Sortir l'organe du tube de 15 ml à l'aide de forceps stériles. Placez l'organe sur la moitié d'un plat stérile de 6 cm Petri et lavez l'organe brièvement avec du PBS pour enlever l'excès de sang. Transférer l'organe dans la seconde moitié du plat Petri, retirer l'excès de PBS.
3. Émincer le tissu à l'aide de deux scalpels stériles. Les fragments de tissu restants ne doivent pas être plus grands que 1 - 2 mm.
4. Transférer le tissu haché dans un nouveau tube stérile de 15 ml à l'aide de la spatule stérile et ajouter 2 ml de solution trypsine de 0,25 %. Placer le tube dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC pendant 5 min.
5. Vortex le tube doucement (environ 1400/min) pendant 10 s.
6. Arrêtez la réaction de trypsine sous le capot de culture cellulaire en ajoutant 4 mL de milieu de culture cellulaire contenant du FCS (Le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM), par exemple).
7. Ajouter 250 l de solution de mélange de collagène à chaque tube contenant du cœur ou du tissu pulmonaire et 100 l pour le rein ou le foie, respectivement.
8. Placer les tubes dans un bain d'eau à ultrasons (37 oC) et activer le sonicateur à ultrasons pendant 10 min.
   REMARQUE: Le bain d'eau à ultrasons utilisé dans ce protocole a une fréquence de fonctionnement de 35 kHz et une puissance maximale de 320 W.
9. Vortex les tubes doucement (vers 1400/min) pendant 10 s.
10. Placer les tubes à nouveau dans le bain d'eau à ultrasons pendant 10 min.
11. Vortex doucement (vers 1400/min) pour 10 s.
12. Désinfectez les tubes avec 70 % d'éthanol et transférez-les sous le capuchon de culture de cellules stériles.
13. Filtrer la solution avec un maillage de 40 m dans un nouveau tube stérile de 15 ml.
14. Centrifuger le tube à 500 x g pendant 5 min.
15. Retirer le supernatant et resuspendre la boulette dans 1 ml de milieu frais.
16. Transférer les cellules dans un récipient de culture cellulaire approprié (p. ex., plaque de 6 puits) etplacer le vaisseau dans l'incubateur de culture cellulaire pendant la nuit à 37 oC et 5 % de CO 2.
17. Le lendemain, retirez le milieu, lavez 3 fois avec du PBS, puis ajoutez du milieu frais (le volume ajouté dépend du récipient de culture cellulaire de choix, 2 ml par puits d'une plaque de 6 puits, etc.).
18. Changez le médium tous les deux jours.
    REMARQUE : Les fibroblastes peuvent être divisés après avoir atteint la confluence optique de 90 % (généralement après 5 à 7 jours).

Résultats

La capacité de ce protocole d'isoler les fibroblastes adultes du tissu murine plein a été démontrée. Des fibroblastes viables ont été obtenus qui pourraient être utilisés pour des expériences ultérieures telles que la coloration de l'immunofluorescence ou des expériences de prolifération (figure2D-F, Figure 5A).

Les fibroblastes adultes sont des cellules plates en forme de fuseau avec de ...

Discussion

Par rapport aux lignées cellulaires de fibroblastes immortalisées, les fibroblastes primaires offrent plusieurs avantages. Ils peuvent être isolés de manière rentable en haute qualité et en quantité. En outre, les cultures primaires offrent la possibilité d'étudier des cellules de plusieurs individus, ce qui augmente la fiabilité des résultats obtenus et diminue la probabilité de simplement étudier les artefacts de culture cellulaire. La génération continue de nouvelles cultures primaires empêche les alt?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Cell culture plates	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	depends on vessel	6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC professional suction
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm Nylon
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Cordless pipetting controller	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
Disposable pipette tips	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	depends on volume	50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Collagenase blend	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 mL
Senescence detection kit	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
Surgical scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
Surgical forceps	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577