Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per isolare i fibroblasti adulti primari in modo semplice, veloce e affidabile, performabile dai principianti (ad esempio, gli studenti). La procedura combina la digestione del tessuto enzimatico e l'agitazione meccanica con onde ultrasoniche per ottenere fibroblasti primari. Il protocollo può essere facilmente adattato a specifiche esigenze sperimentali (ad esempio, tessuto umano).

Abstract

I fibroblasti adulti primari sono diventati uno strumento importante per studiare la fibrosi, le interazioni con fibroblasti e l'infiammazione in tutti i tessuti del corpo. Poiché i fibroblasti primari non possono dividersi a tempo indeterminato a causa della differenziazione del miofibroblasto o dell'induzione della senescenza, è necessario stabilire regolarmente nuove culture. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli da superare durante i processi di sviluppo di un protocollo di isolamento affidabile e di isolamento fibroblasto primario stesso: il grado di difficoltà del metodo (soprattutto per i principianti), il rischio di contaminazione batterica, il tempo necessario fino a quando i fibroblasti primari possono essere utilizzati per gli esperimenti, e la successiva qualità cellulare e vitalità. In questo studio, viene fornito un protocollo veloce, affidabile e facile da imparare per isolare e coltura fibroblasti adulti primari dal cuore del topo, polmone, fegato e rene che combinano la digestione enzimatica e l'agitazione ultrasonica.

Introduzione

I fibroblasti sono cellule piatte a forma di mandrino con molteplici processi stellati e un ampio reticolo endoplasmico ruvido^1,2. Un fibroblasto medio misura 30 - 100 m e ha una durata di vita di 57 x 3 giorni^1,3. La durata media del ciclo cellulare dei fibroblasti umani varia da 16 a 48 h a seconda delle condizioni di coltura⁴. È dimostrato che la capacità replicativa e la qualità funzionale dei fibroblasti primari coltivati sono correlatrici negativamente con l'età del donatore, suggerendo che i donatori più giovani (animali o pazienti) dovrebbero essere preferiti, se possibile,^5,6 .

I fibroblasti costituiscono un tipo di cellula predominante della maggior parte dei tessuti del corpo dei mammiferi. Nonostante la loro presenza onnipresente, l'identificazione molecolare dei fibroblasti è ancora una sfida⁷. I fibroblasti migrano verso lo sviluppo di tessuti e organi provenienti da diverse fonti durante lo sviluppo embrionale⁸. Per questo motivo, c'è una pletora di proteine marcatore che possono essere trovate nei fibroblasti, mentre le proteine marcatore uniche, che sono presenti in ogni popolazione di fibroblasti ed esclusive per i fibroblasti, sono ancora mancanti. Pertanto, i modelli di espressione di diversi marcatori riconosciuti sono di solito utilizzati per identificare i fibroblasti. Tra i marcatori più riconosciuti sono vimentina, proteina superficiale del fibroblasto umano (hFSP), recettore del dominio discoidina 2 (DDR2) e actinmuscolare alfa liscio ( . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

I fibroblasti sono il principale tipo di cellule che producono matrici extracellulari (ECM). Di conseguenza, i fibroblasti mantengono un'architettura ordinata dei tessuti e forniscono supporto meccanico per le cellule vicine¹. L'equilibrio tra sintesi e degradazione ECM è un processo ben regolato. I spostamenti verso la sintesi segnano l'inizio di un'eccessiva deposizione di ECM che, se non terminata, porta alla fibrosi. La fibrosi è mediata dai miofibroblasti, che provengono da fibroblasti attivati sottoposti a cambiamenti molecolari e fenotipici. Un segno distintivo di miofibroblasti è una maggiore secrezione di ECM e citochine e l'espressione di microfilamenti sMA ordinati⁹.

I fibroblasti primari sono stati sotto i riflettori di una recente ricerca incentrata sulla fibrosi, l'infiammazione dei tessuti e le interazioni fibroblasto-cancro-cellula^10,11. Tuttavia, per studiare efficacemente le proprietà del fibroblasto in salute e malattia, è necessario isolare regolarmente i fibroblasti adulti vitali. Ci sono diversi metodi disponibili per isolare i fibroblasti^12,13,14. I tre principali metodi di isolamento del fibroblasto sono la crescita dai pezzi di tessuto¹², la digestione del tessuto enzimatico¹⁵e la perfusione ezimatica degli organi cavi^9,13,16. Il vantaggio della crescita è un processo di isolamento delicato senza degradazione cellulare enzimatica. D'altra parte, le colture di escrescenza di solito richiedono periodi di coltura prolungati fino a quando le cellule possono essere utilizzate per gli esperimenti. La digestione enzimatica comune è veloce, ma comporta un rischio di contaminazione con altri tipi di cellule (ad esempio, cellule endoteliali) o batteri nel processo di agitazione, che è necessario per sciogliere meccanicamente il tessuto. Inoltre, questi metodi sono spesso elaborati e richiedono tempo e abilità per imparare.

Per quanto riguarda l'importanza dei fibroblasti primari nella ricerca, è ancora necessario ottimizzare gli approcci esistenti di isolamento cellulare in termini di rapidità, semplicità e affidabilità. Qui, viene fornito un nuovo metodo di isolamento eziblasto etcimo basato su ultrasuoni che fornisce cellule di alta qualità.

Protocollo

Il seguente protocollo segue le linee guida istituzionali per la cura degli animali della Technische Universitat Dresden, in Germania (numero di file: T 2014/4) e le linee guida per la cura degli animali accettate a livello internazionale (FELASA)¹⁷. Figura 1 visualizza il processo di isolamento delle celle.

1. Preparazione dell'impostazione, del materiale e dei supporti

1. Preparare il mezzo di coltura cellulare, soluzione PBS, la soluzione di brogola di collagenae (ricostituire 50 mg di miscela di collagenasi liofilizzata in 12 mL di acqua ultrapura sterile) e soluzione di prova dello 0,25%.
2. Riscaldare il mezzo, il PBS e la soluzione trypsin a 37 .
3. Preriscaldare il bagno d'acqua ad ultrasuoni a 37 gradi centigradi.
4. Disinfetta le pinze, una spatola in acciaio inossidabile, bisturi (2x bisturi per organo) e 2 becher di vetro con 70% di etanolo e posizionano questi materiali sotto il cofano della coltura cellulare.
5. Riempire un becher con il 70% di etanolo e l'altro con acqua sterile o soluzione PBS. Questi becher sono tenuti a disinfettare e lavare lo strumento dopo ogni processione d'organo.
6. Mettere sterili tubi di plastica da 15 mL contenenti PBS freddo sul ghiaccio bagnato. Il numero di tubi dipende dal numero di organi da cui si desidera isolare i fibroblasti.

2. Dissezione del topo e rimozione dell'organo

1. Indossare due paia di guanti uno sopra l'altro, in modo che la prima coppia può essere rimosso non appena l'animale è stato sezionato.
   NOTA: Questa procedura impedisce ai batteri di diffondersi sopra gli organi.
2. Eutanasia il topo (ad esempio, dislocazione cervicale) e appunta la carcassa con aghi ad ogni arto a un cuscinetto in polistirolo.
3. Disinfettare la carcassa di topo utilizzando uno spray etanolo 70%. Assicurarsi che la pelliccia sia imbevuta di etanolo in modo che i capelli non turbinino.
4. Tagliare la pelliccia proprio sopra il tratto urogenitale utilizzando pinze chirurgiche e forbici atraumatiche. Tagliare la pelle lungo la linea mediana dal punto dell'incisione iniziale al collo (3 - 4 cm) e aggiungere tagli di rilievo agli arti.
   AVVISO: Non perforare lo strato muscolare in questo passaggio per evitare la contaminazione batterica!
5. Fissare la pelle al cuscinetto di schiuma di polistirolo per avere un accesso ottimale alla muscolatura che copre la cavità addominale.
6. Disinfettare la muscolatura addominale due volte utilizzando 70% etanolo. Lasciare asciugare l'etanolo prima di proseguire con il passo successivo.
7. Rimuovere il primo paio di guanti. Utilizzare un nuovo set sterile di pinze e forbici.
8. Aprire la cavità addominale e il torace incidendo lo strato muscolare con forbici chirurgiche per rimuovere delicatamente gli organi di scelta. Pertanto, tenere delicatamente l'organo con pinze chirurgiche (non perforare l'organo, utilizzare una pressione minima) e tagliare i vasi sanguigni di alimentazione vicino al punto di ingresso presso l'organo con le forbici.
9. Mettere gli organi nei tubi sterili contenenti PBS freddo. Chiudere i tubi ermeticamente. Posizionare i tubi sul ghiaccio bagnato fino a proseguire con il passaggio 3.1.

3. Mincing dei tessuti, digestione ed estrazione cellulare

1. Trasferire i tubi sotto la sterile cappa cellulare.
   ATTENZIONE: Indossare un nuovo paio di guanti e disinfettare i tubi con il 70% di etanolo prima di trasferirli sotto il cofano!
2. Estrarre l'organo dal tubo da 15 mL usando pinze sterili. Posizionare l'organo su una metà di una parabola Petri sterile di 6 cm e lavare brevemente l'organo con PBS per rimuovere il sangue in eccesso. Trasferire l'organo nella seconda metà del piatto Petri, rimuovere l'eccesso di PBS.
3. Mitoilare il tessuto utilizzando due bisturi sterili. I frammenti di tessuto rimanenti non devono essere superiori a 1 - 2 mm.
4. Trasferire il tessuto macinato in un nuovo tubo sterile da 15 mL utilizzando la spatola sterile e aggiungere 2 mL di 0,25% soluzione di prova. Collocare il tubo in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi per 5 min.
5. Vorticare delicatamente il tubo (circa 1400/min) per 10 s.
6. Interrompere la reazione alla trypsin sotto la cappa cellulare aggiungendo 4 mL di coltura cellulare contenente FCS medio (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), ad esempio.
7. Aggiungere 250 l di soluzione di miscela di collagenasi ad ogni tubo contenente cuore o tessuto polmonare e 100 L per il rene o il fegato, rispettivamente.
8. Collocare i tubi in un bagno d'acqua ad ultrasuoni (37 gradi centigradi) e attivare il sonicatore ad ultrasuoni per 10 minuti.
   NOTA: Il bagno d'acqua ad ultrasuoni utilizzato in questo protocollo ha una frequenza operativa di 35 kHz e una potenza massima di 320 W.
9. Vorticare delicatamente i tubi (circa 1400/min) per 10 s.
10. Riposizionare i tubi nel bagno d'acqua ad ultrasuoni per 10 min.
11. Vorticare delicatamente (circa 1400/min) per 10 s.
12. Disinfettare i tubi con il 70% di etanolo e trasferirli sotto la sterile cappa cellulare.
13. Filtrare la soluzione con una rete da 40 m in un nuovo tubo sterile da 15 mL.
14. Centrifugare il tubo a 500 x g per 5 min.
15. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di mezzo fresco.
16. Trasferire le cellule in un recipiente di coltura cellulare adatto (ad esempio, piastra di 6 pozze) e posizionare il recipiente nell'incubatrice coltura cellulare durante la notte a 37 e 5% CO₂.
17. Il giorno successivo, rimuovere il mezzo, lavare 3 volte con PBS, quindi aggiungere il mezzo fresco (il volume aggiunto dipende dal vaso di coltura cellulare di scelta, 2 mL per pozzo di una piastra di 6 pozzetti ecc.).
18. Cambiare il supporto ogni due giorni.
    NOTA: I fibroblasti possono essere divisi dopo aver raggiunto la confluenza ottica del 90% (di solito dopo 5-7 giorni).

Risultati

È stata dimostrata la capacità di questo protocollo di isolare i fibroblasti adulti dal tessuto murino solido. Sono stati ottenuti fibroblasti vitali che potrebbero essere utilizzati per esperimenti successivi come l'immunofluorescenza colorazione o gli esperimenti di proliferazione (Figura 2D-F, Figura 5A).

I fibroblasti adulti sono cellule piatte a forma di mandrino con più processi cellulari che...

Discussione

Rispetto alle linee cellulari fibroblaste immortale, i fibroblasti primari offrono diversi vantaggi. Possono essere isolati in modo conveniente in alta qualità e quantità. Inoltre, le colture primarie offrono la possibilità di studiare cellule da più individui, il che aumenta l'affidabilità dei risultati ottenuti e diminuisce la probabilità di studiare semplicemente gli artefatti della coltura cellulare. La generazione continua di nuove culture primarie previene le alterazioni genetiche che si verificano comunement...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Cell culture plates	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	depends on vessel	6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC professional suction
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm Nylon
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Cordless pipetting controller	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
Disposable pipette tips	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	depends on volume	50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Collagenase blend	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 mL
Senescence detection kit	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
Surgical scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
Surgical forceps	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577