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Résumé

Cet article détaille l'utilisation d'un kit de préparation de bibliothèque de chaîne de polymérase de multiplex ancré de chaîne suivi du séquençage de prochaine génération pour évaluer des fusions de gène oncogènes dans les échantillons solides cliniques de tumeur. Les étapes de l'analyse des bancs humides et des données sont décrites.

Résumé

Les fusions de gènes contribuent fréquemment au phénotype oncogène de nombreux types de cancer. En outre, la présence de certaines fusions dans les échantillons de patients atteints de cancer influence souvent directement le diagnostic, le pronostic et/ou la sélection thérapeutique. En conséquence, la détection précise des fusions de gènes est devenue un composant essentiel de la gestion clinique pour de nombreux types de maladies. Jusqu'à récemment, la détection clinique de fusion de gène a été principalement accomplie par l'utilisation des essais d'un seul gène. Cependant, la liste sans cesse croissante des fusions de gènes ayant une signification clinique a créé un besoin d'évaluer simultanément l'état de fusion de plusieurs gènes. Les tests basés sur le séquençage de nouvelle génération (NGS) ont répondu à cette demande grâce à la capacité de séquencer l'acide nucléique de façon massivement parallèle. Plusieurs approches basées sur NGS qui utilisent différentes stratégies d'enrichissement des cibles génétiques sont maintenant disponibles pour une utilisation dans le diagnostic moléculaire clinique, chacun avec ses propres forces et faiblesses. Cet article décrit l'utilisation de l'enrichissement cible et de la préparation de la bibliothèque à base de multiplex ancré pcR (AMP) suivis de NGS pour évaluer les fusions de gènes chez les spécimens cliniques de tumeurs solides. L'AMP est unique parmi les approches d'enrichissement à base d'amplicon en ce qu'elle identifie les fusions de gènes indépendamment de l'identité du partenaire de fusion. Les étapes d'analyse des données et de la banque mouillée qui assurent une détection précise de la fusion des gènes à partir d'échantillons cliniques sont détaillées ici.

Introduction

La fusion de deux gènes ou plus en une seule entité transcriptionnelle peut se produire à la suite de variations chromosomiques à grande échelle, y compris des suppressions, des duplications, des insertions, des inversions et des translocations. Grâce à un contrôle transcriptionnel altéré et/ou à des propriétés fonctionnelles altérées du produit génique exprimé, ces gènes de fusion peuvent conférer des propriétés oncogènes aux cellules cancéreuses1. Dans de nombreux cas, les gènes de fusion sont connus pour agir comme principaux moteurs oncogènes en activant directement la prolifération cellulaire et les voies de survie.

La pertinence clinique des fusions de gènes pour les patients atteints de cancer est d'abord devenue évidente avec la découverte du chromosome de Philadelphie et du gène de fusion BCR-ABL1 correspondant dans la leucémie myélogène chronique (LMC)2. Le petit inhibiteur de molécule imatinib mesylate a été développé pour cibler spécifiquement ce gène de fusion et a démontré l'efficacité remarquable dans les patients BCR-ABL1-positifs de CML3. Le ciblage thérapeutique des fusions de gènes oncogènes a également été couronné de succès dans les tumeurs solides, avec l'inhibition des gènes de fusion ALK et ROS1 dans le cancer du poumon non à petites cellules servant d'exemples primaires4,5. Récemment, le larotrectinib inhibiteur de NTRK a été FDA approuvé pour NTRK1/2/3 fusion-positives tumeurs solides, indépendamment du site de la maladie6. Au-delà de la sélection thérapeutique, la détection de la fusion des gènes a également des rôles dans le diagnostic et le pronostic de la maladie. Ceci est particulièrement répandu dans divers sous-types de sarcome et de malignité hématifique qui sont diagnostiquement définis par la présence de fusions spécifiques et/ou pour lesquels la présence d'une fusion informe directement le pronostic7,8 , 9 (en) , 10 Ans et plus , 11. Ce ne sont là que quelques exemples de l'application clinique de la détection de la fusion génétique chez les patients atteints de cancer.

En raison du rôle critique dans la prise de décision clinique, la détection précise de fusion de gène des échantillons cliniques est d'une importance vitale. De nombreuses techniques ont été appliquées dans les laboratoires cliniques pour la fusion ou l'analyse de réarrangement chromosomique, y compris: techniques cytogénétiques, transcription inverse réaction en chaîne de polymérase (RT-PCR), fluorescence in situ hybridation (FISH), immunohistochemistry (IHC), et 5'/3' analyse de déséquilibre d'expression (entre autres)12,13,14,15. À l'heure actuelle, la liste en pleine expansion des fusions de gènes exploitables dans le cancer a entraîné la nécessité d'évaluer simultanément l'état de fusion de plusieurs gènes. Par conséquent, certaines techniques traditionnelles qui ne peuvent interroger qu'un ou quelques gènes à la fois deviennent des approches inefficaces, surtout si l'on considère que les échantillons cliniques de tumeurs sont souvent très finis et ne peuvent être divisés entre plusieurs essais. Le séquençage de nouvelle génération (NGS), cependant, est une plate-forme d'analyse qui est bien adaptée pour l'essai multigène, et les essais basés sur NGS sont devenus communs dans les laboratoires cliniques de diagnostic moléculaire.

Les tests NGS actuellement utilisés pour la détection de fusion/réarrangement varient en ce qui concerne le matériel d'entrée utilisé, les chimies utilisées pour la préparation des bibliothèques et l'enrichissement des cibles, et le nombre de gènes interrogés dans le cadre d'un essai. Les analyses NGS peuvent être basées sur l'ARN ou l'ADN (ou les deux) extraits de l'échantillon. Bien que l'analyse à base d'ARN soit entravée par la tendance des échantillons cliniques à contenir de l'ARN hautement dégradé, elle contourne la nécessité de séquencer des introns grands et souvent répétitifs qui sont la cible d'essais de fusion à base d'ADN, mais qui se sont avérés difficiles pour ngS. analyse des données16. Les stratégies d'enrichissement cible pour les essais NGS à base d'ARN peuvent être largement divisées en approches hybrides de capture ou d'amplicon-négociées. Bien que les deux stratégies aient été utilisées avec succès pour la détection de la fusion, chacune contient des avantages par rapport aux17autres,18. Les essais de capture hybrides entraînent généralement des bibliothèques plus complexes et réduisent le décrochage allélique, tandis que les essais à base d'amplicon nécessitent généralement moins d'entrée et se traduisent par un séquençage moins hors cible19. Cependant, peut-être la principale limitation de l'enrichissement traditionnel à base d'amplicon est la nécessité d'amorces pour tous les partenaires de fusion connus. Ceci est problématique puisque de nombreux gènes cliniquement importants sont connus pour fusionner avec des dizaines de partenaires différents, et même si la conception d'amorce a permis la détection de tous les partenaires connus, les événements de fusion nouvelles resteraient inaperçus. Une technique récemment décrite appelée multiplexe ancré PCR (ou AMP pour faire court) aborde cette limitation20. Dans l'AMP, un adaptateur NGS « demi-fonctionnel » est collé à des fragments d'ADNc qui sont dérivés de l'ARN d'entrée. L'enrichissement ciblé est réalisé par amplification entre des amorces spécifiques au gène et une amorce à l'adaptateur. Par conséquent, toutes les fusions avec des gènes d'intérêt, même si un nouveau partenaire de fusion est impliqué, doivent être détectées (voir La figure 1). Cet article décrit l'utilisation du kit ArcherDx FusionPlex Solid Tumor, un essai basé sur NGS qui utilise l'AMP pour l'enrichissement des cibles et la préparation de la bibliothèque, pour la détection des fusions de gènes oncogènes dans des échantillons de tumeurs solides (voir tableau supplémentaire 1 pour liste complète des gènes). Le protocole de banc humide et les étapes d'analyse des données ont été rigoureusement validés dans un laboratoire certifié par le Laboratoire d'amélioration des laboratoires cliniques (CLIA).

Protocole

1. Préparation et séquençage de la bibliothèque

  1. Considérations générales d'examen et étapes de pré-assay
    1. Les essais se composent généralement de sept échantillons cliniques et d'un contrôle positif (bien que le nombre d'échantillons par course de préparation de la bibliothèque puisse être ajusté au besoin). Utilisez un contrôle positif qui contient au moins plusieurs fusions de gènes (que les cibles d'évaluation) qui ont été confirmées par un fabricant et/ou qui ont été confirmées par une méthodologie orthogonale. Un contrôle non-modèle (NTC) doit être inclus comme un échantillon supplémentaire dans chaque essai, mais n'est effectué que par la synthèse de l'ADNc de deuxième brin et le contrôle de la qualité pré-séquençage (Pre-Seq QC; pour assurer aucune synthèse de l'ADNc). Utiliser un diluant d'échantillon (10 mM Tris HCl pH 8.0) pour le CNT.
    2. Effectuer l'extraction totale d'acide nucléique (TNA) du tissu paraffine-intégré (FFPE) de formaline-fixe.
    3. Quantifier la composante ARN de l'ANt à l'aide d'un présométrique.
      REMARQUE : Prévenir la dégradation de l'ARN dans les échantillons en limitant les cycles de gel et de dégel, en maintenant l'acide nucléique décongelé à basse température (bloc réfrigéré, glace ou autre) et en empêchant la contamination par la NAse (porter des gants, utiliser un vaporisateur de décontamination de la RNase).
  2. Amorçage aléatoire
    REMARQUE: L'entrée souhaitée pour l'analyse est 200 ng ARN (basé sur la quantitation fluorométrique de l'ATN). Des entrées plus faibles peuvent être utilisées si 200 ng ne peuvent pas être atteints. Si l'échantillon échoue après le séquençage QC, répéter avec une entrée plus élevée peut entraîner des mesures QC acceptables.
    1. Diluer TNA dans 10 mM Tris HCl pH 8.0 pour atteindre la concentration désirée d'ARN. Pour chaque échantillon, transférer 20 l de la dilution dans les tubes de bande de réactif séminage aléatoires (placés dans un bloc d'aluminium préréfrigéré) et mélanger en pipetting de haut en bas 6 à 8 fois. Faites brièvement tourner vers le bas et transférez le volume entier à une plaque PCR de 96 puits et scellez avec le film de RT.
    2. Insérer la plaque dans le bloc thermocycleur, couvrir de coussinet de compression et fermer le couvercle. Incuber à 65 oC pendant 5 min (couvercle chauffé).
    3. Retirer la plaque du thermocycler et les déposer sur la glace pendant 2 min.
  3. Synthèse de cDNA du premier brin
    1. Transférer tout le volume du produit d'amorçage aléatoire dans les premiers tubes à bande de réactifs (placés dans un bloc d'aluminium préréfrigéré). Mélanger en pipetting de haut en bas 6 à 8 fois. Tourner brièvement vers le bas, transférer le volume entier à une plaque PCR 96 puits et sceller avec le film RT.
    2. Insérer la plaque dans le bloc thermocycleur, couvrir de coussinet de compression et fermer le couvercle. Programme de thermocycler : 25 oC 10 min, 42 oC 30 min, 80 oC 20 min, 4 oC (couvercle chauffé).
  4. Synthèse de cDNA de deuxième brin
    1. Dans un nouvel ensemble de tubes à bande PCR, créez une dilution de 1:10 du premier produit de brin en ajoutant 1 l de produit de premier brin à l'eau exempte de nucléane de 9 l. Mettre la dilution de côté pour être utilisé dans l'assay pré-Seq QC.
    2. Ajouter 21 L d'eau sans nucléane au produit du premier brin restant. Transférer 40 l du premier produit à brin et nucléer l'eau libre sur le tube à bande de réactif du deuxième brin (placé dans un bloc d'aluminium préréfrigéré). Mélanger en pipetting de haut en bas 6 à 8 fois. Faites tourner vers le bas, transférez le volume entier à une plaque PCR de 96 puits et scellez avec le film de RT.
    3. Insérer la plaque dans le bloc thermocycleur, couvrir de coussinet de compression et fermer le couvercle. Programme de thermocycler : 16 oC 60 min, 75 oC 20 min, 4 oC (couvercle chauffé).
      REMARQUE : Il s'agit d'un point d'arrêt acceptable. La plaque peut être stockée à -20 oC.
  5. Pré-Seq QC
    REMARQUE : Cet analyse de contrôle de qualité (QC) est principalement utilisée pour la vérification de la synthèse sans ADNC du CNT. Cependant, les données peuvent également être informatives dans le dépannage d'analyse. Par exemple, si un échantillon a une bonne valeur pré-Seq QC mais de mauvaises mesures d'essai (voir ci-dessous), alors il pourrait être une indication d'un problème dans l'essai exécuter, nécessitant une répétition.
    1. Exécutez chaque échantillon et le CNT en double. Inclure également dans le Pre-Seq QC exécuter une réaction NTC, qui est l'eau sans nucléane (également exécuté en double). Pour chaque puits applicable d'une plaque de puits optique de 96, ajoutez 5 l du mélange maître d'analyse, 1 L d'amorce VCP 10x et 4 l de la dilution 1:10 du premier produit à brin qui a été créé à l'étape 1.4.1.
    2. Scellez la plaque avec du film RT, faites-les tourner et chargez-la dans un instrument PCR quantitatif (qPCR). Exécuter le programme: pré-ampli: 1 cycle 95 'C 20 s, ampli: 35 cycles 95 'C 3 s (4.C/s taux de rampe) '60 'C 30 s (2.2 'C/s taux de rampe).
    3. Confirmer l'absence d'un seuil de cycle (Ct) valeur à la fois pour le NTC d'essai et de réaction NTC.
      REMARQUE : S'il n'y a pas de Ct observé dans l'assay NTC, il ne sera plus reporté dans l'assay. L'observation d'une valeur Ct dans la réaction NTC nécessite une répétition de l'analyse pré-Seq QC. L'observation d'un Ct dans l'analyse NTC suggère la contamination de l'échantillon à un moment donné avant l'analyse, exigeant ainsi que l'analyse entière (tous les échantillons) soit recommencée. La valeur pré-Seq QC Ct pour un échantillon de qualité adéquate devrait être inférieure à 30 (les valeurs ct inférieures sont en corrélation avec plus de produit et donc d'ARN de meilleure qualité). Les valeurs supérieures à 30 ne sont pas des indicateurs absolus d'échec et ces échantillons doivent être maintenus dans l'évaluation. Cependant, toutes les données dérivées de ces échantillons doivent être examinées attentivement, en particulier dans les cas pour lesquels aucune fusion n'est appelée.
  6. Réparation de fin et purification de perles
    1. Transférer 40 L du produit du deuxième brin dans le tube à bande de réactif de réparation final (placé dans un bloc d'aluminium préréfrigéré). Mélanger en pipetting de haut en bas 6 à 8 fois, tourner vers le bas et placer dans le bloc thermocycleur (en gardant le couvercle chauffé ouvert) et exécuter le programme thermocycler: 25 oC 30 min, 4 oC tenir.
    2. Retirer les perles de purification à partir de 4 oC et laisser l'équilibre à la température ambiante. C'est assez d'éthanol pour durer pendant toute la préparation de la bibliothèque. Les perles de Vortex bien avant l'utilisation et le pipet 100 L dans le nombre approprié de puits d'une plaque u-bas.
      REMARQUE : Pour chaque 8 échantillons qui sont exécutés, 20 ml d'éthanol de 70 % seront nécessaires.
    3. Ajouter tout le volume du produit de réparation final aux perles. Pipet up and down 6-8 fois pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min, suivi d'une incubation de 5 min sur l'aimant.
    4. Retirez et jetez le supernatant et effectuez deux lavages à l'éthanol de 200 l à 70 % avec des incubations de 30 s. Après le lavage final, retirer tout l'éthanol de 70 % et laisser sécher l'air pendant 5 min.
    5. Retirer de l'aimant et resuspendre les perles dans 22 'L de 10 mM Tris HCl pH 8.0. Incuber l'aimant pendant 3 min suivi d'une incubation de 2 min sur l'aimant. Procéder immédiatement à l'étape de ligature 1.
  7. Étape de ligation 1 et purification de perles
    1. Transférer 20 L de la plaque de purification des perles de réparation finale (en prenant soin de ne pas déranger les granules de perles) dans les tubes de bande de l'étape de ligature 1 (placés dans un bloc d'aluminium préréfrigéré). Mélanger en pipetting de haut en bas 6-8 fois, spin vers le bas et transférer le volume entier dans une plaque DE 96 puits PCR.
    2. Insérer la plaque dans le bloc thermocycleur, couvrir de coussinet de compression et fermer le couvercle. Programme de thermocycler : 37 oC 15 min, 4 c de prise (couvercle chauffé).
    3. Retirer les perles de purification à partir de 4 oC et laisser l'équilibre à la température ambiante. Les perles de Vortex bien avant l'utilisation et le pipet 50 L dans le nombre approprié de puits d'une plaque u-bas.
    4. Ajouter tout le volume de ligature étape 1 produit aux perles. Pipet up and down 6-8 fois pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min, suivi d'une incubation de 5 min sur l'aimant.
    5. Retirez et jetez le supernatant et effectuez deux lavages à l'éthanol de 200 l à 70 % avec des incubations de 30 s. Après le lavage final, retirer tout l'éthanol de 70 % et laisser sécher l'air pendant 5 min.
    6. Retirer de l'aimant et resuspendre les perles dans 42 'L de 10 mM Tris HCl pH 8.0. Incuber l'aimant pendant 3 min suivi d'une incubation de 2 min sur l'aimant. Procéder immédiatement à l'étape de ligature 2.
  8. Étape de ligation 2 et purification de perles
    1. Retirez les réactifs à bande d'adaptateur de code à barres moléculaires (MBC) du stockage de 4 oC. La numérotage approprié de la bande d'adaptateur MBC est d'une importance cruciale car des index spécifiques à l'échantillon sont ajoutés à ce stade. Placez les tubes horizontalement avec les charnières à l'arrière et utilisez un marqueur permanent pour étiqueter les tubes 1, 2, 3... de gauche à droite. Il est également essentiel d'enregistrer les index spécifiques à l'échantillon à des fins de séquençage (ils doivent être entrés dans la feuille de travail du séquenceur).
    2. Transférer 40 L de la plaque de purification des perles de l'étape de ligature 1 (en prenant soin de ne pas déranger les granules de perles) vers les tubes à bande d'adaptateur MBC (placés dans un bloc d'aluminium préréfrigéré). Mélanger en pipetting de haut en bas 6 à 8 fois.
    3. Faites tourner et transférez tout le volume sur les tubes à bande de réactif séminable s'équillant de l'étape de ligature 2 (également placés dans un bloc d'aluminium préréfrigéré). Mélanger en pipetting de haut en bas 6 à 8 fois, tourner vers le bas et placer dans le bloc thermocycleur. Avec le couvercle chauffé, le programme thermocycler : 22 oC 5 min, 4 oC de cale.
      REMARQUE : Il s'agit d'un point d'arrêt sécuritaire et les échantillons peuvent être stockés à -20 oC.
    4. Retirer les perles de nettoyage de la ligature dans un entrepôt de 4 oC et laisser l'équilibre à la température ambiante. Préparer 1 ml de NaOH frais de 5 mM.
    5. Vortex les perles de nettoyage de la ligature et ajouter 50 L à un nouvel ensemble de tubes à bande PCR. Incuber sur l'aimant pendant 1 min. Après l'incubation de 1 min, retirer et jeter le supernatant. Retirer les tubes à bande de l'aimant et les suspendre à nouveau dans un tampon de nettoyage de la ligature de 50 l l en faisant monter et descendre 6 à 8 fois.
    6. Transférer tout le volume du produit de l'étape 2 de la ligature dans les tubes de bande de perles de nettoyage de ligature. Mélanger les échantillons par vortex et couver à température ambiante pendant 5 min. Encore une fois, mélanger les échantillons par vortex et couver à température ambiante pendant 5 min. Après la deuxième incubation de 5 min, mélanger les échantillons par vortex, spin ez ou d'autres brièvement et incuber sur l'aimant pendant 1 min.
    7. Retirer et jeter le supernatant. Ajouter 200 ll de tampon de nettoyage de la ligature et de vortex pour le suspendre à nouveau. Effectuer une rotation rapide et placer sur l'aimant pendant 1 min. Effectuer un deuxième lavage à l'aide du tampon de nettoyage de la ligature à nouveau.
    8. Après les deux lavages avec le tampon de nettoyage de ligature effectuer un lavage identique à l'aide d'eau ultrapure. Après le lavage à l'eau ultrapure, suspendre à nouveau les perles dans 20 'L de 5 mM NaOH et le transférer à une plaque DE 96 puits PCR. Placer la plaque dans un bloc thermocycleur à l'aide d'un tampon de compression et exécuter le programme de thermocycler : 75 oC 10 min, 4 oC (couvercle chauffé).
    9. Faites une fois que les échantillons ont refroidi jusqu'à 4 oC. Placer la plaque sur l'aimant pendant au moins 3 min et procéder immédiatement à la première PCR.
  9. Première purification de PCR et de perles
    1. Retirez les premiers tubes à bande de réactif PCR du stockage à 4 oC et placez-les dans un bloc d'aluminium préréfrigéré. En outre, retirez les amorces GSP1 de -20 oC et laissez l'équilibre à la température ambiante.
    2. Ajouter 2 L des amorces GSP1 à chaque puits des premiers tubes à bande de réactif PCR. Transférer 18 l de la ligature 2 produit de nettoyage pour les premiers tubes à bande de réactif PCR et mélanger en pipetting de haut en bas 6-8 fois.
    3. Faites tourner et transférez-les à une plaque PCR de 96 puits. Placer la plaque dans un bloc thermocycleur à l'aide d'un bloc de compression et exécuter le programme de thermocycler : 95 oC 3 min, 15 cycles 95 oC 30 s et 65 oC 5 min (taux de rampe à 100 %), 72 oC 3 min, 4 oC de prise (couvercle chauffé).
      REMARQUE : Il s'agit d'un point d'arrêt sécuritaire et les échantillons peuvent être stockés à 4 oC pendant la nuit ou à -20 oC pour un stockage à long terme.
    4. Retirer les perles de purification à partir de 4 oC et laisser l'équilibre à la température ambiante. Les perles de Vortex bien avant l'utilisation et le pipet 24 L dans le nombre approprié de puits d'une plaque u-bas.
    5. Transférer 20 L du premier produit PCR aux 24 ll de perles. Pipet up and down 6-8 fois pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min, suivi d'une incubation de 2 min sur l'aimant.
    6. Retirez et jetez le supernatant et effectuez deux lavages à l'éthanol de 200 l à 70 % avec des incubations de 30 s. Après le lavage final, retirer tout l'éthanol de 70 % et laisser sécher l'air pendant 2 min.
    7. Retirer de l'aimant et re-suspendre les perles dans 24 'L de 10 mM Tris HCl pH 8.0. Incuber l'aimant pendant 3 min suivi d'une incubation de 2 min sur l'aimant. Procédez immédiatement au deuxième PCR.
  10. Deuxième PCR et purification de perles
    1. Retirez les tubes à bande de réactifique sémino de 4 oC et placez-les dans un bloc d'aluminium préréfrigéré. La numérotisation appropriée des deuxièmes tubes à bande PCR est d'une importance cruciale car des index spécifiques à l'échantillon sont ajoutés à ce stade. Placez les tubes horizontalement avec les charnières à l'arrière et utilisez un marqueur permanent pour étiqueter les tubes 1, 2, 3... de gauche à droite. En outre, retirez les amorces GSP2 de -20 oC et laissez l'équilibre à la température ambiante.
      REMARQUE : Il est également essentiel d'enregistrer les index spécifiques à l'échantillon à des fins de séquençage (ils doivent être entrés dans la feuille de travail du séquenceur).
    2. Ajouter 2 L des amorces GSP2 à chaque puits des deuxièmes tubes à bande de réactif PCR. Transférer 18 l du premier produit de nettoyage PCR dans les deuxièmes tubes à bande de réactif pcR et mélanger en pipetting de haut en bas 6 à 8 fois.
    3. Faites tourner et transférez-les à une plaque PCR de 96 puits. Placer la plaque dans un bloc thermocycleur avec un bloc de compression et exécuter le programme thermocycler : 95 oC 3 min, 18 cycles 95 oC 30 s et 65 oC 5 min (taux de rampe de 100 %), 72 oC 3 min, 4 c de prise (couvercle chauffé).
      REMARQUE : Il s'agit d'un point d'arrêt sécuritaire et les échantillons peuvent être stockés à 4 oC pendant la nuit ou à -20 oC pour un stockage à long terme.
    4. Retirer les perles de purification à partir de 4 oC et laisser l'équilibre à la température ambiante. Les perles de Vortex bien avant l'utilisation et le pipet 24 L dans le nombre approprié de puits d'une plaque u-bas.
    5. Transférer 20 L de deuxième produit PCR sur les perles. Pipet up and down 6-8 fois pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min, suivi d'une incubation de 2 min sur l'aimant.
    6. Retirez et jetez le supernatant et effectuez deux lavages à l'éthanol de 200 l à 70 % avec des incubations de 30 s. Après le lavage final, retirer tout l'éthanol de 70 % et laisser sécher l'air pendant 2 min.
    7. Retirer de l'aimant et re-suspendre les perles dans 24 'L de 10 mM Tris HCl pH 8.0. Incuber l'aimant pendant 3 min suivi d'une incubation de 2 min sur l'aimant. Transférer 20 L du deuxième produit de nettoyage PCR sur une nouvelle plaque PCR de 96 puits.
      REMARQUE : Il s'agit d'un point d'arrêt sécuritaire et les bibliothèques peuvent être stockées à -20 oC pour un stockage à long terme ou procéder immédiatement à la quantification de la bibliothèque.
  11. Quantitation de bibliothèque
    1. Retirez le mélange maître de quantitation de la bibliothèque et les normes de -20 oC de stockage et laissez l'équilibre à la température ambiante.
    2. Effectuer une dilution 1:5 de toutes les bibliothèques (deuxième produit PCR) à l'aide de 10 mM Tris HCl pH 8.0 suivi d'une dilution sérielle de 1:199, 1:199, et 20:80 en utilisant 10 mM Tris HCl pH 8,0 000 0,05% polysorbate. Les deux dernières dilutions de 1:200,000 et 1:1,000,000 respectivement seront courues en triple.
    3. Ajouter 6 ll de mélange maître à chaque puits d'une plaque optique de puits 96 suivie de 4 ll de dilution ou de norme appropriée. Faites tourner la plaque et chargez-la sur l'instrument qPCR. Utilisez les conditions de cycle suivantes : 1 cycle 95 oC 5 min, 35 cycles 95 oC 30 s (taux de rampe de 4,4 oC/s) et 60 oC 45 s (taux de rampe de 2,2 oC/s).
    4. Une fois la quantification des bibliothèques terminée et les concentrations des bibliothèques déterminées (en faisant la moyenne des deux dilutions testées), normalisez toutes les bibliothèques à 2 nM en utilisant 10 mM Tris HCl pH 8.0. Faites la piscine de la bibliothèque en combinant 10 ll de chaque bibliothèque normalisée en un tube de micro centrifugeuse de 1,5 ml.
  12. Séquençage des bibliothèques
    1. Retirez la cartouche de réactif de séquenceur de -20 oC de stockage et placez-la dans de l'eau déionisée (DI) jusqu'à la ligne de remplissage pendant au moins 1 h. En outre, retirez le kit de réactif de séquenceur de 4 oC et laissez l'équilibre à la température ambiante pendant au moins 1 h. Le nombre maximum de bibliothèques qui peuvent être séquencées sur cette plate-forme de séquençage est de 8 (dont l'une doit être le contrôle positif).
    2. Faire la piscine dénaturée de la bibliothèque d'amplicons (DAL) en combinant 10 l de la piscine de la bibliothèque avec 10 oL de 0,2 N NaOH et incuber pendant 5 min à température ambiante. Après l'incubation de 5 minutes, ajoutez 10 oL de 200 mM Tris HCl pH 7,0, suivis de 970 l de tampon d'hybridation HT1.
    3. Faire le tube de charge final en combinant 300 l de HT1, 25 'L de 20 pM PhiX et 675 'L de la piscine DAL. Vortex et faire tourner le tube de charge. Ajouter le volume entier du tube de charge au puits d'échantillon de la cartouche de réactif de séquenceur et cartouche de charge dans le séquenceur fonctionnant 2 x 151 bp lit avec 2 lectures d'index de x 8.

2. Analyse des données

  1. Séquençage de la gestion et de l'analyse des données
    1. Téléchargez les mesures de séquençage à partir de l'instrument NGS.
    2. Assurez-vous que les données de séquençage se situent dans les plages ci-dessous (spécifiques pour le kit utilisé dans cet exemple). Densité des grappes (densité [K/mm2]) : 945 à 1600 K; % des lectures de filtrage (clusters PF [%]): 'gt;90%; notes de qualité (% t30) : 'gt;85%; Alignement PhiX (aligné %): 1,5 à 6,0%; Taux d'erreur PhiX (taux d'erreur [%]) : 1,0 %; lit le filtre de passage (lit PF [M]): '22 millions.
      REMARQUE : Les exécutions de séquençage ne répondant pas à ces mesures sont sujettes à répétition.
    3. Examinez le pourcentage de lectures attribuées à chaque échantillon (c.-à-d. chaque indice spécifique à l'échantillon). Pour une course typique dans laquelle le pic PhiX-in était de 5% et 8 échantillons ont été séquencés, chaque échantillon devrait idéalement représenter environ 11,9% des lectures. La fourchette acceptable pour chaque échantillon est de 5 à 25 %. Si des échantillons ne correspondent pas à cette plage, répétez la quantitation et le séquençage de la bibliothèque.
  2. Soumission de données de séquence brute séquence à l'algorithme d'analyse
    REMARQUE : La version 4.1.1.7 de ArcherDx Analysis est décrite ici. Dans cet exemple, le logiciel d'analyse est déployé comme une « machine virtuelle » exécuté sur un serveur interne. Une unité centrale de traitement (CPU) et 12 Go de mémoire d'accès aléatoire (RAM) sont nécessaires pour chaque échantillon à analyser simultanément (généralement 8 échantillons sont traités simultanément nécessitant 8 processeur et 96 Go de RAM). Le traitement prend généralement de 3 à 8 h.
    1. Utilisez les paramètres d'analyse par défaut dans le système d'analyse, à l'exception de MIN-AVERAGE-UNIQUE-RNA-START-SITES-PER-GSP2-CONTROLS (ceci est passé de 10 à 20) et de READ-DEPTH-NORMALIZATION (ceci est réglé à 0 pour éviter l'échantillonnage vers le bas).
    2. Pour commencer un travail d'analyse, cliquez sur Effectuer l'analyse dans l'interface utilisateur, soumettre un nom pour le travail, puis sélectionnez les fichiers FASTQ nécessaires (en veillant à ce que les deux lectures [R1 et R2] soient sélectionnées pour chaque échantillon).
    3. Sélectionnez fusion d'ARN pour les types d'analyse d'ARN, Illumina (appariement) pour la plate-forme, et FusionPlex Solid Tumor Panel pour la région cible. Cliquez ensuite sur Soumettre l'analyse.
  3. Interprétation des données d'analyse
    1. Ouvrez l'interface utilisateur du système d'analyse et sélectionnez le travail souhaité. Sélectionnez l'échantillon de contrôle positif. Assurez-vous que toutes les fusions attendues et les isoformes oncogènes ont été détectés et sont répertoriés dans l'onglet Strong Evidence.
      REMARQUE : Si l'une des fusions suivies dans le contrôle positif n'est pas détectée pour une exécution donnée de l'essai, il peut être une indication d'un problème dans cette course, qui nécessite une répétition (à partir du début de l'essai).
    2. Examinez les statistiques de lecture pour chaque échantillon clinique en cours d'exécution en cliquant sur l'onglet Statistiques de lecture. Chaque échantillon doit être représenté par au moins 1 million de fragments au total. Si moins d'un million, re-séquence de la bibliothèque avec des considérations pour la re-quantitation pour s'assurer que la quantitation initiale n'était pas aberrante élevé.
      REMARQUE: Les échantillons de bonne qualité afficheront généralement sur la cible % - 'gt;85%, et les bacs moléculaires d'ARN devraient être 'gt;20,000 et comprennent 'gt;30% des lectures. Toutefois, le non-respect de ces paramètres ne déclenche pas automatiquement la défaillance de l'échantillon.
    3. Inspectez les sites de démarrage uniques moyens par valeur de contrôle GSP2.
      REMARQUE : Cette valeur est une mesure de la complexité de séquençage des amorces à quatre gènes d'entretien ménager. Cette mesure est un déterminant critique de la qualité de l'ARN dans l'échantillon (si le séquençage des gènes qui devraient être exprimés dans l'échantillon est faible, alors la confiance dans la capacité de détecter une fusion génétique exprimée est faible). Le seuil pour cette mesure est de 20. Si un échantillon affiche une valeur inférieure à 20, les résultats de l'échantillon doivent être déclarés non informatifs si aucune fusion de confiance élevée n'est trouvée. L'état de cette mesure peut également être déterminé dans la page récapitulative de l'exécution (le statut sera répertorié comme Fusion QC: Pass ou Fusion QC: Nombre d'ARN unique GSP2 Control Start Sites Low selon que la valeur est supérieure ou inférieure à 20). Une fusion de confiance élevée dans un échantillon qui n'a pas réussi cette mesure QC peut encore être signalée si elle est jugée réelle (voir ci-dessous). En général, les scores plus élevés de QC utilisant cette mesure sont corrélés avec des scores plus bas de PreSeq Ct, comme prévu (figure 2).
  4. Interprétation d'appel de fusion
    1. Examiner attentivement chaque fusion appelée sous l'onglet Strong Evidence (la majorité des fusions de preuves solides appelées par le système sont artifactual). Aussi scanner le bac de fusion de preuves faibles, bien que la présence d'une fusion non-artifactual dans ce bac est un événement extrêmement rare. Pour évaluer la validité d'une fusion, notez d'abord les mesures des sites de lecture (en /%) et des sites de démarrage.
      REMARQUE : En général, la confiance dans une fusion appelée augmente plus ces mesures sont élevées. Les fusions qui sont soutenues par moins de 5 sites de démarrage et par moins de 10% des lectures de l'amorce de soutien doivent être considérées comme hautement suspectes comme étant artifactual.
    2. Notez les icônes affichées dans la colonne Filtres.
      REMARQUE : Plusieurs de ces icônes alertent l'utilisateur d'une source potentielle d'un appel artifactual. Parmi ceux-ci (et se trouvent principalement dans le bac à preuves faibles des fusions appelées) il y a des cas où les partenaires sont des paralogs connus ou présentent des similitudes les uns avec les autres dans l'ordre (indiquant probablement un mauvais amorçage ou un alignement erroné). Une autre source commune d'appels de fusion artifactual se produit lorsque les lectures soutenant la fusion contiennent un taux d'erreur élevé qui est indicatif d'une mauvaise cartographie du génome de référence, et cela est associé à une icône distincte. Les événements de lecture transcriptionnels sont identifiés via une autre icône. Ceux-ci sont communs et sont généralement ignorés. Plusieurs autres icônes sont également utilisées dans l'interface utilisateur, mais une description complète de tous est au-delà de la portée de cet article. Les artefacts courants qui peuvent généralement être ignorés sans enquête plus approfondie comprennent : ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, NOTCH1-RET, RELA-RET, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8, fcGR2C-MAST.
    3. Visualisez les lectures de support pour chaque fusion potentielle en cliquant sur le lien Visualize dans l'interface utilisateur, qui amène l'utilisateur à une vue JBrowse basée sur le Web des accumulations de lectures individuelles de fusion-support. Confirmer que les lectures sont généralement exemptes d'inadéquation (bien qu'il y ait un certain bruit à prévoir), qu'une proportion importante (idéalement des bases de 30) des lectures s'alignent sur le partenaire de fusion, et que les séquences immédiatement adjacentes au point d'arrêt entre les gènes et les sites de fixation d'amorce sont exempts d'insertions ou de suppressions. Confirmer que la séquence alignée inclut la partie 3' des séquences de liaison d'apprêt pour les amorces qui prennent en charge les lectures de fusion (si les parties de 3' ne sont pas incluses, il peut être une indication de mauvaise amorçage).
    4. Si des séquences de codage des deux gènes sont impliquées dans la fusion, assurez-vous que le partenaire de 3' reste dans l'image. Cliquez sur le lien de traduction dans l'interface (qui donnera un statut vrai ou faux pour chaque combinaison de séquence de référence) et confirmera aussi manuellement que la fusion est en cadre grâce à l'inspection des points d'arrêt appelés dans un navigateur du génome. Les points d'arrêt appelés peuvent être déterminés en planant la souris au-dessus des points rouges dans le schéma de fusion.
      REMARQUE : Étant donné que la plupart (mais pas tous) les points d'arrêt génomiques pour les fusions légitimes se produisent dans les régions introniques et entraînent l'épissage des exons entiers, les fusions dans lesquelles les limites d'exon constituent les points d'arrêt pour les deux partenaires sont généralement considérées avec un degré plus élevé de confiance. Cependant, étant donné qu'il existe de nombreux exemples publiés de points d'arrêt mi-exoniques dans les fusions, cela ne devrait pas être utilisé comme critères absolus dans l'interprétation d'une fusion.
    5. Pour chaque fusion, assurez-vous manuellement que les séquences adjacentes au point d'arrêt ne sont pas homologues des bases contigus attendues pour chaque partenaire. Inspectez tous les exons contigus possibles dans un navigateur génomique.
      REMARQUE : Une source commune de fusion artifactual est le désalignement ou le mauvais amorçage dû à l'homologie entre deux partenaires de gène, et ceci n'est pas toujours appelé par le système par l'intermédiaire des icônes décrites ci-dessus.

Résultats

La figure 3, la figure 4 et la figure 5 sont des captures d'écran de l'interface utilisateur de l'analyse démontrant les résultats d'un échantillon d'adénocarcinome pulmonaire. Dans la figure 3, le résumé de l'échantillon est indiqué (en haut) qui énumère les fusions de preuves solides appelées, ainsi que le statut QC (encerclé en rouge). La fusion ADCK4-NUMBL (dont 3 isoformes son...

Discussion

L'enrichissement cible et la préparation de la bibliothèque à base de multiplex À base de PCR, suivis d'un séquençage de nouvelle génération, sont bien adaptés à l'évaluation de la fusion des gènes multiplexés dans les échantillons cliniques de tumeurs. En mettant l'accent sur l'apport d'ARN plutôt que sur l'ADN génomique, la nécessité de séquencer des introns grands et répétitifs est évitée. De plus, puisque cette approche amplifie les fusions génétiques indépendamment de l'identité du partena...

Déclarations de divulgation

D.L.A. a reçu des honoraires de consultation de Bayer Oncology, Genentech, AbbVie et Bristol Myers Squibb. K.D.D a reçu un voyage sponsorisé de ArcherDx.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Molecular Pathology Shared Resource de l'Université du Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) et par le Colorado Center for Personalized Medicine.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mM Tris HCl pH 8.0IDT11-05-01-13Used for TNA dilution
1M Tris pH 7.0Thermo FisherAM9850GUsed in library pooling
25 mL Reagent Reservoir with dividerUSA Scientific9173-2000For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes
96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-naturalUSA Scientific1402-9700Plate used for thermocycler steps
Agencourt AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881Used in purification after several assay steps
Agencourt Formapure KitBeckman CoulterA33343Used in TNA extraction
Archer FusionPlex Solid Tumor kitArcherDXAB0005This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)
Cold block, 96-wellLight LabsA7079Used for keeping samples chilled at various steps
EthanolDecon LabsDSP-MD.43Used for bead washes
Library Quantification for Illumina Internal Control StandardKapa BiosystemsKK4906Used for library quantitation
Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mixKapa BiosystemsKK4973Used for library quantitation
Library Quantification StandardsKapa BiosystemsKK4903Used for library quantitation
Magnet Plate, 96-well (N38 grade)AlpaquaA32782Used in bead purificiation steps
MBC Adapters Set BArcherDXAK0016-48Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing
Micro CentrifugeUSA Scientific2641-0016Used for spinning down PCR tubes
MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well PlateThermo-Fisher4483485Used for Pre-Seq QClibrary quantitation
Microamp Optical Film Compression PadApplied Biosystems4312639Used for library quantitation
Mini Plate SpinnerLabnetMPS-1000Used for collecing liquid at bottom of plate wells
MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)IlluminaMS-102-3003Contains components necessary for a MiSeq sequencing run
MiSeqDx SystemIlluminaNGS Sequencing Instrument
Model 9700 ThermocyclerApplied BiosystemsUsed for several steps during assay
nuclease free waterAmbion9938Used as general diluent
Optical ABI 96-well PCR plate coversThermo-Fisher4311971Used for Pre-Seq QClibrary quantitation
PCR Workstation Model 600Air Clean SystemsBZ10119636Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box'
Proteinase KQiagen1019499Used in TNA extraction
QuantStudio 5Applied BiosystemsLSA28139qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation
Qubit RNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32855Use for determing RNA concentration in TNA samples
RNase AwayFisher12-402-178Used for general RNase decontamination of work areas
Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2SeraCare0710-0129Used as the assay positive control
Sodium HydroxideFisherBP359-212Used in clean-up steps and for sequencing setup
SYBR Green SupermixBio Rad172-5120Component of PreSeq QC Assay
TempAssure PCR 8-tube StripsUSA Scientific1402-2700Used for reagent and sample mixing etc.
Template RT PCR filmUSA Scientific2921-7800Used for covering 96-well plates
U-Bottom 96-well MicroplateLSPMP8117-RUsed during bead purification

Références

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