JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье подробно использование якорь мультиплекс полимеразы цепи реакции на основе библиотеки подготовки комплекта следуют следующего поколения секвенирования для оценки онкогенных синтезов генов в клинических твердых образцов опухоли. Описаны как шаги по анализу влажной скамейки, так и для анализа данных.

Аннотация

Слияния генов часто способствуют онкогенному фенотипу многих различных видов рака. Кроме того, наличие определенных сплавов в образцах больных раком часто непосредственно влияет на диагностику, прогноз и/или выбор терапии. В результате, точное обнаружение слияний генов стало важнейшим компонентом клинического управления для многих типов заболеваний. До недавнего времени клиническое обнаружение синтеза генов осуществлялось преимущественно за счет использования одногенных анализов. Однако постоянно растущий список генных слияний с клиническим значением создал необходимость одновременной оценки состояния синтеза нескольких генов. Следующее поколение секвенирования (NGS) на основе тестирования удовлетворяет этот спрос за счет способности последовательности нуклеиновой кислоты в массово параллельной моды. Несколько NGS-подходов, использующих различные стратегии для обогащения генов, теперь доступны для использования в клинической молекулярной диагностике, каждый из которых имеет свои сильные и слабые стороны. В этой статье описывается использование якорного мультиплекса ПЦР (AMP) на основе целевого обогащения и подготовки библиотеки следуют NGS для оценки синтеза генов в клинических твердых образцов опухоли. AMP является уникальным среди ампрона основе обогащения подходов в том, что он определяет слияния генов, независимо от личности партнера слияния. Подробно здесь представлены как шаги по анализу влажной скамейки, так и для анализа данных, которые обеспечивают точное обнаружение синтеза генов из клинических образцов.

Введение

Слияние двух или более генов в одну транскрипционную сущность может произойти в результате крупномасштабных хромосомных вариаций, включая удаления, дублирование, вставки, инверсии и транслокации. Благодаря измененному транскрипционному контролю и/или измененным функциональным свойствам выраженного генногопродукта эти гены синтеза могут придать онкологическим свойствам раковые клетки 1. Во многих случаях, синтез генов, как известно, выступать в качестве основных онкогенных драйверов путем непосредственной активации клеточной пролиферации и путей выживания.

Клиническая актуальность синтезов генов для онкологических больных впервые стала очевидной с открытием филадельфийской хромосомы и соответствующего гена синтеза BCR-ABL1 при хроническом миелоидном лейкозе (ХМЛ)2. Небольшой ингибитор молекулы imatinib мезилат был разработан специально для целевой этот ген синтеза и продемонстрировали замечательную эффективность в BCR-ABL1-положительныхпациентов CML3. Терапевтическая таргетинг онкогенных синтезов генов также был успешным в твердых опухолей, с ингибированием ALK и ROS1 синтеза генов в немелкоклеточного рака легких, выступающей в качестве основных примеров4,5. Недавно ингибитор NTRK larotrectinib был одобрен FDA для NTRK1/2/3 синтеза положительных твердых опухолей, независимо от болезни сайта6. Помимо выбора терапии, обнаружение синтеза генов также играет роль в диагностике и прогнозе заболевания. Это особенно распространено в различных саркома и гематологические злокачественные подтипы, которые диагностически определяется наличием конкретных слияний и / или для которых наличие синтеза непосредственно информирует прогноз7,8 , 9 До 9 , 10 Лет , 11. Это лишь некоторые из примеров клинического применения обнаружения синтеза генов для онкологических больных.

Из-за важной роли в принятии клинических решений, точное обнаружение синтеза генов из клинических образцов имеет жизненно важное значение. Многочисленные методы были применены в клинических лабораториях для синтеза или хромосомных анализ овранговых реаний, включая: цитогенетические методы, обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (RT-PCR), флуоресценция на месте гибридизации (FISH), иммуногистохимии (IHC), и 5'/3'анализ дисбаланса выражения (среди прочих)12,13,14,15. В настоящее время быстро расширяющийся список действенных слияний генов при раке привел к необходимости одновременного оценки состояния синтеза нескольких генов. Следовательно, некоторые традиционные методы, которые могут задать запрос только один или несколько генов в то время, становятся неэффективными подходами, особенно если учесть, что клинические образцы опухоли часто очень конечны и не поддаются быть разделены между несколькими анализами. Последовательное ирование нового поколения (NGS), однако, является аналитической платформой, которая хорошо подходит для тестирования нескольких генов, и NGS-анализы стали распространены в клинических молекулярно-диагностических лабораториях.

В настоящее время используемые NGS анализы для слияния / перестановки обнаружения варьируются в отношении входной материал используется, химии, используемые для подготовки библиотеки и целевого обогащения, и количество генов, запрошенных в рамках расследования. NGS анализы могут быть основаны на РНК или ДНК (или оба) извлечены из образца. Хотя анализ на основе РНК препятствует тенденция клинических образцов содержать сильно деградировали РНК, он обходит необходимость последовательности больших и часто повторяющихся интронов, которые являются целями ДНК-тестирования синтеза, но оказались трудными для NGS анализ данных16. Стратегии целевого обогащения для анализов NGS на основе РНК можно в значительной степени разделить на гибридные подходы захвата или ампромнонов. Хотя обе стратегии были успешно использованы для обнаружения синтеза, каждая из них содержит преимущества по сравнению с другими17,18. Гибридные анализы захвата обычно приводят к более сложным библиотекам и уменьшенному аллелинческому отсеву, в то время как анализы на основе ампииконов обычно требуют более низкого ввода и приводят к меньшему секвенированию19. Однако, возможно, основным ограничением традиционного обогащения на основе ампииконов является потребность в грунтовки для всех известных партнеров по слиянию. Это проблематично, так как многие клинически важные гены, как известно, сливается с десятками различных партнеров, и даже если грунтовка дизайн позволил для обнаружения всех известных партнеров, новые события синтеза останется незамеченным. Недавно описанный метод называется якорь мультиплекс PCR (или AMP для краткости) адреса этого ограничения20. В AMP ,полуфункциональный" адаптер NGS привязываются к фрагментам кДНК, полученным из входной РНК. Целевое обогащение достигается за счет усиления между генными грунтовками и грунтовкой для адаптера. В результате, все слияния с генами, представляющими интерес, даже если речь идет о новом партнере по слиянию, должны быть обнаружены (см. рисунок1). В этой статье описывается использование комплекта АрчерDx FusionPlex Solid Tumor, ngS-аналитического комитета, который использует AMP для целевого обогащения и подготовки библиотеки, для обнаружения онкогенных синтезов генов в твердых образцах опухолей (см. Дополнительную таблицу 1 для полный список генов). Протокол с мокрой скамейкой и шаги по анализу данных были тщательно проверены в сертифицированной лаборатории по улучшению клинической лаборатории (CLIA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка и секвенирование библиотеки

  1. Общие соображения ассеимного ассеиона и предатлеть шагов
    1. Ассаи работает, как правило, состоят из семи клинических образцов и один положительный контроль (хотя количество образцов на библиотеку подготовки перспективе могут быть скорректированы по мере необходимости). Используйте положительный контроль, который содержит по крайней мере несколько синтезов генов (что цель исследования), которые были подтверждены производителем и / или были подтверждены ортогоналметодологии. Нешаблонный контроль (NTC) должен быть включен в качестве дополнительного образца в каждом запуске анализа, но осуществляется только через второй синтез кДНя и предварительное секвенирование контроля качества (Pre-Seq КК; для обеспечения отсутствия синтеза кДНК). Используйте образец разбавителя (10 мМ Tris HCl pH 8.0) для NTC.
    2. Выполните полную нуклеиновой кислоты (ТНА) экстракции формилина-фиксированной парафин-встроенных (FFPE) ткани.
    3. Количественное измерение компонента РНК TNA с помощью флюорометрического асссе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвращение деградации РНК в образцах путем ограничения циклов замораживания оттепели, сохраняя оттаять нуклеиновой кислоты при низкой температуре (охлажденный блок, лед, или альтернатива), и предотвращение загрязнения RNase (ношение перчаток, с использованием распылителя RNase спрей).
  2. Случайная грунтовка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимый вход для ассея составляет 200 нг РНК (на основе флюорометрической количественной оценки TNA). Более низкие входы могут быть использованы, если 200 нг не может быть достигнуто. Если выборка не удается после секвенирования КК, повторение с более высоким вхожском может привести к приемлемым кон-метрики КК.
    1. Разбавить TNA в 10 мм Tris HCl pH 8.0 для достижения желаемой концентрации РНК. Для каждого образца, передача 20 qL разбавления в случайных грунтовки реагентов полосы труб (помещаются в предварительно охлажденный алюминиевый блок) и перемешать путем пипетки вверх и вниз 6-8 раз. Кратко спина вниз и передать весь объем 96 хорошо ПЦР пластины и печать с RT пленки.
    2. Вставьте тарелку в блок термоциклора, накройте компрессионной площадкой и закройте крышкой. Инкубировать при 65 градусах по Цельсию в течение 5 мин (нагретая крышка).
    3. Снимите тарелку с термоциклоза и поместите на лед на 2 мин.
  3. Первый синтез пряди кДНК
    1. Перенесите весь объем случайного грунтового продукта в первые прокладки реагента (помещены в предварительно охлажденный алюминиевый блок). Смешайте путем pipetting вверх и вниз 6'8 раз. Кратко спина вниз, передача всего объема на 96 хорошо ПЦР пластины и печать с RT пленки.
    2. Вставьте тарелку в блок термоциклора, накройте компрессионной площадкой и закройте крышкой. Запуск программы термоциклоза: 25 градусов по Цельсию 10 мин, 42 КК 30 мин, 80 c 20 мин, 4 C держать (нагретая крышка).
  4. Второй синтез кДНК
    1. В новом наборе пЦР полосы труб, создать 1:10 разбавления первой нити продукта, добавив 1 злицы первого продукта пряди до 9 Л л нуклеаза свободной воды. Установите разбавления в сторону, которые будут использоваться в предварительном Seq КК асссе.
    2. Добавьте 21 злну безнужной воды к оставшемуся первому продукту пряди. Передача 40 л первой нити продукта и нуклеаза свободной воды на вторую нить реагента полосы трубки (размещенные в предварительно охлажденной алюминиевой блока). Смешайте путем pipetting вверх и вниз 6'8 раз. Спин вниз, передать весь объем 96 хорошо ПЦР пластины и печать с RT пленки.
    3. Вставьте тарелку в блок термоциклора, накройте компрессионной площадкой и закройте крышкой. Запуск программы термоциклоза: 16 градусов по Цельсию 60 мин, 75 кв 20 мин, 4 C держать (нагретая крышка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это приемлемая точка остановки. Пластина может храниться при -20 градусах Цельсия.
  5. До-Сек КК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот контроль качества (КК) анализ используется в первую очередь для проверки синтеза кДНК из NTC. Тем не менее, данные также могут быть информативными в анализе устранения неполадок. Например, если образец имеет хорошее значение Pre-Seq, но плохое значение анализов (см. ниже), то это может быть признаком проблемы в запуске ассе, что требует повторения.
    1. Запустите каждый образец и NTC в дубликате. Кроме того, включите в Pre-Seq КК запустить реакцию NTC, который является nuclease свободной воды (также запустить в дубликат). К каждой применимой скважине из оптической пластины 96 скважин добавьте 5 qL мастер-микса асссея, 1 зл 10x праймера VCP и 4 Зл 1:10 разбавления первого продукта пряди, который был создан в шаге 1.4.1.
    2. Печать пластины с RT пленки, спина вниз, и загрузить в количественный инструмент ПЦР (qPCR). Выполнить программу: предварительный усилитель: 1 цикл 95 C 20 s, усилитель: 35 циклов 95 C 3 s (4.4 C/s рампа скорость) - 60 C 30 s (2.2 C/s скорость пандуса).
    3. Подтвердите отсутствие значения цикла (Ct) как для асссеа NTC, так и для реакции NTC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет Ct наблюдается в проверке NTC он больше не будет осуществляться вперед в ассе. Наблюдение значения Ct в реакции NTC требует повторения предварительного Seq КК анализ. Наблюдение Ct в анализе NTC предполагает, что загрязнение образца в какой-то момент до в анализе, таким образом, требуя, чтобы весь анализ (все образцы) был начат за. Значение Pre-Seq КК Ct для адекватной выборки качества должно быть ниже 30 (более низкие значения Ct коррелируют с большим количеством продукта и, следовательно, более высоким качеством РНК). Значения выше 30 не являются абсолютными показателями отказа, и эти выборки должны быть продолжены в анализе. Однако все данные, полученные из таких выборок, должны быть тщательно изучены, особенно в тех случаях, когда не называется слияние.
  6. Окончание ремонта и очистки биса
    1. Передача 40 qL второго продукта пряди в конечный ремонт реагента полосы трубки (размещенные в предварительно охлажденной алюминиевой блок). Смешайте трубача вверх и вниз 6-8 раз, спина вниз и место в термоциклблок (сохраняя нагретую крышку открытой) и запустить программу термоциклора: 25 градусов по Цельсию 30 мин, 4 C держать.
    2. Снимите очищенные бусы от 4 градусов по Цельсию и дайте уравновесить до комнатной температуры. Составляют достаточно 70% этанола, чтобы прослужить всю подготовку библиотеки. Вортекс бусы задолго до использования и пипетка 100 л в соответствующее количество скважин U-нижней пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого 8 образцов, которые работают, 20 мл 70% этанола будет необходимо.
    3. Добавьте весь объем конечного ремонта продукта к бисеру. Пипетка вверх и вниз 6-8 раз, чтобы смешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем 5-минутный инкубации на магните.
    4. Удалите и отбросьте супернатант и выполнить два 200 ЗЛ 70% этанола с 30-х инкубаций. После окончательной стирки удалите все 70% этанола и дайте воздуху высохнуть в течение 5 мин.
    5. Удалить из магнита и повторно приостановить бисер в 22 зл и 10 мм Tris HCl рН 8.0. Инкубировать от магнита в течение 3 мин с последующим 2-минутной инкубации на магните. Немедленно приступайке к этапу перевязки 1.
  7. Этап лиги 1 и очищение бисовой бытия
    1. Передача 20 Зл от конца ремонта бисовой пластины очистки (заботясь, чтобы не беспокоить гранулы биса) в перевязочный шаг 1 полосы труб (размещенных в предварительно охлажденный алюминиевый блок). Смешайте путем pipetting вверх и вниз 6-8 раз, спина вниз и передать весь объем в 96 хорошо ПЦР пластины.
    2. Вставьте тарелку в блок термоциклора, накройте компрессионной площадкой и закройте крышкой. Запуск программы термоциклоза: 37 градусов по Цельсию 15 мин, 4 c держать (нагретая крышка).
    3. Снимите очищенные бусы от 4 градусов по Цельсию и дайте уравновесить до комнатной температуры. Вортекс бусы задолго до использования и пайпет 50 зл в соответствующее количество скважин U-нижней пластины.
    4. Добавьте весь объем перевязки шаг 1 продукт бисера. Пипетка вверх и вниз 6-8 раз, чтобы смешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем 5-минутный инкубации на магните.
    5. Удалите и отбросьте супернатант и выполнить два 200 ЗЛ 70% этанола с 30-х инкубаций. После окончательной стирки удалите все 70% этанола и дайте воздуху высохнуть в течение 5 мин.
    6. Удалить из магнита и повторно приостановить бисер в 42 зл и 10 мм Tris HCl рН 8.0. Инкубировать от магнита в течение 3 мин с последующим 2-минутной инкубации на магните. Немедленно приступайке к этапу перевязки 2.
  8. Этап лигации 2 и очищение бисовой бытия
    1. Удалите молекулярный штрих-код (MBC) адаптер полосы трубки реагентов из 4 кВ хранения. Правильная нумерование полосы адаптера MBC имеет решающее значение, поскольку на данном этапе добавляются конкретные индексы. Расположите трубки горизонтально с шарнирами на спине и использовать постоянный маркер для обозначения труб 1, 2, 3... слева направо. Также важно записывать конкретные индексы для последовательности (они должны быть введены в лист секвенсоров).
    2. Передача 40 qL от перевязки шаг 1 пластины очистки бисера (заботясь, чтобы не беспокоить бисером гранулы) в MBC адаптер полосы труб (размещенных в предварительно охлажденной алюминиевой блока). Смешайте путем pipetting вверх и вниз 6'8 раз.
    3. Спин вниз и передать весь объем на перевязочный шаг 2 реагента полосы труб (также помещается в предварительно охлажденной алюминиевой блок). Смешайте трубачи вверх и вниз 6-8 раз, спина вниз и место в термоциклблок. С нагретой крышкой побежка программа thermocycler: 22 c 5 min, 4 c держат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная остановка, и образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию.
    4. Снимите шарики очистки перевязки из 4-c хранения и дайте уравновесить до комнатной температуры. Приготовьте 1 мл свежего 5 мМ НаОХ.
    5. Vortex перевязки очистки шарики и добавить 50 зл и добавить 50 зл. Инкубировать на магните 1 мин. После 1-минутной инкубации удалите и отбросьте супернатант. Удалите полоски труб из магнита и повторно приостановить в 50 зл перевязочных очистки буфера путем pipetting вверх и вниз 6-8 раз.
    6. Перенесите весь объем перевязки шага 2 продукта в перевязки очистки бисовые полосы труб. Смешайте образцы путем вихря и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Опять же, смешать образцы путем вихря и инкубировать при комнатной температуре еще 5 мин. После второй 5-минутной инкубации смешайте образцы путем вихря, ненадолго раскрутитесь и инкубируете на магните 1 мин.
    7. Удалите и отбросьте супернатант. Добавьте 200 юаней буфера очистки перевязок и вихря, чтобы повторно приостановить. Выполните быстрый спин и место на магнит в течение 1 мин. Выполните вторую стирку с помощью буфера очистки перевязки снова.
    8. После двух моет с перевязкой очистки буфера выполнять идентичные мыть с помощью ультрачистой воды. После ультрачистой воды мыть повторно приостановить бисера в 20 мЛ 5 мМ NaOH и передачи на 96 хорошо ПЦР пластины. Поместите пластину в блок термоциклора с компрессионной колодкой и запустите программу термоциклоза: 75 градусов по Цельсию 10 мин, 4 кв.с.
    9. Спин вниз пЦР пластины, как только образцы остыли до 4 градусов по Цельсию. Поместите пластину на магнит, по крайней мере 3 мин и немедленно перейти к первому ПЦР.
  9. Первая очистка ПЦР и бисера
    1. Удалите первые прокладки реагента ПЦР из 4-C хранения и поместите в предварительно охлажденный алюминиевый блок. Кроме того, удалите грунтовки GSP1 от -20 градусов по Цельсию и дайте уравновесить до комнатной температуры.
    2. Добавьте 2 Зл из грунтовков GSP1 к каждой скважине первых трубок полоски реагента ПЦР. Перенесите 18 qL продукта очистки перевязки 2 в первые прокладки реагентов ПЦР и смешайте путем трубопроката вверх и вниз в 6-8 раз.
    3. Спин вниз и передачи на 96 хорошо ПЦР пластины. Поместите пластину в блок термоциклора с компрессионной колодкой и запустите программу термоциклов: 95 градусов по Цельсию 3 мин, 15 циклов 95 градусов по Цельсию 30 с и 65 градусов по Цельсию 5 мин (100% скорость рампы), 72 КК 3 мин, 4 c hold (нагретая крышка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная остановка, и образцы могут храниться при 4 градусах Цельсия на ночь или при -20 градусов по Цельсию для длительного хранения.
    4. Снимите очищенные бусы от 4 градусов по Цельсию и дайте уравновесить до комнатной температуры. Вортекс бусы задолго до использования и пипетка 24 л в соответствующее количество скважин U-нижней пластины.
    5. Передача 20 зл и рюмк первого ПЦР на 24 л бусин. Пипетка вверх и вниз 6-8 раз, чтобы смешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем 2-минутный инкубации на магните.
    6. Удалите и отбросьте супернатант и выполнить два 200 ЗЛ 70% этанола с 30-х инкубаций. После окончательной стирки удалите все 70% этанола и дайте воздуху высохнуть в течение 2 мин.
    7. Удалить из магнита и повторно приостановить бисер в 24 зл и 10 мм Tris HCl рН 8.0. Инкубировать от магнита в течение 3 мин с последующим 2-минутной инкубации на магните. Немедленно приступай ко второму ПЦР.
  10. Второе очищение ПЦР и бисера
    1. Удалите второй РЦП реагента полосы труб от 4 КС и поместите в предварительно охлажденный алюминиевый блок. Правильная нумерование второй прокладки ПЦР критически важна, поскольку на данном этапе добавляются конкретные индексы. Расположите трубки горизонтально с шарнирами на спине и использовать постоянный маркер для обозначения труб 1, 2, 3... слева направо. Кроме того, удалите грунтовки GSP2 от -20 градусов по Цельсию и дайте уравновесить до комнатной температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также важно записывать конкретные индексы для последовательности (они должны быть введены в лист секвенсоров).
    2. Добавьте 2 Зл из грунтовки GSP2 к каждой скважине второго прокладки реагента ПЦР. Перенесите 18 qL первого продукта очистки ПЦР на второй прокладки реагентов ПЦР и смешайте путем трубопроката вверх и вниз в 6-8 раз.
    3. Спин вниз и передачи на 96 хорошо ПЦР пластины. Поместите тарелку в блок термоциклора с компрессионной площадкой и запустите программу термоциклов: 95 градусов по Цельсию 3 мин, 18 циклов 95 градусов по Цельсию 30 с и 65 градусов по Цельсию 5 мин (100% скорость рампы), 72 кв 3 мин, 4 c hold (нагретая крышка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная остановка, и образцы могут храниться при 4 градусах Цельсия на ночь или при -20 градусов по Цельсию для длительного хранения.
    4. Снимите очищенные бусы от 4 градусов по Цельсию и дайте уравновесить до комнатной температуры. Вортекс бусы задолго до использования и пипетка 24 л в соответствующее количество скважин U-нижней пластины.
    5. Перенесите 20 зл второго пЦР-продукта в бисер. Пипетка вверх и вниз 6-8 раз, чтобы смешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем 2-минутный инкубации на магните.
    6. Удалите и отбросьте супернатант и выполнить два 200 ЗЛ 70% этанола с 30-х инкубаций. После окончательной стирки удалите все 70% этанола и дайте воздуху высохнуть в течение 2 мин.
    7. Удалить из магнита и повторно приостановить бисер в 24 зл и 10 мм Tris HCl рН 8.0. Инкубировать от магнита в течение 3 мин с последующим 2-минутной инкубации на магните. Передача 20 злицита второго продукта очистки ПЦР на новую пластину ПЦР 96 скважин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная остановка, и библиотеки могут храниться при -20 градусов по Цельсию для долгосрочного хранения или немедленно переходить к количественной оценке библиотеки.
  11. Библиотека количественной оценки
    1. Удалите мастер-микс и стандарты библиотечной квантитии из -20 градусов по Цельсию и дайте уравновесить до комнатной температуры.
    2. Выполните 1:5 разбавления всех библиотек (второй продукт PCR) с использованием 10 мм Tris HCl pH 8.0 с последующим серийным разбавлением 1:199, 1:199 и 20:80 с помощью 10 мМ Tris HCl pH 8.0 0.05% полисорбата. Окончательные два разбавления 1:200,000 и 1:1,000,000 соответственно будут запущены в тройном.
    3. Добавьте 6 qL мастер-микски к каждой скважине из оптической пластины 96 скважин, за которой следует 4 Зл соответствующего разбавления или стандарта. Скрутите тарелку и загрузите ее на инструмент qPCR. Используйте следующие условия езды на велосипеде: 1 цикл 95 градусов по Цельсию 5 мин, 35 циклов 95 градусов по Цельсию 30 с (4,4 градуса по Цельсию/с) и 60 градусов по Цельсию 45 с (2,2 градуса по Цельсию/с скорости рампы).
    4. После завершения количественной оценки библиотеки и определения концентрации библиотеки (через усреднение обоих проверенных разбавлений) нормализуют все библиотеки до 2 нм с помощью 10 mM Tris HCl pH 8.0. Сделайте библиотечный пул, объединив 10 юл каждой нормализованной библиотеки в одну микроцентрифужную трубку мощностью 1,5 мл.
  12. Секвенирование библиотек
    1. Удалите ревагентный картридж секвенсора с -20 градусов по Цельсию и поместите в деионизированную (DI) воду до линии заливки не менее 1 ч. Кроме того, удалить набор реагентов секвенсорота от 4 кВ и позволить уравновесить до комнатной температуры, по крайней мере 1 ч. Максимальное количество библиотек, которые могут быть секвенированы на этой платформе секвенирования, составляет 8 (одна из которых должна быть положительным контролем).
    2. Сделайте бассейн библиотеки денатурированных ампликонов (DAL), объединив 10 зл и пул библиотеки с 10 злитровых 0,2 N NaOH и инкубируя в течение 5 минут при комнатной температуре. После 5-мин инкубации добавить 10 зл 200 мм Tris HCl pH 7.0, а затем 970 л буфера гибридизации HT1.
    3. Сделать окончательную трубку нагрузки, объединив 300 л HT1, 25 л 20 pM PhiX и 675 л пула DAL. Вихрь и спина вниз нагрузки трубки. Добавить весь объем нагрузки трубки в образец хорошо ревагента ревагента секвенсор и загрузки картриджа в секвенсор работает 2 х 151 bp читает с 2 х 8 индекс читает.

2. Анализ данных

  1. Секвенирование обработки и анализа данных
    1. Скачать метрика секвенирования с инструмента NGS.
    2. Убедитесь, что данные секвенирования попадают в нижеприведенные диапазоны (специфический для набора, используемого в данном примере). Плотность кластера (плотность К/мм2х): 945-1600 К; % считывает проходящий фильтр (кластеры PF (%): оценки качества (% 30 фунтов): Выравнивание PhiX (выровнено%%): 1,5–6,0%; Частота ошибок PhiX (коэффициент ошибок (%): lt;1.0%; читает проходной фильтр (читает ПФ «М»): «Gt;22 миллиона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование выполняет не соответствует этим показателям могут повторяться.
    3. Просмотрите % считывателей, приписываемых каждому образцу (т.е. каждый конкретный индекс выборки). Для типичного запуска, в котором PhiX шип-в был 5% и 8 образцов были секвенированы, каждый образец должен в идеале приходится примерно 11,9% считывания. Приемлемый диапазон для каждой выборки составляет 5–25%. Если какие-либо образцы не вписываются в этот диапазон, повторите количественную оценку библиотеки и секвенирование.
  2. Представление необработанных данных последовательности в алгоритм анализа
    ПРИМЕЧАНИЕ: Версия 4.1.1.7 анализа ArcherDx описана здесь. В этом примере программное обеспечение для анализа развертывается как «виртуальная машина», работана на внутреннем сервере. Для каждого образца для одновременного анализа требуется одно центральное блок обработки (CPU) и 12 ГБ случайной памяти доступа (RAM). Обработка обычно занимает 3–8 ч.
    1. Используйте настройки анализа по умолчанию в системе анализа, за исключением MIN-AVERAGE-УНИКЕ-РНК-СТАРТ-СИТС-ПЕР-ВСП2-КОНТРОЛС (это изменено с 10 до 20) и READ-DEPTH-NORMALIZATION (это установлено на 0, чтобы предотвратить вниз выборки).
    2. Чтобы начать работу по анализу, нажмите на Perform Analysis в пользовательском интерфейсе, отправьте имя для задания, а затем выберите необходимые файлы FAST (гарантируя, что оба читает «R1 и R2» будут выбраны для каждого образца).
    3. Выберите RNA Fusion для типов анализа РНК, Illumina (в паре) для платформы, и FusionPlex твердая группа опухолей для целевого региона. Затем нажмите на Submit Анализ.
  3. Интерпретация данных анализа
    1. Откройте пользовательский интерфейс системы анализа и выберите нужное задание. Выберите положительный контрольный образец. Убедитесь, что все ожидаемые синтезы и онкогенные изоформы были обнаружены и перечислены во вкладке Сильные доказательства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если какой-либо из гусеничных слияний в положительном контроле не обнаружен для заданного запуска асссе, это может быть признаком проблемы в этом запуске, что требует повторения (с начала проверки).
    2. Изучите статистику чтения для каждого клинического образца в перспективе, нажав на вкладку «Статистика чтения». Каждый образец должен быть представлен не менее чем 1 миллионом фрагментов. Если меньше 1 миллиона, повторно последовательность библиотеки с соображениями для повторной количественной оценки для обеспечения первоначальной количественной не был аберрантно высоким.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошее качество образцов, как правило, отображаются на целевой % йgt;85%, и РНК Молекулярная бинов должно быть йgt;20000 и составляют йgt;30% от читает. Однако несоблюдение этих показателей не приводит к автоматическому сбою образца.
    3. Проинспектировать средние уникальные стартовые сайты на значение управления GSP2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это значение является мерой последовательности сложности от грунтовки до четырех генов домашнего хозяйства. Эта метрика является критическим фактором качества РНК в образце (если секвенирование генов, как ожидается, будет выражено в образце, является плохим, то уверенность в способности обнаружить выраженный синтез генов является низкой). Отсечение для этой метрики составляет 20. Если какой-либо образец отображает значение менее 20, то результаты для выборки должны быть сообщены как неинформативные, если не найдено слияние с высоким уровнем достоверности. Состояние этой метрики также может быть определено на сводной странице запуска (статус будет указан как Fusion КК: Pass или Fusion КК: Количество уникальных САЙТОВ запуска УПРАВЛЕНИЯ РНК GSP2 Низкий в зависимости от того, значение больше или меньше, чем 20). Высокое слияние доверия в выборке, которая не прошла эту метрику КК, все еще может быть сообщено, если она определена как реальная (см. ниже). Как правило, более высокие баллы КК с помощью этой метрики коррелируют с более низкими оценками PreSeq Ct, как и ожидалось(рисунок 2).
  4. Интерпретация вызова Fusion
    1. Тщательно изучить каждый называется слияние под вкладкой Сильные доказательства (большинство сильных доказательств слияний называется системой являются артефактными). Кроме того, сканировать слабые доказательства слияния бен, хотя наличие не-артефактного слияния в этом бункере является чрезвычайно редким событием. Чтобы оценить достоверность слияния, сначала обратите внимание на метрики чтения (я/%), и стартовые сайты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, уверенность в так называемом слиянии увеличивается выше эти метрики. Сплавы, которые поддерживаются менее чем 5 стартовыми площадками и менее чем 10% считывающихся сотнюров из опорной грунтовки, следует рассматривать как весьма подозрительные как артефактные.
    2. Обратите внимание на значки, отображаемые в столбце Фильтров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые из этих значков предупреждают пользователя о потенциальном источнике артефактного вызова. Частые среди них (и в первую очередь найти в слабых доказательств бен называется слияний) являются случаи, когда партнеры известны паралоги или показать сходство друг с другом в последовательности (с указанием вероятно неправильной грунтовки или ошибочное выравнивание). Другой распространенный источник артефактных вызовов синтеза возникает, когда считывания, поддерживающие слияние, содержат высокую частоту ошибок, что свидетельствует о плохом отображении эталонного генома, и это связано с отчетливым значком. Транскрипционные события чтения идентифицируются через другой значок. Они являются общими и, как правило, игнорируются. Несколько других значков также используются в пользовательском интерфейсе, но полное описание всего выходит за рамки этой статьи. Общие артефакты, которые обычно могут быть проигнорированы без дальнейшего расследования включают в себя: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, NOTCH1-RET, RELA-RET, NTRK3-ALK, BRAF-ADAM и FCGR2C-MAST.
    3. Визуализируйте поддержку читает для каждого потенциального слияния, нажав на ссылку Visualize в пользовательском интерфейсе, который принимает пользователя к веб-jBrowse зрения pileups отдельных термоядерного поддержки читает. Подтвердите, что считывания, как правило, свободны от несоответствия (хотя некоторый шум следует ожидать), что значительная часть (в идеале ,gt;30 баз) читает выровнять с партнером слияния, и что последовательности непосредственно рядом с точкой разрыва между генами а сайты связывания грунтовки свободны от вставок или удаляний. Подтвердите, что выровненная последовательность включает в себя 3' часть связывающих последовательностей праймеров, поддерживающих считывание синтеза (если 3' части не включены, это может быть признаком неправильного грунтинга).
    4. Если последовательности кодирования обоих генов участвуют в слиянии, убедитесь, что 3 ' партнер остается в кадре. Нажмите на ссылку Translation в интерфейсе (что даст истинный или ложный статус для каждой комбинации эталонной последовательности), а также вручную подтвердите, что слияние находится в кадре путем проверки так называемых точек разрыва в браузер генома. Называемые точки разрыва могут быть определены путем зависания мыши над красными точками в схеме синтеза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку большинство (но не все) геномные точки разрыва для законных слияний происходят в интронных регионах и приводят к сращиванию целых экзонов, слияния, в которых границы экзона составляют точки разрыва для обоих партнеров, как правило, рассматриваются с большей степенью доверия. Однако, поскольку существует много опубликованных примеров средних экзонических брейк-пойнтов в синтезах, это не должно использоваться в качестве абсолютных критериев в интерпретации синтеза.
    5. Для каждого синтеза вручную убедитесь, что последовательности, прилегающие к точке разрыва, не являются гомологичными для следующего ожидаемого смежных баз для каждого партнера. Осмотрите все возможные смежные экзоны в браузере генома.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общим источником артефактного синтеза является несогласованность или неправильное причитание из-за гомологии между двумя генными партнерами, и это не всегда называется системой через описанные выше значки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Показано на рисунке 3, Рисунок 4 и Рисунок 5 являются скриншоты из анализа пользовательского интерфейса, демонстрирующего результаты образца аденокарциномы легких. На рисунке 3приведена сводка выборки (вверху), в которых п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Якорный мультиплекс ПЦР основе целевого обогащения и подготовки библиотеки следуют следующего поколения секвенирования хорошо подходит для мультиплексной оценки синтеза генов в клинических образцов опухоли. Сосредоточившись на входе РНК, а не на геномной ДНК, избегается необходимо?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

D.L.A. получила консультационные сборы от Bayer Oncology, Genentech, AbbVie и Bristol Myers Squibb. K.D.D получил спонсорские поездки от ArcherDx.

Благодарности

Эта работа была поддержана молекулярной патологии Общий ресурс Университета Колорадо (Национальный институт рака центр поддержки Грант No. P30-CA046934) и Колорадо Центр персонализированной медицины.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mM Tris HCl pH 8.0IDT11-05-01-13Used for TNA dilution
1M Tris pH 7.0Thermo FisherAM9850GUsed in library pooling
25 mL Reagent Reservoir with dividerUSA Scientific9173-2000For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes
96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-naturalUSA Scientific1402-9700Plate used for thermocycler steps
Agencourt AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881Used in purification after several assay steps
Agencourt Formapure KitBeckman CoulterA33343Used in TNA extraction
Archer FusionPlex Solid Tumor kitArcherDXAB0005This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)
Cold block, 96-wellLight LabsA7079Used for keeping samples chilled at various steps
EthanolDecon LabsDSP-MD.43Used for bead washes
Library Quantification for Illumina Internal Control StandardKapa BiosystemsKK4906Used for library quantitation
Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mixKapa BiosystemsKK4973Used for library quantitation
Library Quantification StandardsKapa BiosystemsKK4903Used for library quantitation
Magnet Plate, 96-well (N38 grade)AlpaquaA32782Used in bead purificiation steps
MBC Adapters Set BArcherDXAK0016-48Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing
Micro CentrifugeUSA Scientific2641-0016Used for spinning down PCR tubes
MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well PlateThermo-Fisher4483485Used for Pre-Seq QClibrary quantitation
Microamp Optical Film Compression PadApplied Biosystems4312639Used for library quantitation
Mini Plate SpinnerLabnetMPS-1000Used for collecing liquid at bottom of plate wells
MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)IlluminaMS-102-3003Contains components necessary for a MiSeq sequencing run
MiSeqDx SystemIlluminaNGS Sequencing Instrument
Model 9700 ThermocyclerApplied BiosystemsUsed for several steps during assay
nuclease free waterAmbion9938Used as general diluent
Optical ABI 96-well PCR plate coversThermo-Fisher4311971Used for Pre-Seq QClibrary quantitation
PCR Workstation Model 600Air Clean SystemsBZ10119636Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box'
Proteinase KQiagen1019499Used in TNA extraction
QuantStudio 5Applied BiosystemsLSA28139qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation
Qubit RNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32855Use for determing RNA concentration in TNA samples
RNase AwayFisher12-402-178Used for general RNase decontamination of work areas
Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2SeraCare0710-0129Used as the assay positive control
Sodium HydroxideFisherBP359-212Used in clean-up steps and for sequencing setup
SYBR Green SupermixBio Rad172-5120Component of PreSeq QC Assay
TempAssure PCR 8-tube StripsUSA Scientific1402-2700Used for reagent and sample mixing etc.
Template RT PCR filmUSA Scientific2921-7800Used for covering 96-well plates
U-Bottom 96-well MicroplateLSPMP8117-RUsed during bead purification

Ссылки

  1. Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
  2. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
  3. Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
  4. Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
  5. Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
  6. Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
  7. Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
  8. de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
  9. Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
  10. Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  11. Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
  12. Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
  13. Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
  14. Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
  15. Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
  16. Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
  17. Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
  18. Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
  19. Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
  20. Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
  21. Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
  22. Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510(2017).
  23. Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
  24. Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
  25. Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

149

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены