Évaluation des dommages oxydatifs dans les cellules de surface oculaires de la souris primaire/cellules souches en réponse aux dommages causés par les ultraviolets-C (UV-C)

Résumé

Ce protocole démontre la détection simultanée d’espèces réactives d’oxygène (ROS), de cellules vivantes et de cellules mortes dans les cultures primaires vivantes à partir de cellules de surface oculaires de souris. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, et Hoechst coloration sont utilisés pour évaluer le ROS, les cellules mortes, et les cellules vivantes, respectivement, suivie par l’imagerie et l’analyse.

Résumé

La surface oculaire est soumise à l’usure régulière due à divers facteurs environnementaux. L’exposition aux rayons UV-C constitue un danger pour la santé au travail. Ici, nous démontrons l’exposition des cellules souches primaires de la surface oculaire de la souris au rayonnement UV-C. La formation d’espèces réactives d’oxygène (ROS) est la lecture de l’étendue du stress/dommages oxydatifs. Dans un contexte in vitro expérimental, il est également essentiel d’évaluer le pourcentage de cellules mortes générées par le stress oxydatif. Dans cet article, nous démontrerons la coloration de 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) des cellules souches oculaires primaires exposées à la souris et leur quantification basée sur les images fluorescentes de la coloration DCFDA. La coloration DCFDA correspond directement à la génération ROS. Nous démontrons également la quantification des cellules mortes et vivantes en taclant simultanément avec l’iodure de propidium (PI) et Hoechst 3332 respectivement et le pourcentage de cellules positives de DCFDA (ROS positif) et de PI.

Introduction

La surface oculaire (OS) est une unité fonctionnelle principalement composée de la couche externe et épithélia glandulaire de la cornée, glande lachrymal, glande mécidome, conjonctive, partie des marges du couvercle des yeux et innervations qui transduisent les signaux¹. La couche cornéenne transparente en forme de dôme concentre la lumière sur la rétine. Ce tissu avascular est composé de composants cellulaires tels que les cellules épithéliales, les kératocytes, et les cellules endothéliales et les composants acellulaires tels que le collagène et les glycosaminoglycanes². La région est drainée par des larmes qui fournissent également la plupart des nutriments. La position anatomique du système d’exploitation l’oblige à être en contact direct avec l’environnement extérieur, l’exposant souvent à divers composants durs tels que la lumière vive, les microbes, les particules de poussière et les produits chimiques. Ce facteur prédispose le système d’exploitation aux blessures physiques et le rend sujet à diverses maladies.

Le stress oxydatif est causé par le déséquilibre entre la production d’espèces réactives d’oxygène (ROS) et les mécanismes de défense antioxydants endogènes³. Les ROS sont classés en molécules réactives et radicaux libres, qui sont tous deux dérivés de l’oxygène moléculaire (O₂) par la phosphorylation oxydative mitochondriale⁴. Le premier groupe est composé d’espèces non radicales telles que le peroxyde d’hydrogène (H₂O₂), l’oxygène singlet (¹O₂) et le second comprend des espèces telles que les anions de superoxyde (O₂^-), et les radicaux hydroxyles^(OH),entre autres. Ces molécules sont des sous-produits des processus cellulaires normaux et leurs rôles ont été impliqués dans des fonctions physiologiques importantes telles que la transduction du signal, l’expression des gènes et la défense de l’hôte⁵. Une production améliorée de ROS est connue pour être générée en réponse à des facteurs tels que l’invasion d’agents pathogènes, les xénobiotiques et l’exposition au rayonnement ultra-violet (UV)⁴. Cette surproduction de ROS entraîne un stress oxydatif qui entraîne des dommages à des molécules telles que les acides nucléiques, les protéines et les lipides⁶.

La lumière naturelle du soleil, la source la plus prédominante de rayonnement UV, est composée d’UV-A (400 à 320 nm), d’UV-B (320 à 290 nm) et d’UV-C (290 à 200 nm)⁷. Une corrélation inverse entre la longueur d’onde et les énergies spectrales a été rapportée. Bien que les rayonnements UV-C naturels soient absorbés par l’atmosphère, les sources artificielles telles que les lampes au mercure et les instruments de soudage émettent et constituent donc un danger professionnel. Les symptômes de l’exposition aux yeux comprennent la photokératite et la photokeratoconjonctivite⁸. La production de ROS est l’un des principaux mécanismes d’infliger des dommages cellulaires induits par les UV⁹. Dans la présente étude, nous démontrons la détection de ROS à l’aide de la méthode de coloration 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein (DCFDA) dans les cellules de surface oculaires primaires de souris/cellules souches exposées aux UV-C. La fluorescence verte a été capturée à l’aide d’une microscopie fluorescente. Les cellules ont été contre-tachées avec deux colorants, Hoechst 33342 et l’iodure rouge de propidium, pour tacher les cellules vivantes et mortes, respectivement.

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Protocole

L’expérience a été réalisée sur des cellules oculaires primaires/cellules souches dérivées de l’œil de souris albinos suisse. L’utilisation d’animaux pour la récolte des yeux pour cette expérience a été approuvée par le Comité institutionnel d’éthique animale, Yenepoya (Considéré comme l’Université) (numéro d’approbation de l’AIEC, 6a/19.10.2016).

1. Préparation des réactifs

REMARQUE : La dérivation des cellules primaires/cellules souches de la surface oculaire de la souris dépasse le cadre de ce protocole. Par conséquent, nous démontrons les doses d’exposition UV-C, la préparation de réactif pour évaluer ROS, les cellules vivantes et mortes et leur quantification. Veuillez consulter le tableau 1 pour les volumes respectifs des réactifs (10 % de sérum bovin fœtal, DCFDA, Hoechst et propidium iodide solutions à ajouter pour obtenir la solution finale de coloration).

1. Préparer une solution de stock de 10 mM DCFDA en dissolvant 25 mg de poudre DCFDA dans 5,13 mL de DMSO. Aliquot 250 l chacun dans des tubes de 1,5 ml de couleur ambre et stocker à -20 oC.
2. Préparer une solution de stock de 10 mg/mL (16,23 mM solution) Hoechst 33342 en dissolvant le contenu entier du flacon de 25 mg dans 2,5 mL d’eau déionisée. Faire des aliquots de 100 l dans des tubes microcentrifugeurs de couleur ambre et les conserver à 2-6 oC pendant jusqu’à 6 mois. Pour un stockage à plus long terme, entreposer à -20 oC.
3. Préparer une solution de bouillon de 1 mg/mL d’iodure de propidium dans de l’eau déionisée, aliquot 1 ml chacun dans des tubes de 1,5 mL de couleur ambre, et stocker à 4 oC.

2. Placage cellulaire et radiothérapie UV-C

1. Avant le placage, dissocier les cellules de surface oculaireprimaire de souris isolées dans notre laboratoire (résultats non publiés ; ces cellules sont un mélange d’épithélial cornéen, de cellules stromales et de kéatocytes) à l’aide d’un agent de dissociation cellulaire douce(Tableau des matériaux).
2. Plaque 0.2 x 10⁶ cellules oculaires oculaires primaires de souris dans 35 mm 0.2% de la matrice de membrane de sous-sol enduit des plats de culture cellulaire dans 2.5 ml de médias complets. Incuber toute la nuit à 37 oC dans un incubateur de CO₂ de 5 % et humidifié.
   REMARQUE : Le support complet pour cultiver les cellules primaires de la surface oculaire de souris est composé de glucose élevé de DMEM contenant 20% de FBS, 1% de Pen-streptop, 1% de Glutamax, 1% d’acide aminé non essentiel (NEAA), 1% de pyruvate de sodium et 0,1% de mercaptoéthanol.
3. Avant d’exposer les cellules à diverses doses d’UV-C, jetez le volume maximum de la médie et ne laissez qu’une mince couche de support (500 l) rester en contact avec les cellules, juste assez pour les couvrir.
4. Emmenez la vaisselle, une à la fois, à la source/chambre UV-C (chambre inférieure d’un four d’hybridation/lien croisé UV; Tableau des matériaux). Placer le plat dans la chambre et retirer le couvercle du plat. La position du couvercle ouvert du plat garantit que les cellules reçoivent la dose maximale d’UV-C pendant l’exposition aux UV-C.
5. Exposer les cellules à différentes catégories/doses d’UV-C : 1 J/m², 100J/m², 1 000 J/m² et 10 000 J/m².
6. Après l’exposition aux UV-C, remplacez immédiatement le couvercle de chacun des plats et retirez-les de la chambre source UV-C.
7. Apportez chacun des plats à la hotte laminaire et rechargez chacun des plats avec 2 ml de supports frais et complets.
8. Incuber les cellules pendant 3 h dans un incubateur co₂ de 37 oC. Trois heures d’incubation après l’exposition aux UV-C sont optimales pour visualiser et quantifier les premiers effets.

3. Préparation des supports de coloration en cellule vivante

1. Préparer le média de coloration frais pendant les 15 dernières min de l’incubation de 3 h cellules après l’exposition AUX UV-C.
2. Pré-chaud 10 ml du support de coloration contenant 10% FBS-DMEM complété avec 1% Pen-Strep à 37 oC.
3. Ajouter 5 ll de 10 mM DCFDA; 5 l de 10 mg/mL de solution Hoechst et 200 oL d’iodure de propidium de 1 mg/mL. Les concentrations finales de DCFDA, Hoechst et PI sont de 5 M, 5 g/mL et 20 g/mL, respectivement, dans les 10 mL de supports de coloration.

4. Coloration DCFDA des cellules oculaires primaires exposées à la souris EXPOSÉE aux UV-C

1. Après 3 h d’incubation des cellules oculaires primaires exposées à la souris uv-C à diverses doses, aspirez les médias des plats de 35 mm.
2. Réapprovisionner avec 2 ml de supports de coloration DCFDA fraîchement préparés à chacun des plats doucement sur les côtés.
3. Incuber les cellules avec le support de coloration pendant 15 min dans l’obscurité dans un incubateur de CO₂ de 37 oC pour la coloration des cellules vivantes.

5. Affichage des cellules tachées DCFDA (ROS), Hoechst et PI

1. Après l’achèvement de l’incubation, jetez les supports de coloration.
2. Ajouter un nouveau support complet aux cellules et observer les cellules sous un microscope fluorescent inversé / imageur cellulaire (Tableau des matériaux). Photographiez les champs désirés : champ lumineux, fluorescence bleue, fluorescence rouge, fluorescence verte.
   REMARQUE: Les cellules bleues tachées fluorescentes sont les noyaux, la fluorescence verte est pour les cellules génératrices ROS et la fluorescence rouge indique les cellules mortes positives PI.

6. Quantification des cellules tachées (Hoechst-Blue, PI-Dead et Green-ROS) à l’aide de techniques d’imagerie

1. Exportez les images capturées sous le microscope fluorescent inversé/imageur cellulaire à ImageJ pour la quantification.
2. Ouvrez chacune des images une à la fois, en utilisant chaque canal (c.-à-d. bleu (Nuclei/Hoechst), vert (ROS), rouge (Mort/PI positif)) séquentiellement, pour le comptage. Commencez par le contrôle non exposé et se déplacer séquentiellement à 1, 100, 1000 et 10.000 J/m^-2.
3. Compter les cellules à l’aide de l’outil de comptage cellulaire marqué comme une croix dans le menu logiciel pour chacun des champs [bleu positif (Hoechst positif; noyaux), positif rouge (PI positif; cellules mortes); positif vert (ROS)] dans chacune des images correspondant à chacun des Traitements.
4. Comptez en cliquant sur chacun des signaux spécifiques dans chacun des champs. Par exemple, en cliquant sur les noyaux tachés bleu/Hoechst donnera le nombre total de noyaux dans un champ donné.
5. Calculez les résultats comme le pourcentage de décès cellulaire par les dommages UV (nombre de cellules positives IP x 100 divisé par le nombre de cellules positives Hoechst) et le pourcentage de la production de ROS par les dommages UV (nombre de cellules positives DCFDA x 100 divisé par le nombre de cellules positives Hoechst).

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Résultats

DCFDA est un colorant incolore qui est une forme chimiquement réduite de fluorescéine utilisée comme indicateur pour détecter le ROS dans les cellules. Ce colorant est emprisonné à l’intérieur des cellules et est facilement oxydé à la dichlorodihydrofluescein fluorescent (DCF), qui émet une fluorescence verte. Cette fluorescence peut être détectée à l’aide d’une microscopie fluorescente. Les cellules peuvent être visualisées et corrélées avec l’accumulation de ROS comme suit : (i) les cellules v...

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Discussion

La méthode de coloration DCFDA décrite ici permet la visualisation de ROS dans les cellules vivantes oculaires primaires de souris traitées avec le rayonnement UV-C. Un avantage de cette méthode de coloration est qu’elle permet également aux chercheurs d’étudier les effets immédiats des UV-C (3 heures après l’exposition aux UVC) sur les cellules vivantes et leur énumération simultanée pour le pourcentage de ROS positif, ainsi que, les cellules mortes. En outre, comme la méthode de coloration est utilis?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin	HiMedia	RM99955	One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel	Corning		Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide	Sigma	P4170	Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad