Оценка окислительного повреждения в первичной мыши глазной поверхностных клеток / стволовых клеток в ответ на ультрафиолет-C (UV-C) Ущерб

Резюме

Этот протокол демонстрирует одновременное обнаружение реактивных видов кислорода (ROS), живых клеток и мертвых клеток в живых первичных культурах из клеток поверхности мыши. 2',7'-Dichlorofluorescececetate, пропидий йодида, и Hoechst окрашивания используются для оценки ROS, мертвых клеток, и живых клеток, соответственно, а затем изображения и анализа.

Аннотация

Глазная поверхность подвергается регулярному износу из-за различных факторов окружающей среды. Воздействие УФ-С представляет опасность для здоровья работников. Здесь мы демонстрируем воздействие первичных стволовых клеток с поверхности мышки глазной поверхности на ультрафиолетовое излучение. Формирование реактивных видов кислорода (ROS) является считывателем степени окислительного стресса/повреждения. В экспериментальной обстановке in vitro также важно оценить процент мертвых клеток, генерируемых из-за окислительного стресса. В этой статье мы продемонстрируем 2',7'-Dichlorofluorescececetate (DCFDA) окрашивание УФ-C подвергаются мыши первичных глазных стволовых клеток и их количественной оценки на основе флуоресцентных изображений DCFDA окрашивания. ОКрашивание DCFDA напрямую соответствует поколению ROS. Мы также демонстрируем количественную оценку мертвых и живых клеток путем одновременного окрашивания с пропидий йодид (PI) и Hoechst 3332 соответственно и процент DCFDA (ROS положительные) и PI положительные клетки.

Введение

Глазная поверхность (ОС) является функциональным устройством, состоящим в основном из внешнего слоя и железистой эпителии роговицы, лахримальной железы, мейбомианской железы, конъюнктивы, части поля крышки глаза и иннервации, которые преобразовывают сигналы¹. Прозрачный слой роговицы в форме купола фокусирует свет на сетчатке. Эта васкулярная ткань состоит из клеточных компонентов, таких как эпителиальные клетки, кератоциты, эндотелиальные клетки и ацеллические компоненты, такие как коллаген и гликозаминогликан². Область осушена слезами, которые также поставляют большую часть питательных веществ. Анатомическое положение ОС заставляет ее находиться в непосредственном контакте с внешней средой, часто подвергая ее различным суровым компонентам, таким как яркий свет, микробы, частицы пыли и химические вещества. Этот фактор предрасполагает ОС к физическим травмам и делает ее подверженной различным заболеваниям.

Оксидативный стресс вызван из-за дисбаланса между производством реактивных видов кислорода (ROS) и эндогенных антиоксидантных защитных механизмов^3. ROS классифицируются на реактивные молекулы и свободные радикалы, оба из которых получены из молекулярного кислорода (O₂) через митохондриальную окислительную фосфорилатацию^4. Первая группа состоит из нерадикальных видов, таких как перекись водорода (H₂O₂), синглетный кислород (¹O₂) и последний включает в себя такие виды, как супероксидные анионы (O₂^-), и гидроксиловые радикалы (^З.OH), среди других. Эти молекулы являются побочными продуктами нормальных клеточных процессов и их роли были вовлечены в важные физиологические функции, такие как трансдукция сигнала, экспрессия генов, и принимающей защиты⁵. Увеличенное производство ROS, как известно, генерируется в ответ на такие факторы, как патогенвторжения, ксенобиотики, и воздействие ультрафиолетового (УФ) излучения⁴. Это перепроизводство ROS приводит к окислительному стрессу, что приводит к повреждению молекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки и липиды^6.

Природный солнечный свет, наиболее преобладающий источник УФ-излучения, состоит из УФ-А (400-320 нм), УФ-В (320-290 нм) и УФ-С (290-200 нм)⁷. Сообщалось об обратной корреляции между длиной волны и спектральными энергиями. Хотя естественные ультрафиолетовые излучения поглощаются атмосферой, искусственные источники, такие как ртутные лампы и сварочные приборы, испускают и, следовательно, представляют собой профессиональную опасность. Симптомы воздействия на глаза включают фотокератит и фотокератоконъюнктивит⁸. Производство ROS является одним из основных механизмов нанесения УФ индуцированного клеточного повреждения^9. В текущем исследовании, мы демонстрируем обнаружение ROS с помощью 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein диацетат акцентратат (DCFDA) окрашивающий метод в мыши первичных глазных поверхностных клеток / стволовых клеток, подверженных УФ-C. Зеленая флуоресценция была захвачена с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки были противозапятнаны двумя красителем, Hoechst 33342 и красным йодидом propidium, чтобы испачкать живые и мертвые клетки, соответственно.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эксперимент проводился на первичных глазных клетках/стволовых клетках, полученных из швейцарского глаза мыши альбиносов. Использование животных для сбора глаз для этого эксперимента было одобрено Институциональным комитетом по этике животных, Енепоя (Считается университетом) (номер одобрения IEAC, 6a/19.10.2016).

1. Подготовка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Производные первичные клетки/стволовые клетки из поверхности окулярной мыши выходит за рамки этого протокола. Таким образом, мы демонстрируем дозы воздействия УФ-С, препарат реагента для оценки ROS, живых и мертвых клеток и их количественной оценки. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для соответствующих объемов реагентов (10% плода бычьей сыворотки, DCFDA, Hoechst и пропидий йодида фондовых решений, которые будут добавлены для получения окончательного раствора окрашивания).

1. Подготовьте стоковое раствор 10 мМ DCFDA путем растворения 25 мг порошка DCFDA в 5,13 мл DMSO. Aliquot 250 qL каждый в янтаре цвета 1,5 мл труб и хранить при -20 градусов по Цельсию.
2. Подготовьте стоковой раствор 10 мг/мл (16,23 мм раствора) Hoechst 33342 путем растворения всего содержимого флакона 25 мг в 2,5 мл деионированной воды. Сделать aliquots 100 qL в янтарных цветных микроцентрифуговых труб и хранить при 2-6 градусов по Цельсию в течение 6 месяцев. Для более длительного хранения, хранить на -20 градусов по Цельсию.
3. Приготовьте бульонный раствор 1 мг/мл пропидия йодида в деионизированной воде, aliquot 1 мл каждый в янтаре цвета 1,5 мл труб, и хранить при 4 градусах Цельсия.

2. Клеточное покрытие и ультрафиолетовая обработка

1. Перед покрытием, диссоциировать мышь первичных глазных поверхностных клеток, изолированных в нашей лаборатории (неопубликованные результаты; такие клетки представляют собой смесь роговицы эпителия, стромальные клетки и кератоциты) с помощью мягкого средства диссоциации клеток (Таблица материалов).
2. Плита 0,2 х 10⁶ мыши первичных глазных поверхностных клеток в 35 мм 0,2% подвалм мембраны матрицы покрытием клеточной культуры блюд в 2,5 мл полных носителей. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия в 5% CO₂ и увлажненный инкубатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полный носитель для культивирования первичных клеток из поверхности окулярной мыши состоит из DMEM высокой глюкозы, содержащей 20% FBS, 1% Pen-strep, 1% Glutamax, 1% несущественных аминокислот (NEAA), 1% пируват натрия, и 0,1% й-меркаптоэтанол.
3. Прежде чем подвергать клетки различным дозам УФ-С, отбросьте максимальный объем носителей и позвольте лишь тонкому слою носителей (500 евро) оставаться в контакте с клетками, достаточно, чтобы покрыть их.
4. Возьмите посуду, по одному в ИСТОЧНИК УФ-С /камеру (нижняя камера гибридизации печи / УФ-кросс-связующим звеном; Таблица материалов). Поместите блюдо в камеру и снимите крышку блюда. Открытое положение крышки блюда гарантирует, что клетки получают максимальную дозу УФ-С во время воздействия УФ-С.
5. Выставляем клетки в разные сорта/дозы УФ-С: 1 Дж/м^2,100Дж/м^2,1000 Дж/м² и 10 000 Дж/м².
6. После воздействия УФ-С немедленно замените крышку каждого блюда и удалите их из исходной камеры UV-C.
7. Принесите каждое из блюд на ламинарный капот воздушного потока и пополнить каждое из блюд с 2 мл свежих полных носителей.
8. Инкубировать клетки в течение 3 ч в инкубаторе 37 градусов по Цельсию_{CO 2.} Три часа инкубационного после УФ-С воздействия является оптимальным для визуализации и количественной оценки ранних эффектов.

3. Подготовка живых клеток окрашивания средств массовой информации

1. Подготовка окрашивания средств массовой информации свежие в течение последних 15 минут 3 h инкубации клеток после УФ-C воздействия.
2. Предварительно потеплев 10 мл окрашивания носителей, содержащих 10% FBS-DMEM, дополненного 1% Pen-Strep до 37 градусов по Цельсию.
3. Добавить 5 зл и 10 мМ DCFDA; 5 л раствора Hoechst 10 мг/мл и 200 Л l 1 мг/мл пропидий йодида. Окончательные концентрации DCFDA, Hoechst и PI составляют 5 мкм, 5 мкг/мл и 20 мкг/мл, соответственно, в 10 мл окрашивания носителей.

4. DCFDA окрашивание УФ-C подвергаются мыши первичных глазных клеток

1. После 3 ч инкубации УФ-С подвергаются мыши первичных глазных клеток в различных дозах, аспирации средств от 35 мм блюд.
2. Пополнить с 2 мл свежеприготовленных DCFDA окрашивания средств массовой информации для каждого из блюд мягко со стороны.
3. Инкубировать клетки с окрашивающими средствами для 15 мин в темноте в инкубаторе 37 C CO₂ для окрашивания живых клеток.

5. Просмотр dcFDA (ROS), Hoechst и PI окрашенных клеток

1. После завершения инкубации, отбросить окрашивания средств массовой информации.
2. Добавить свежие полные носители в клетки и наблюдать клетки под перевернутым флуоресцентным микроскопом / клеточной imager (Таблица материалов). Фотография нужных полей: ярко-поля, синяя флуоресценция, красная флуоресценция, зеленая флуоресценция.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Синие флуоресцентно окрашенные клетки являются ядрами, зеленая флуоресценция для ROS генерирующих клеток и красная флуоресценция указывает На. положительных мертвых клеток.

6. Количественная оценка окрашенных клеток (Hoechst-Blue, PI-Dead и Green-ROS) с использованием методов визуализации

1. Экспорт изображения, полученные под перевернутым флуоресцентным микроскопом/изображением ячейки, на ImageJ для количественной оценки.
2. Откройте каждое из изображений по одному, используя каждый канал (т.е. синий (Nuclei/Hoechst), зеленый (ROS), красный (Мертвый/PI положительный)) последовательно, для подсчета. Начните с неэкспонированного управления и последовательно перейдите на 1, 100, 1000 и 10000 J/m^-2.
3. Подсчитайте ячейки с помощью инструмента подсчета ячеек, отмеченного как крест в меню программного обеспечения для каждого из полей (Hoechst positive; ядра), красный положительный (PI положительный; мертвые клетки); зеленый положительный (ROS) в каждом из изображений, соответствующих каждому из изображений Процедуры.
4. Считайте, нажав на каждый из конкретных сигналов в каждом из полей. Например, нажатие на синие/Hoechst окрашенные ядра даст общее количество ядер в данном поле.
5. Рассчитайте результаты как процент клеточной смерти от ПОВРЕЖДЕНИЯ УФ (количество положительных ячеек PI x 100, разделенных на количество положительных клеток Hoechst) и процент производства ROS по УФ-повреждению (количество положительных клеток DCFDA x 100 делится на количество положительных клеток Hoechst).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

DCFDA является бесцветный краситель, который является химически уменьшенной формой флуоресцеина, используемой в качестве индикатора для обнаружения ROS в клетках. Этот краситель попадает в ловушку внутри клеток и легко окисляется до флуоресцентного дихлородигидрофторцеи (DCF), который ис?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Описанный здесь метод окрашивания DCFDA позволяет визуализировать ROS в первичных глазных живых клетках мыши, обработанных ультрафиолетовым излучением. Преимущество этого метода окрашивания является то, что он также позволяет исследователям изучить непосредственное воздействие УФ-С (3 ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin	HiMedia	RM99955	One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel	Corning		Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide	Sigma	P4170	Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad