JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La formation image à l'échelle nanométrique d'échantillons de tissus cliniques peut améliorer la compréhension de la pathogénie de la maladie. La pathologie d'expansion (ExPath) est une version de la microscopie d'expansion (ExM), modifiée pour la compatibilité avec les échantillons cliniques standard de tissu, pour explorer la configuration nanométrique des biomolécules utilisant des microscopes limités de diffraction conventionnelle.

Résumé

Dans la pathologie moderne, la microscopie optique joue un rôle important dans le diagnostic de la maladie en révélant des structures microscopiques de spécimens cliniques. Cependant, la limite fondamentale de diffraction physique empêche l'interrogation de l'anatomie à l'échelle nanométrique et les changements pathologiques subtils lors de l'utilisation d'approches conventionnelles d'imagerie optique. Ici, nous décrivons un protocole simple et peu coûteux, appelé pathologie d'expansion (ExPath), pour l'imagerie optique à l'échelle nanométrique des types communs de spécimens cliniques de tissu primaire, y compris le tissu incorporé de paraffine fixe-congelée ou formalin-fixe (FFPE) Sections. Cette méthode contourne la limite de diffraction optique en transformant chimiquement les échantillons de tissus en hybride tissu-hydrogel et en les élargissant physiquement isotropically à travers de multiples échelles dans l'eau pure. En raison de l'expansion, les molécules précédemment insolubles sont séparées et peuvent donc être observées à l'aide d'un microscope optique conventionnel.

Introduction

L'étude de l'organisation moléculaire des tissus dans un contexte tridimensionnel (3D) peut fournir une nouvelle compréhension des fonctions biologiques et du développement de la maladie. Cependant, ces environnements à l'échelle nanométrique sont au-delà des capacités de résolution des microscopes à diffraction conventionnelle limitée (200 à 300 nm), où la distance minimale résolvable, d est définie par d '/NA. Voici la longueur d'onde de la lumière et NA est l'ouverture numérique (NA) du système d'imagerie. Récemment, la visualisation directe des molécules étiquetées fluorescentes a été rendue possible grâce aux techniques d'imagerie super-résolution nouvellement développées1,2,3, y compris l'épuisement des émissions stimulées (STED), microscopie de localisation photo activée (PALM), microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et microscopie structurée d'éclairage (SIM). Bien que ces techniques d'imagerie aient révolutionné la compréhension de la fonction biologique à l'échelle nanométrique, dans la pratique, elles reposent souvent sur des équipements coûteux et/ou spécialisés et des étapes de traitement d'image, peuvent avoir plus peu de temps d'acquisition que l'imagerie optique conventionnelle, nécessitent des fluorophores ayant des caractéristiques spécifiques (comme la capacité de commutation de photo et/ou une photostabilité élevée). En outre, il reste un défi d'effectuer l'imagerie 3D super-résolution sur des spécimens de tissus.

La microscopie d'expansion (ExM), introduite pour la première fois en 20154, fournit un autre moyen d'imagerie des caractéristiques à l'échelle nanométrique (70 nm) en élargissant physiquement les échantillons conservés incorporés dans un hydrogel polyélectrolyte enflé. Ici, les biomolécules clés et/ou les étiquettes sont ancrées in situ à un réseau de polymères qui peut être isotopiquement étendu après traitement chimique. Parce que l'expansion physique augmente la résolution effective totale, les molécules d'intérêt peuvent alors être résolues en utilisant des systèmes d'imagerie conventionnels à diffraction limitée. Depuis la publication du protocole original, où les étiquettes fluorescentes synthétisées personnalisées ont été ancrées au réseau de polymères4, de nouvelles stratégies ont été utilisées pour ancrer directement les protéines (rétention de protéines ExM, ou proExM)5, 6,7,8,9 et RNA9,10,11,12 à l'hydrogel, et augmenter le grossissement physique par itératif expansion13 ou l'adaptation de la chimie gel8,14,15.

Ici, nous présentons une version adaptée de proExM, appelé pathologie d'expansion (ExPath)16, qui a été optimisé pour les formats de pathologie clinique. Le protocole convertit les échantillons cliniques, y compris les échantillons de paraffine fixe synéral fixe s'est métastatique (FFPE), l'hématoxylin et l'éosine (H-E) tachés, et les échantillons de tissus humains fraîchement congelés montés sur des lames de verre, en un état compatible avec LM. Les protéines sont ensuite ancrées à l'hydrogel et l'homogénéisation mécanique est effectuée (Figure 1)16. Avec une expansion linéaire 4 fois des échantillons, des images multicolores de super-résolution (70 nm) peuvent être obtenues à l'aide d'un microscope confocal conventionnel ayant seulement une résolution de 300 nm et peuvent également être combinés avec d'autres techniques d'imagerie de super-résolution.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Préparation des réactifs et des solutions stock

  1. Préparer les composants de la solution de gélification.
    REMARQUE :     Les concentrations de solutions sont administrées en g/mL (w/v pour cent).
    1. Faire les solutions de stock suivantes : 38 % (w/v) acrylate de sodium (SA), 50 % (w/v) acrylamide (AA), 2 % (w/v) N,N-N-méthylenebisacrylamide (Bis) et 29,2 % (w/v) chlorure de sodium (NaCl). Dissoudre les composés dans de l'eau doublement déionisée (ddH2O). Utiliser les montants du tableau 1 comme référence; les solutions préparées peuvent être à la hausse ou à la baisse en volume au besoin. Par exemple, pour faire 10 ml d'une solution SA de 38 % (w/v), ajouter 1,9 g SA à un cylindre gradué de 10 ml et ajouter ddH2O à un volume de 5 ml.
    2. Préparer 9,4 ml de solution monomère à une concentration de 1,06x, comme le montre le tableau 1.
      REMARQUE: Cela se traduira par une concentration de 1x après l'ajout de l'initiateur, l'accélérateur et l'inhibiteur. Le stock de monomères peut être stocké à 4 oC pendant une période allant jusqu'à 3 mois, ou à -20 oC pour un stockage à long terme.
    3. Préparer les solutions de stock suivantes séparément en ddH2O: 0,5% (w/v) de l'inhibiteur 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (4HT), qui inhibe la gelation pour permettre la diffusion de la solution de gélification dans les tissus, 10% (v/v) de la initiator tetramethylenediamine (TEMED), qui accélère la génération radicale par l'ammonium persulfate (APS), et 10% (w/v) APS qui initie le processus de gélification.
      REMARQUE: Les solutions de stock de 4HT et TEMED peuvent être préparées en aliquots de 1 ml et stockées à -20 oC pendant au moins 6 mois. APS a été trouvé à perdre l'efficacité après le stockage à long terme et est mieux préparé en petites quantités (lt;0,1 ml) immédiatement avant le gélification.
  2. Préparer un tampon de digestion (50 mM Tris pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5 % [w/v] surfactant nonionic, 0,8 M NaCl) en combinant 25 mL de 1 M Tris pH 8 (3,03 g de base Tris en 25 mL de ddH2O), 25 mL d'EDTA (0,5 M pH 8) , 2,25 g de surfactant nonionique, et 23,38 g de NaCl. Ajouter ddH2O pour un volume total de 500 ml.
    REMARQUE: La solution peut être mise à l'échelle vers le haut ou vers le bas au besoin et être stockée à 4 oC. Proteinase K (ProK) sera ajouté immédiatement avant l'étape de digestion.
  3. Préparer une solution de citrate de sodium de 20 mM en combinant 2,941 g de dihydrate tribasic de citrate de sodium avec 500 mL de ddH2O et en ajustant le pH à 8,0 à température ambiante (RT). Échelle du volume de stock au besoin.
  4. Préparer une solution de stock de 6-(acryloyl)amino)acide hexanoïque, ester succinimidyl (acryloyl-X, SE; AcX), le composé d'ancrage. Dissoudre l'AcX dans 500 oL de sulfoxide de diméthyle anhyus (DMSO) pour une concentration finale de 10 mg/mL.
    REMARQUE: La solution peut être stockée dans un environnement desséché à -20 oC dans 20 aliquots ll.
  5. Si vous n'utilisez pas de tampons disponibles dans le commerce pour immunostaining, préparer le tampon de blocage. Utilisez un tampon de blocage de 5 % (v/v) de sérum animal normal et de 0,1 % (w/v) surfactant nonionique dans la saline 1x tamponnée par phosphate (PBS) et sélectionnez le sérum à partir de l'animal hôte des anticorps secondaires. Par exemple, pour préparer un tampon de blocage de 500 ml pour les anticorps élevés dans la chèvre, combiner 25 ml de sérum de chèvre, 0,45 g de surfactant nonionique et 1x PBS à un volume de 500 ml.

2. Préparation de diapositives de tissus cliniques archivées et fraîchement préparées pour ExPath

  1. Convertissez le tissu en un format compatible ExPath. Choisissez l'une des quatre étapes suivantes (2.1.1-2.1.4) en fonction de la façon dont le spécimen a été préparé : diapositives FFPE, lames de FFPE tachées ou des lames de tissu congelénon non fixes ou fixes dans une solution optimale de température de coupe (OCT).
    REMARQUE :     Celles-ci sont basées sur des étapes de récupération standard pour les échantillons de pathologie et ne sont pas spécifiques au protocole ExPath.
    1. Échantillons cliniques FFPE
      1. Préparer 30 ml d'éthanol à 95 %, 70 % d'éthanol et 50 % d'éthanol. Mesurer 30 ml de xylène, 100% d'éthanol et ddH2O.
      2. Placez la diapositive avec l'échantillon dans un conique de 50 ml à l'aide de forceps et ajoutez 15 ml de xylène. Ponctuez le tube et placez-le horizontalement sur un shaker orbital à environ 60 tr/min et incubez à RT pendant 3 min pour chaque solution. Répéter l'opération avec les 15 ml de xylène restants.
      3. Répétez l'étape 2.1.1.2 avec 100% d'éthanol, 95% d'éthanol, 70% d'éthanol, 50% d'éthanol et ddH2O à la place du xylène.
    2. Glissades permanentes tachées et montées
      1. Placer la glissière dans un plat Petri de 100 mm et couvrir de xylène. Retirez soigneusement la glissière à l'aide d'une lame de rasoir. Si la glissière de couverture n'est pas facilement enlevée, retournez la glissière au xylène jusqu'à ce que la glissière se desserre.
      2. Processus à l'aide des étapes pour les échantillons FFPE (étapes 2.1.1-2.1.1.3).
        REMARQUE: Dans le cas des lames tachées de H et E, les taches sont éliminées pendant le processus d'expansion.
    3. Glissades de tissu congelées non fixées dans la solution OCT
      1. Fixer le tissu dans l'acétone à -20 oC pendant 10 min.
      2. Laver les échantillons avec 1x solution PBS 3 fois pendant 10 min chacun à RT.
    4. Diapositives cliniques préalablement fixes et congelées
      1. Incuber les toboggans pendant 2 min à RT pour faire fondre la solution OCT.
      2. Laver l'échantillon avec 1x solution PBS 3 fois pendant 5 min chacun à RT.
  2. Effectuer un traitement thermique pour la récupération d'antigène sur tous les échantillons après la conversion du format.
    1. Ajouter une solution de citrate de 20 mm (pH 8 à RT) dans un contenant résistant à la chaleur, comme un pot de coloration à glissière.
      REMARQUE: Il devrait y avoir assez de solution pour couvrir le tissu monté sur la glissière (50 ml pour un pot de coloration de diapositive standard).
    2. Chauffer la solution de citrate à 100 oC au micro-ondes et placer la lame dans la solution. Transférer immédiatement le récipient dans une chambre d'incubation et incuber à 60 oC pendant 30 min.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les toboggans peuvent être placés dans des plats Petri et recouverts de 1x PBS et stockés à 4 oC.
  3. Tainer l'échantillon à l'aide de protocoles standard de coloration immunofluorescence (IF)/immunohistochemistry (IHC).
    REMARQUE :     Les concentrations et les durées spécifiques des anticorps primaires et secondaires dépendent des concentrations suggérées par le fabricant ou de l'optimisation pour l'expérience spécifique.
    1. Utilisez un stylo hydrophobe pour tracer une limite autour de la section tissulaire (s) sur la diapositive afin de minimiser le volume de solution nécessaire pour couvrir le tissu. Placez la glissière dans un plat assez grand pour s'adapter à la glissière. Pour un toboggan standard de 3 pouces, utilisez un plat Petri de 100 mm.
      REMARQUE: Le stylo hydrophobe n'interfère pas avec la polymérisation de l'échantillon ni le processus de digestion.
    2. Incuber le tissu avec un tampon de blocage pendant 1 h à 37 oC, 2 h à RT, ou 4 oC pendant la nuit pour réduire la liaison non spécifique.
    3. Diluer les anticorps primaires à la concentration désirée dans la quantité appropriée de tampon de blocage préparé (ou tout autre tampon de coloration préféré). Incuber les tissus avec la solution d'anticorps primaire pendant au moins 3 h à RT ou 37 oC, ou pendant la nuit à 4 oC.
      REMARQUE: Les échantillons doivent être placés dans un contenant humidifié (comme un plat Petri avec une lingette humide) pour empêcher le tissu de se dessécher. En règle générale, les anticorps ont été dilués à 1:100-1:500 dans 200 à 500 l de tampon, selon la taille des tissus et l'anticorps utilisé.
    4. Laver le tissu avec un tampon de blocage préparé (ou un autre tampon de lavage préféré) 3 fois pendant 10 min à RT.
    5. Diluer les anticorps secondaires (et 300 nM 4,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] si désiré), dans le tampon de blocage préparé (ou autre tampon de coloration préféré) à une concentration d'environ 10 g/mL. Incuber le tissu dans la solution d'anticorps secondaire pendant au moins 1 h à RT ou 37 oC.
      REMARQUE: Le moment peut être ajusté en fonction des anticorps utilisés et de l'épaisseur du tissu. Les anticorps secondaires contenant des colorants à la cyanine (Cy3, Cy5, Alexa 647) ne sont pas compatibles avec le protocole ExM lorsqu'ils sont appliqués avant la polypolymérisation. Les colorants suggérés comprennent Alexa 488 (vert), Alexa 546 (orange/rouge) et Atto 647N ou CF633 (rouge lointain). Le DAPI doit être réappliqué après l'expansion, car il est emporté pendant le processus d'expansion.
    6. Laver le tissu avec un tampon de blocage préparé (ou un autre tampon de lavage préféré) 3 fois pendant 10 min chacun à RT.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les toboggans peuvent être placés dans des plats Petri et recouverts de 1x PBS et stockés à 4 oC.
    7. Effectuez l'imagerie fluorescente à l'aide d'un microscope à large champ conventionnel, d'un microscope confocal ou d'un autre système d'imagerie de choix.
      REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour déterminer la longueur biologique en utilisant le facteur d'expansion en comparant les images avant et après l'expansion. Pour faciliter l'imagerie post-expansion, des régions d'intérêt facilement identifiables devraient être sélectionnées et des images à faible et à haut grossissement devraient être recueillies.

3. Polymérisation in situ des spécimens

  1. Incuber le spécimen dans une solution d'ancrage.
    1. Préparer la solution d'ancrage (généralement 250 L est suffisant pour couvrir la section tissulaire) en diluant la solution de stock AcX en 1x PBS à une concentration de 0,03 mg/mL pour les échantillons fixés avec des fixatifs non aldéhyde ou 0,1 mg/mL pour les échantillons fixés avec des fixatifs d'aldéhyde , qui ont moins d'amines gratuites disponibles pour réagir avec AcX.
    2. Placez la glissière dans un plat Petri de 100 mm et pipette la solution d'ancrage sur le tissu. Incuber pendant au moins 3 h à RT ou toute la nuit à 4 oC.
  2. Incuber les échantillons dans une solution de gélification.
    1. Préparer au moins 100 fois le volume excédentaire de la solution de gélification. Pour 200 L, combinez les éléments suivants, dans l'ordre : 188 L de solution monomère, 4 L de 0,5 % 4HT solution de stock (1:50 dilution, concentration finale : 0,01 %), 4 'L de 10 % solution de stock TEMED (1:50 dilution, concentration finale 0,2 %), et 4 'L de 10 % solution d'actions APS (1:50 dilution, concentration finale de 0,2 %.
      REMARQUE: La solution de gel doit être faite immédiatement avant utilisation. La solution doit être maintenue à 4 oC et la solution APS doit être ajoutée en dernier, afin d'éviter les gélifications prématurées.
    2. Retirer l'excédent de solution de la section tissulaire et placer la glissière dans un plat Petri de 100 mm. Ajouter une solution de gélification fraîche et froide à l'échantillon et incuber le mélange sur le tissu pendant 30 min à 4 oC, afin de permettre la diffusion de la solution dans le tissu.
  3. Construire une chambre sur la diapositive autour de l'échantillon(figure 2A) sans déranger la solution de gélification.
    1. Faire des espaces pour la chambre de gélification en coupant finement des morceaux de verre de couverture à l'aide d'un couteau en diamant.
      REMARQUE: Pour faciliter l'imagerie après l'expansion, les espaceurs doivent être proches de l'épaisseur du spécimen de tissu pour réduire la quantité de gel blanc au-dessus du tissu. Le verre numéro 1.5 peut être utilisé pour des échantillons cliniques standard (5 à 10 m). Les morceaux de verre de couverture peuvent être empilés pour des échantillons plus épais.
    2. Fixer les espaceurs de chaque côté du tissu à l'aide de gouttelettes d'eau (10 l).
    3. Placez soigneusement un couvercle en verre de couverture au-dessus de la glissière, en veillant à éviter de piéger les bulles d'air sur le tissu (Figure 2B).
  4. Incuber l'échantillon à 37 oC dans un environnement humidifié (comme un plat Petri fermé avec une lingette humide) pendant 2 h.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. La chambre de diapositive peut être stockée à l'intérieur d'un plat Petri scellé à 4 oC.

4. Digestion d'échantillon

  1. Retirez le couvercle de la chambre de gélification en glissant doucement une lame de rasoir sous la glissière et en soulevant lentement la glissière de la surface du gel. Couper le gel blanc autour du tissu pour minimiser le volume. Couper le gel de façon asymétrique pour suivre l'orientation du gel après homogénéisation, puisque l'échantillon deviendra transparent.
    1. Diluer ProK par 1:200 dans le tampon de digestion (concentration finale 4 U/mL) avant utilisation. Préparer une solution suffisante pour immerger complètement le gel; un seul puits d'une plaque de culture de cellules en plastique à quatre puits nécessite au moins 3 ml par puits.
    2. Incuber l'échantillon dans un récipient fermé contenant le tampon de digestion pendant 3 h à 60 oC. Si l'échantillon ne se détache pas de la glissière pendant la digestion, utilisez une lame de rasoir pour enlever délicatement l'échantillon.
      REMARQUE: Le spécimen doit être complètement immergé dans un tampon de digestion pour empêcher l'échantillon de se dessécher et placé dans un récipient couvert (petite boîte à glissière, puits en plastique, plat Petri, etc.) qui peut être scellé avec du film.

5. Expansion et imagerie de l'échantillon

  1. Utilisez un pinceau souple pour transférer le spécimen en 1x PBS dans un récipient compatible avec le système d'imagerie désiré et assez grand pour accueillir le gel entièrement expansé. Assurez-vous que le tissu est placé avec le côté de l'échantillon vers le bas si l'imagerie sur un système inversé ou vers le haut si l'imagerie sur un système droit pour minimiser la distance de l'objectif d'imagerie à l'échantillon. Retourner le gel à l'aide d'un pinceau doux si nécessaire.
    REMARQUE: L'éclairage latéral d'une LED peut être utilisé pour les rendre visibles en liquide. Une plaque standard de 6 puits peut accueillir des échantillons dont le diamètre pré-élargi est inférieur à 0,6 cm. Une plaque de puits de fond en verre doit être utilisée pour l'imagerie sur un système inversé.
  2. Laver les échantillons en 1x PBS à RT pendant 10 min. Si désiré, re-tache de l'échantillon avec 300 nM DAPI que le processus de digestion lave la tache DAPI. Enlever PBS et la tache avec 300 nM DAPI dilué en 1x PBS pendant 20 min à RT, suivie d'un lavage de 10 min avec 1x PBS à RT.
    REMARQUE: Les échantillons peuvent être recouverts de 1x PBS et stockés à 4 oC avant de passer à l'étape suivante.
  3. Pour élargir les échantillons, remplacer le PBS et laver avec un volume excédentaire de ddH2O (au moins 10 fois le volume de gel final) 3 à 5 fois pendant 10 min chacun, à RT.
    REMARQUE: Après le lavage de 3e ou 4e, l'expansion du spécimen devrait commencer à plafonner. Pour le stockage, pour prévenir la croissance bactérienne, le ddH2O peut être complété par 0,002% 0,01% d'azide de sodium (NaN3). Dans ce cas, le facteur d'expansion final est réversiblement réduit de 10%.
  4. Effectuez l'imagerie par fluorescence à l'aide d'un microscope à large champ conventionnel, d'un microscope confocal ou d'un autre système d'imagerie de choix.
    REMARQUE: Pour empêcher les gels de dériver, l'excès de liquide peut être retiré du puits. Les gels peuvent également être immobilisés avec une agarose à faible fonte de 1,5 à 2 %. Préparer une agarose à faible fonte de 1,5 à 2 % (w/v) dans l'eau dans un récipient deux fois plus grand que le volume de solution. Chauffer la solution dans un bain d'eau de 40 oC ou au micro-ondes pendant 10 à 20 s pour faire fondre la solution. Pipette l'agarose fondue autour des bords du gel. Après avoir laissé l'agarose durcir à LA RT ou à 4 oC, ajouter de l'eau à l'échantillon pour prévenir la déshydratation.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Si le protocole a été réalisé avec succès (figure 1), les échantillons apparaîtront comme un gel plat et transparent après homogénéisation mécanique (Figure 3A) et peuvent se dilater par un facteur de 3 à 4,5x dans l'eau (Figure 3B), fournissant une résolution efficace de 70 nm selon le facteur d'expansion final et le système d'imagerie utilisé5,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ici, nous présentons le protocole ExPath16, une variante de proExM5 qui peut être appliquée aux types les plus communs d'échantillons de biopsie clinique utilisés en pathologie, y compris FFPE, H et E souillés, et des spécimens fraîchement congelés sur des lames de verre. La conversion de format, la récupération d'antigène, et l'immunostaining des spécimens suivent les protocoles couramment utilisés qui ne sont pas spécifiques à ExPath. Contrairement au prot...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Déclarations de divulgation

YZ et OB sont deux des inventeurs qui ont demandé et obtenu une protection par brevet sur un sous-ensemble des technologies décrites ici (brevets américains US20190064037A1, WO2018157074A1 et WO2018157048A1).

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le fonds de démarrage de la Faculté de l'Université Carnegie Mellon (YZ) et le prix du directeur des NIH New Innovator Award (DP2 OD025926-01 à YZ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)Sigma Aldrich176141Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)CellvisP06-1.5H-N
AcetoneFischer ScientifcA18-500
AcrylamideSigma AldrichA8887
Acryloyl-X, SE (AcX)InvitrogenA20770
AgaroseFischer ScientifcBP160-100
Ammonium persulfate (APS)Sigma AldrichA3678Initiatior
Anti-ACTN4 antibody produced in rabbitSigma AldrichHPA001873
Anti-Collagen IV antibody produced in mouseSanta Cruz Biotechsc-59814
Anti-Vimentin antibody produced in chickenAbcamab24525
Aqua Hold II hydrophobic penScientific Device980402
Breast Common Disease Tissue ArrayAbcamab178113
DAPI (1 mg/mL)Thermo Scientific62248Nuclear stain
Diamond knife No. 88 CMGeneral Tools31116
EthanolPharmco111000200
Ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) 0.5 M		VWRBDH7830-1
FFPE Kidney SampleUSBiomaxHuFPT072
Forceps
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488ABiotium20020
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633Biotium20121
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546InvitrogenA11010
MAXbind Staining MediumActive Motif15253Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.
MAXblock Blocking MediumActive Motif15252Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.
MAXwash Washing MediumActive Motif15254Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.
Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm)VWR48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm)VWR48393 251
N,N,N′,N′-
Tetramethylethylenediamine (TEMED)		Sigma AldrichT9281Accelerator
N,N′-MethylenebisacrylamideSigma AldrichM7279
Normal goat serumJackson Immunoresearch005-000-121For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture DishThermo Fisher167063Multi-well plastic culture dish
Nunclon 6-Well Cell Culture DishThermo Fisher140675
Nunc 15 mL ConicalThermo Fisher339651
Nunc 50 mL ConicalThermo Fisher339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x SolutionFischer ScientifcBP399-1
Plastic Petri Dish (100 mm)Fischer ScientifcFB0875713
Proteinase K (Molecular Biology Grade)Thermo ScientificEO0491
Razor bladeFischer Scientifc12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mLThermo Fisher3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mLThermo Fisher3459
Sodium acrylateSigma Aldrich408220
Sodium chlorideSigma AldrichS6191
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma AldrichC8532-1KG
Tris BaseFischer ScientifcBP152-1
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Wheat germ agglutinin labeled with CF640RBiotium29026
XylenesSigma Aldrich214736

Références

  1. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
  3. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).
  9. Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
  10. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  11. Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165(2016).
  12. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  13. Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  14. Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
  15. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  16. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

R tractationnum ro 151microscopie d expansionmicroscopie de fluorescenceimagerie l chelle nanom triqueimagerie super r solutionpathologiepathologie de l expansionimmunohistochimie

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.