通过物理和各向异性扩张对人体组织部分的纳米成像

摘要

临床组织样本的纳米成像可以增进对疾病发病机制的认识。扩张病理学 （ExPath） 是扩展显微镜 （ExM） 的一个版本，经过修改，与标准临床组织样本兼容，使用传统的衍射受限显微镜探索生物分子的纳米级配置。

摘要

在现代病理学中，光学显微镜通过揭示临床标本的微观结构在疾病诊断中起着重要的作用。然而，在使用传统的光学成像方法时，基本的物理衍射极限可以防止对纳米级解剖学和细微的病理变化进行询问。在这里，我们描述了一种简单而廉价的方案，称为扩张病理学（ExPath），用于常见类型的临床初级组织标本的纳米级光学成像，包括固定冷冻或形式固定石蜡嵌入（FFPE）组织部分。该方法通过化学化地将组织样品转化为组织水凝胶杂交，并在纯水中的多个尺度上物理地将其向各向异性扩展，从而规避了光学衍射极限。由于膨胀，以前无法解析的分子被分离，因此可以使用传统的光学显微镜进行观察。

引言

在三维（3D）环境下研究组织的分子组织，可以为生物功能和疾病发展提供新的了解。然而，这些纳米级环境超出了传统衍射有限显微镜（200~300nm）的分辨率，其中最小可解距，d由d +/NA定义。这里*是光的波长，NA是成像系统的数值孔径 （NA）。最近，新开发的超分辨率成像技术1、2、3，包括刺激发射消耗（STED），使荧光标记分子的直接可视化成为可能，光激活定位显微镜 （PALM）、随机光学重建显微镜 （STORM） 和结构化照明显微镜 （SIM）。尽管这些成像技术彻底改变了对纳米尺度生物功能的理解，但实际上，它们往往依赖于昂贵的和/或专门的设备和图像处理步骤，与传统的光学成像，需要具有特定特性（如光切换能力和/或高光稳定性）的荧光光道。此外，在组织标本上执行 3D 超分辨率成像仍是一项挑战。

膨胀显微镜 （ExM） 于 2015 年首次推出^4，通过物理膨胀嵌入在可膨胀聚电解质水凝胶中的保存样品，提供了成像纳米尺度特征（<70 nm）的替代方法。在这里，关键生物分子和/或标签原位固定在聚合物网络中，在化学处理后可以异位扩展。由于物理膨胀提高了总有效分辨率，因此可以使用传统的衍射限制成像系统解决感兴趣的分子。自原始协议发布以来，定制合成荧光标签被固定在聚合物^网络4上，新的策略被用来直接锚定蛋白质（蛋白质保留ExM，或proExM）5， ^{6、7、8、9}和 RNA⁹、^10、11、12到水凝胶，并通过迭代增加物理放大倍率^膨胀13或适应凝胶化学8，14，15。

在这里，我们提出了proExM的改编版本，称为扩张^{病理学（ExPath）16，}它已被优化的临床病理格式。该协议将临床样本（包括正式固定石蜡嵌入 （FFPE）、血氧林和 eosin （H&E） 染色，以及安装在玻璃幻灯片上的新鲜冷冻人体组织标本转换为与 ExM 兼容的状态。蛋白质然后锚定在水凝胶和机械均质执行 （图 1）¹⁶.通过样品4倍线性扩展，可以使用分辨率仅为±300 nm的传统共聚焦显微镜获得多色超分辨率（±70 nm）图像，还可以与其他超分辨率成像技术相结合。

研究方案

1. 库存试剂和溶液的制备

1. 准备凝胶溶液组件。
   注:溶液浓度以克/mL（w/v%）表示。
   1. 制作以下库存溶液:38%（w/v）丙烯酸钠（SA），50%（w/v）丙烯酰胺（AA），2%（w/v）N，N，N-甲苯乙酰氨基甲酰胺（Bis），和29.2%（w/v）氯化钠（NaCl）。将化合物溶解在双重去离子水中（ddH₂O）。使用表 1中的金额作为参考;准备的解决方案可以根据需要放大或缩小数量。例如，要使 38% （w/v） SA 溶液的 10 mL，将 1.9 g SA 添加到一个分级的 10 mL 气缸中，并将 ddH₂O 添加到 5 mL 的体积中。
   2. 以1.06倍的浓度制备9.4 mL的单体溶液，如表1所示。
      注:在加入起感剂、加速器和抑制剂后，这将导致1倍浓度。单体库存可在4°C下储存长达3个月，或-20°C长期储存。
   3. 在 ddH₂O 中单独制备以下库存溶液:抑制剂 4-羟基-2，2，2，6，6-四甲基乙苯甲酸-1-氧-1-氧醇（4HT），该溶液可分别制备以下库存溶液，使凝胶溶液扩散到组织中，10%（v/v）启动剂四甲基二甲二胺（TEMED），它加速过硫酸铵（APS）和10%（w/v）APS的基生，从而启动凝胶过程。
      注:4HT 和 TEMED 的库存溶液可在 1 mL 等分位中制备，并在 -20°C 下存储至少 6 个月。APS 在长期储存后已发现失去效力，最好在凝胶化前少量（<0.1 mL）制备。
2. 准备消化缓冲液 （50 mM Tris pH 8.0， 25 mM EDTA， 0.5% [w/v] 非离子表面活性剂， 0.8 M NaCl）， 通过结合 25 mL 的 1 M Tris pH 8 （3.03 g Tris 底座在 25 mL dH₂O）， 25 mL EDTA （0.5 m pH 8），2.25克非离子表面活性剂和23.38克NaCl。添加 ddH₂O，总容量为 500 mL。
   注:该解决方案可根据需要向上或向下扩展，并存储在 4°C。蛋白酶K（ProK）将在消化步骤之前立即添加。
3. 将 2.941 克柠酸钠三基二水合物与 500 mL ddH₂O 结合，并在室温 （RT） 下将 pH 调整到 8.0，制备 20 mM 柠酸钠溶液。根据需要扩展库存量。
4. 准备6-（（丙烯）氨基）六氯酸、琥珀酰酯（丙烯酰-X，SE） 的库存溶液;AcX），锚定化合物。将AcX溶解在500μL无水二甲基亚硫酸盐（DMSO）中，最终浓度为10mg/mL。
   注:该溶液可储存在20μL等分的-20°C干燥环境中。
5. 如果不使用市售的缓冲液进行免疫染色，则准备阻塞缓冲液。在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中使用5%（v/v）正常动物血清和0.1%（w/v）非离子表面活性剂的阻断缓冲液，并根据二次抗体的宿主动物选择血清。例如，为山羊中培养的抗体制备500 mL阻断缓冲液，将25 mL的山羊血清、0.45克非离子表面活性剂和1x PBS结合到500 mL的体积。

2. 为 ExPath 准备存档和新鲜准备的临床组织幻灯片

1. 将组织转换为 ExPath 兼容格式。根据试样的准备方式，选择以下四个步骤之一（2.1.1_2.1.4）:FFPE 幻灯片、染色 FFPE 幻灯片或最佳切割温度 （OCT） 溶液中的未固定或固定冷冻组织幻灯片。
   注:这些基于病理样本的标准恢复步骤，并不特定于 ExPath 协议。
   1. FFPE临床样本
      1. 制备 30 mL 的 95% 乙醇、70% 乙醇和 50% 乙醇。测量出 30 mL 的二甲苯、100% 乙醇和 ddH₂O。
      2. 使用钳子将带样品的幻灯片放入 50 mL 锥形中，并添加 15 mL 的二甲苯。将管子盖住，以大约 60 rpm 的速度水平地放在轨道摇床上，并在 RT 下孵育每个溶液 3 分钟。对剩余的 15 mL 二甲苯重复上述步骤。
      3. 重复步骤 2.1.1.2，使用 100% 乙醇、95% 乙醇、70% 乙醇、50% 乙醇和 ddH₂O 代替二甲苯。
   2. 染色和安装的永久幻灯片
      1. 将幻灯片放入 100 mm 培养皿中，并盖上二甲苯。使用剃刀刀片小心地拆下盖玻片。如果盖玻片不易拆下，请将滑片返回到二甲苯，直到盖玻片松开。
      2. 使用 FFPE 示例的步骤进行处理（步骤 2.1.1.1_2.1.1.3）。
         注:对于 H&E 染色幻灯片，在扩展过程中消除污渍。
   3. OCT 溶液中的未固定冷冻组织幻灯片
      1. 将组织固定在-20°C的丙酮中10分钟。
      2. 在 RT 上用 1x PBS 溶液清洗样品 3 次，每次 10 分钟。
   4. 以前固定、冷冻的临床组织幻灯片
      1. 在 RT 孵育幻灯片 2 分钟，以熔化 OCT 溶液。
      2. 在RT处用1x PBS溶液清洗样品3次，每次5分钟。
2. 格式转换后对所有样品进行抗原检索热处理。
   1. 在耐热容器中加入 20 mM 锡酸盐溶液（RT 时 pH 8），如滑动染色罐。
      注:应该有足够的溶液来覆盖安装在幻灯片上的组织（标准滑动染色罐为 50 mL）。
   2. 将云酸盐溶液加热至微波中100°C，并将滑片放入溶液中。立即将容器转移到孵育室，并在60°C孵育30分钟。
      注:可以在此处暂停该协议。幻灯片可以放置在培养皿中，并覆盖在 1x PBS 中，并储存在 4°C 下。
3. 使用标准免疫荧光 （IF）/免疫组织化学 （IHC） 染色方案染色样品。
   注:特定的初级和二级抗体浓度和染色持续时间取决于制造商建议的浓度或特定实验的优化。
   1. 使用疏水笔在幻灯片上的组织部分周围绘制边界，以尽量减少覆盖组织所需的溶液体积。将幻灯片放在足够大的盘子中，以适合幻灯片。对于标准的 3 英寸幻灯片，请使用 100 mm 培养皿。
      注:疏水笔不会干扰样品的聚合或消化过程。
   2. 在37°C下用阻塞缓冲液孵育组织1小时，在RT孵育2小时，或11次孵合4°C，以减少非特异性结合。
   3. 将原抗体稀释至所需浓度的适量制备的阻断缓冲液（或其他首选染色缓冲液）。在RT或37°C下用原抗体溶液孵育组织至少3小时，或在4°C下孵育过夜。
      注:样品应放在加湿容器（如带湿巾的培养皿）中，以防止组织干燥。通常，抗体在200~500 μL的缓冲液中被稀释到1:100~1:500，具体取决于所使用的组织大小和抗体。
   4. 在RT处用准备好的阻塞缓冲液（或其他首选洗涤缓冲液）清洗组织3次，10分钟。
   5. 稀释二级抗体（和300 nM 4⁄，6-二酰胺-2-苯胺醇[DAPI]，如果需要），在制备的阻塞缓冲液（或其他首选染色缓冲液）中，浓度约为10微克/mL。在RT或37°C下孵育二级抗体溶液中的组织至少1小时。
      注:时间可以根据所使用的抗体和组织厚度进行调整。当应用预聚合时，含有氰化染料的二级抗体（Cy3、Cy5、Alexa 647）与ExM协议不兼容。建议的染料包括 Alexa 488（绿色）、Alexa 546（橙色/红色）和 Atto 647N 或 CF633（远红色）。DAPI 必须在扩展后重新应用，因为它在扩展过程中被冲走。
   6. 在RT处用准备好的阻塞缓冲液（或其他首选洗涤缓冲液）清洗组织3次，每次10分钟。
      注:可以在此处暂停该协议。幻灯片可以放置在培养皿中，并覆盖在 1x PBS 中，并储存在 4°C 下。
   7. 使用传统的广域显微镜、共聚焦显微镜或其他首选成像系统执行荧光成像。
      注:此步骤需要通过比较扩展前和扩展后的图像，使用膨胀因子确定生物长度。为了便于扩展后成像，应选择易于识别的感兴趣区域，并收集低倍率和高放大倍率的图像。

3. 标本的原位聚合

1. 在锚固溶液中孵育试样。
   1. 将 1x PBS 中的 AcX 库存溶液稀释至 0.03 mg/mL 中的样品，用于使用非醛固定剂固定样品，或为固定使用醛固定剂的样品稀释 0.1 mg/mL，从而制备锚固溶液（通常为 250 μL 足以覆盖组织部分），它们与 AcX 发生反应的可用胺较少。
   2. 将幻灯片放入 100 mm 培养皿中，将锚固溶液移移到组织上。在RT孵育至少3小时，或在4°C下孵育过夜。
2. 在凝胶溶液中孵育样品。
   1. 准备至少100倍多量的凝胶溶液。每 200 μL，按顺序组合以下溶液:188 μL 的单体溶液，4 μL 的 0.5% 4HT 库存溶液（1:50 稀释，最终浓度:0.01%），4 μL 的 10% TEMED 库存溶液（1:50 稀释，最终浓度 0.2%），以及 4 μL 的 10% APS 库存溶液 （1:50稀释，最终浓度0.2%。
      注:在使用前应立即进行凝胶溶液。溶液应保持在4°C，APS溶液应最后加入，以防止过早凝胶化。
   2. 从组织部分取出多余的溶液，并将幻灯片放入 100 mm 培养皿中。在样品中加入新鲜、冷的凝胶溶液，在4°C下在组织上孵育混合物30分钟，使溶液扩散到组织中。
3. 在样品周围的幻灯片上构建一个造型室（图2A），而不会干扰凝胶溶液。
   1. 使用钻石刀薄切盖玻璃，为凝胶室制作垫片。
      注:为了便于成像后膨胀，垫片应接近组织标本的厚度，以减少组织上方的空白凝胶量。1.5 号玻璃可用于标准临床样品（5~10 μm）。盖玻璃片可以堆叠成更厚的样品。
   2. 使用水滴（±10 μL）固定组织两侧的垫片。
   3. 小心地在幻灯片上盖上玻璃盖，确保避免将气泡困在组织上（图2B）。
4. 在加湿环境中（如带湿巾的封闭培养皿）以 37°C 孵育样品 2 小时。
   注:可以在此处暂停该协议。滑动室可储存在4°C密封的培养皿内。

4. 样品消化

1. 在盖玻片下轻轻滑动剃须刀刀片，然后缓慢地将盖玻片从凝胶表面提起，取下凝胶室的盖子。修剪组织周围的空白凝胶，以尽量减少体积。非对称地切割凝胶，以跟踪同质化后凝胶的方向，因为样品将变为透明。
   1. 在使用前将消化缓冲液（最终浓度 4 U/mL）中的 ProK 稀释 1:200。准备足够的溶液，完全淹没凝胶;四孔塑料细胞培养板的单孔每孔至少需要3 mL。
   2. 在含有消化缓冲液的封闭容器中孵育样品3小时，在60°C下孵育。如果样品在消化过程中未从滑轨上分离，请使用剃刀刀片轻轻取出样品。
      注:试样应完全浸入消化缓冲液中，以防止样品干燥，并放置在可用薄膜密封的带盖容器（小滑动箱、塑料井、培养皿等）中。

5. 样品扩展和成像

1. 使用软漆刷将试样转移到与所需成像系统兼容的容器中，并足够大以容纳完全膨胀的凝胶，如果对倒置系统进行成像，则确保组织与样品侧下放置;如果对直立系统进行成像，则确保组织置于样品侧下，以尽量减少从成像目标到样品的距离。如果需要，请使用软漆刷翻转凝胶。
   注:LED 的侧照明可用于使其在液体中可见。标准 6 孔板可容纳预膨胀直径小于 0.6 厘米的样品。应在倒置系统上使用玻璃底井板进行成像。
2. 在 RT 处将样品在 1x PBS 中清洗 10 分钟。如果需要，在消化过程中用 300 nM DAPI 重新染色样品，以擦去 DAPI 污渍。去除PBS和污渍，在1xPBS中稀释300 nM DAPI，在RT时20分钟，随后在RT用1xPBS洗涤10分钟。
   注:样品可以覆盖1xPBS，并在4°C下储存，然后再继续下一步。
3. 要扩展样品，请更换 PBS，并在 RT 处以超过 ddH₂O（至少最终凝胶体积的 10 倍）清洗 3⁄5 次，每次 10 分钟。
   注:第3次或第4^次洗涤后，标本的扩张应开始停滞。对于存储，为了防止细菌生长，ddH₂O 可以补充 0.002%-0.01% 阿齐德钠 （NaN₃）。在这种情况下，最终扩展系数可逆地降低 10%。
4. 使用传统的广域显微镜、共聚焦显微镜或其他首选成像系统进行荧光成像。
   注:为了防止凝胶漂移，可以从井中取出多余的液体。凝胶也可以固定与1.5~2%的低熔胶胶。在容器中制备1.5⁄2%（w/v）低熔胶甘蔗，其体积是溶液体积的2⁄4倍。将溶液在40°C水浴或微波炉中加热10~20s，以熔化溶液。在凝胶边缘周围移液融化的角胶。在RT或4°C下让角贺汁变硬后，向样品中加入水以防止脱水。

结果

如果协议已成功执行（图1），样品在机械均质化后将显示为扁平和透明的凝胶（图3A），在水中可膨胀3~4.5倍（图3B）。根据最终膨胀因子和成像系统^{使用5，16，}提供±70 nm的有效分辨率。图 4显示了使用 ExPath 协议处理的 5 μm 厚 FFPE 肾脏样...

讨论

在这里，我们介绍ExPath^{协议16，proExM5}的变体，可应用于病理学中最常用的临床活检样本类型，包括FFPE、H&E染色和玻璃玻片上新鲜冷冻的标本。标本的格式转换、抗原检索和免疫染色遵循不特定于 ExPath 的常用协议。与原来的proExM^协议9不同，ExPath依赖于消化缓冲液中EDTA的更高浓度，这改善了形式固定组织的扩展，如最初的ExPath^研?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acetone	Fischer Scientifc	A18-500
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887
Acryloyl-X, SE (AcX)	Invitrogen	A20770
Agarose	Fischer Scientifc	BP160-100
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	HPA001873
Anti-Collagen IV antibody produced in mouse	Santa Cruz Biotech	sc-59814
Anti-Vimentin antibody produced in chicken	Abcam	ab24525
Aqua Hold II hydrophobic pen	Scientific Device	980402
Breast Common Disease Tissue Array	Abcam	ab178113
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248	Nuclear stain
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1
FFPE Kidney Sample	USBiomax	HuFPT072
Forceps
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A	Biotium	20020
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633	Biotium	20121
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010
MAXbind Staining Medium	Active Motif	15253	Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.
MAXblock Blocking Medium	Active Motif	15252	Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.
MAXwash Washing Medium	Active Motif	15254	Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.
Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma Aldrich	M7279
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121	For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063	Multi-well plastic culture dish
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc 15 mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc 50 mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientifc	BP399-1
Plastic Petri Dish (100 mm)	Fischer Scientifc	FB0875713
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate	Sigma Aldrich	408220
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Tris Base	Fischer Scientifc	BP152-1
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Wheat germ agglutinin labeled with CF640R	Biotium	29026
Xylenes	Sigma Aldrich	214736