Vitrification en vrac de gouttelette pour la conservation primaire d'hépatocyte

Résumé

Ce manuscrit décrit une méthode de cryoconservation sans glace pour de grandes quantités d'hépatocytes de rat par laquelle les cellules primaires sont pré-incubées avec des agents cryoprotecteurs à une faible concentration et vitrifiées dans de grandes gouttelettes.

Résumé

La vitrification est une solution de rechange prometteuse sans glace pour la cryoconservation classique de la congélation lente (à environ 1 oC/min) des échantillons biologiques. La vitrification nécessite des taux de refroidissement extrêmement rapides pour assurer la transition de l'eau dans la phase de verre tout en évitant la formation de glace dommageable. Bien que la pré-incubation avec des agents cryoprotecteurs (CPA) puisse réduire le taux critique de refroidissement des échantillons biologiques, des concentrations élevées sont généralement nécessaires pour permettre la cryoconservation sans glace par vitrification. En conséquence, la vitrification est entravée par la toxicité cpA et limitée aux petits échantillons qui peuvent être refroidis rapidement. Il a été récemment démontré que ces limitations inhérentes peuvent être surmontées par la vitrification en vrac des gouttelettes. Utilisant cette nouvelle méthode, les cellules sont d'abord pré-incubées avec une faible concentration intracellulaire de CPA. Tirant parti de la déshydratation osmotique rapide, l'APC intracellulaire est concentré directement avant la vitrification, sans avoir besoin d'équilibrer complètement les concentrations toxiques de CPA. La déshydratation cellulaire est effectuée dans un dispositif fluide et intégrée à la génération continue à haut débit de grosses gouttelettes qui sont vitrifiées dans l'azote liquide. Cette méthode de cryoconservation sans glace avec une toxicité minimale de CPA convient aux grandes quantités de cellules et a comme conséquence la viabilité accrue d'hépatocyte et la fonction métabolique comparée à la cryoconservation lente-congélation classique. Ce manuscrit décrit en détail les méthodes de vitrification réussie des gouttelettes en vrac.

Introduction

La perte de la viabilité cellulaire et de la fonction métabolique après la cryoconservation des hépatocytes est toujours un problème majeur qui limite les applications cliniques^1,2,3. La méthode de référence de la cryoconservation des hépatocytes est la congélation lente, qui est effectuée en pré-incubant les hépatocytes avec CPA (sulfoxide de diméthyle [DMSO], glucose et albumine) et le gel contrôlé subséquent (à environ 1 oC/min) pour températures cryogéniques^4,5. Malgré de nombreuses optimisations signalées, la toxicité de CPA ainsi que les déséquilibres osmotiques préjudiciables pendant le gel et le stress mécanique de la formation de glace demeurent des inconvénients fondamentaux du gel lent^6,7.

Vitrification offre un avantage sur le gel lent dans cette blessure due à la formation de glace est complètement évitée par une transition de phase directe de l'eau dans l'état de verre⁶. Toutefois, pour atteindre la température de transition du verre de l'eau pure (-137 oC), l'eau doit être refroidie à des taux de l'ordre d'un million de degrés Celsius par seconde (c.-à-d. le taux de refroidissement critique) afin d'éviter la formation de glace au-dessus de la température de transition du verre⁸ . L'ajout de CPA peut abaisser le taux critique de refroidissement et augmenter la température de transition de verre des solutions aqueuses⁹. Cependant, même avec des concentrations élevées de CPA (par exemple, 40% v/v DMSO ou plus) des taux de refroidissement rapide sont néanmoins nécessaires pour une vitrification réussie^8,9.

Les taux de refroidissement requis et les concentrations élevées de CPA entraînent deux inconvénients majeurs de la vitrification. Tout d'abord, pour permettre un refroidissement rapide, les échantillons doivent avoir une faible masse thermique. Deuxièmement, pour atteindre des concentrations élevées de CPA tout en évitant les blessures osmotiques, les CPA doivent être introduits lentement et entièrement équilibrés entre les compartiments intra- et extracellulaires⁶. Cela augmente le temps d'exposition des cellules aux CPA toxiques. Ensemble, cela rend la vitrification un processus lourd qui se limite à quelques échantillons de petite taille (microlitres) à la fois. La vitrification des gouttelettes a été proposée comme solution potentielle à ces restrictions. En exposant de minuscules gouttelettes chargées de cellules (nanolitres) à l'azote liquide, le taux de refroidissement est considérablement augmenté, ce qui permet par conséquent une réduction considérable de la concentration de CPA^{10,11,12 ,13,14}. Bien que plusieurs buses à haute fréquence génératrices de gouttelettes pourraient potentiellement être utilisées simultanément, la taille extrêmement petite de gouttelette limite le débit aux microlitres par minute^10,qui empêche la vitrification efficace de grandes cellules volumes avec des taux de traitement plus élevés de magnitudes de l'ordre de millilitres par minute.

Récemment, il a été démontré que ces limitations inhérentes de la vitrification peuvent être surmontées par la vitrification des gouttelettes en vrac¹⁵. Cette nouvelle méthode tire parti de la déshydratation osmotique rapide pour concentrer une concentration intracellulaire de CPA de 7,5% v/v d'éthylène glycol et DMSO immédiatement avant la vitrification, éliminant le besoin d'équilibre complet des concentrations toxiques de CPA. La déshydratation cellulaire est effectuée dans un dispositif fluide par une brève exposition des hépatocytes à une concentration extracellulaire élevée de CPA. Bien que cette exposition provoque une déshydratation osmotique rapide, il est trop court pour que la concentration élevée de CPA se diffuse dans les cellules. Immédiatement après la déshydratation, les cellules sont chargées en gouttelettes qui sont directement vitrifiées dans l'azote liquide. Cette méthode élimine le besoin d'une pleine prise intracellulaire de fortes concentrations de CPA tandis que la concentration extracellulaire élevée de CPA permet la vitrification des gouttelettes de grande taille, ayant pour résultat des volumes de débit élevés avec la toxicité minimale de CPA.

La vitrification des gouttelettes améliore la viabilité directe et à long terme après la préservation, ainsi que la morphologie et la fonction métabolique des hépatocytes de rat primaires par rapport à la cryoconservation classique par congélation lente¹⁵. Ce manuscrit fournit les détails méthodologiques pour la vitrification en vrac des hépatocytes de rat primaire.

Protocole

Les isolements primaires d'hépatocyte pour ce protocole ont été exécutés par le noyau de ressource de cellules (CRC) au Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, Etats-Unis. Le protocole animal (#2011N000111) a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Massachusetts General Hospital.

1. Vitrification des gouttelettes en vrac

1. Préparer les solutions de vitrification.
   1. Ajouter 40 mg d'albumine de sérum bovin (BSA) à 17,0 mL de solution de l'Université du Wisconsin (UW) pour faire la solution de vitrification 1 (V1). Filtre stérile la solution V1 à l'aide d'un filtre de 0,22 m et entreposez-le à 4 oC.
      REMARQUE : L'UW est une solution de conservation d'organe couramment utilisée. Il contient 50 g/L d'amidon hydroxyhyl, 35,83 g/L d'acide lactobionique, 3,4 g/L de phosphate de potassium monobasic, 1,23 g/L de sulfate de magnésium heptahydrate, 17,83 g/L de pentahydrate, 1,34 g/L d'adénosine, 0,136 g/L allopurinol, 0,992 g/L glutathitotal, 5,61 g/L /L hydroxyde de potassium, et hydroxyde de sodium pour ajuster le pH à 7,4.
   2. Combinez 7,0 ml d'UW, 6,5 ml de DMSO, 6,5 ml d'éthylène glycol (EG), 40 mg de BSA et 5,48 g de saccharose pour faire la solution de vitrification 2 (V2). Filtre stérile de la solution V2 à l'aide d'un filtre de 0,22 m. Chargez 3,5 ml de solution V2 filtrée stérile dans une seringue de 3 ml et entreposez-la à 4 oC.
      REMARQUE : Pour faciliter la dissolution des CPA, les solutions sont préparées en plus grande quantité que nécessaire.
2. Préparer l'appareil de vitrification des gouttelettes en vrac.
   1. Pour préparer l'aiguille de mélange, coupez d'abord le long d'un côté de la manche grise extérieure de l'aiguille de mélange, puis pliez la manche ouverte pour l'enlever de l'aiguille de mélange.
   2. Glissez deux sections de tubes en silicone de 25 mm au-dessus des entrées de l'aiguille de mélange et fixez leur position avec de la colle (Figure 1A).
   3. Couper l'aiguille sur une longueur de 20 mm (c.-à-d. la longueur de l'hélice de mélange interne) comme le montre la figure 1A.
      REMARQUE : La longueur de l'aiguille de mélange est proportionnelle au volume à l'intérieur de l'aiguille et peut donc être modifiée pour contrôler le temps d'exposition des hépatocytes à la solution de concentration de CPA élevée.
   4. Insérer la prise de coupure de l'aiguille de mélange dans une aiguille d'injection de 20 G (figure 1B).
      REMARQUE : La taille de l'aiguille d'injection influence la taille des gouttelettes.
   5. Stériliser l'assemblage de l'aiguille de mélange en autoclant.
   6. Remplissez un dewar stérile d'azote liquide. Stérilisez l'extérieur du Dewar avec l'isopropanol avant de placer le Dewar dans une hotte stérile de culture cellulaire à flux laminaire.
      REMARQUE : La contamination est une considération importante lors de l'exposition directe des gouttelettes à l'azote liquide. Bien qu'il n'y ait pas eu de contamination à l'aide d'azote liquide non stérilisé dans le protocole actuel, l'azote liquide peut être filtré ou irradié pour assurer la stérilité si nécessaire¹⁶.
   7. Insérer un entonnoir avec le même diamètre extérieur que le diamètre intérieur de l'azote liquide Dewar dans un tube conique de 50 ml pour créer le dispositif de collecte des gouttelettes (Figure 1CetE).
   8. Immerger le dispositif de collecte des gouttelettes dans l'azote liquide en le pressant lentement dans sa position verticale finale à l'aide de gros forceps. Assurez-vous que le tube conique repose en position verticale au bas du Dewar(Figure 1DetE).
      REMARQUE : L'entonnoir doit rester inséré et reposer sur le tube conique. Le niveau d'azote liquide doit être de 1 cm au-dessous de la hauteur de l'entrée de l'entonnoir, comme le montre la figure 1D.
   9. Montez une pompe à seringues en position verticale sur le mur du capot de culture cellulaire en attachant une ficelle des pieds de la pompe à seringues aux vis dépassant du mur du capot de culture cellulaire.
   10. Placez l'azote liquide Dewar avec le dispositif de collecte des gouttelettes sous la pompe à seringues montée verticalement (figure 1E).
3. Pré-incubation avec CPA.
   1. Après avoir obtenu des hépatocytes de rat fraîchement isolés, comptez la concentration de stock par exclusion bleue de Trypan et prenez 40 millions d'hépatocytes viables.
      REMARQUE : La manipulation douce des hépatocytes en suspension est essentielle pour empêcher la mort cellulaire.
   2. Centrifugeuse à 50 x g pendant 5 min sans frein.
   3. Aspirer le supernatant et resuspendre les hépatocytes dans 3,4 ml de solution V1.
   4. Incuber sur glace pendant 3 min.
   5. Ajouter 150 L de DMSO et 150 OL d'EG aux hépatocytes et mélanger délicatement.
   6. Incuber sur glace pendant 3 min.
   7. Encore une fois, ajouter 150 L de DMSO et 150 OL d'EG aux hépatocytes et mélanger délicatement.
   8. Chargez 3,5 ml dans une seringue de 3 ml.
4. Effectuer la vitrification.
   1. Insérez la seringue avec des hépatocytes pré-incubés et les seringues de solution V2 sur l'adaptateur de pompe à seringues.
   2. Fixez deux adaptateurs de barbe de verrouillage Luer femelles aux seringues et faites glisser le tube en silicone de l'assemblage de l'aiguille de mélange sur les raccords de barbe(Figure 1F).
   3. Placez l'ensemble de l'assemblage dans la pompe à seringues (Figure 1E).
   4. Trois min après la dernière addition de DMSO et EG aux hépatocytes, démarrez la pompe à 2 mL/min.
   5. Arrêtez la pompe après que tous les hépatocytes ont été ajoutés à l'azote liquide.

2. Stockage cryogénique

1. Perforer 10 petits trous dans le couvercle d'un tube conique de 50 ml à l'aide d'une aiguille de 20 G et envelopper l'extérieur du couvercle avec un film flexible, comme le montre la figure 1B. Cela crée une valve qui permet d'échapper à l'évaporation des restes d'azote liquide.
2. Pour recueillir les gouttelettes d'hépatocyte vitrifié, retirez d'abord l'entonnoir de l'azote liquide Dewar. Ensuite, utilisez de longs forceps pour prendre le tube conique qui contient les gouttelettes de l'azote liquide et versez lentement l'excès d'azote liquide du tube conique.
3. Fermez le tube conique avec le couvercle perforé et placez directement le tube conique fermé avec des gouttelettes d'hépatocyte vitrifiédans de nouveau dans l'azote liquide Dewar.
4. Transférer le tube conique de l'azote liquide dans un cryotank à vapeur d'azote liquide.

3. Réchauffement des gouttelettes d'hépatocytevits

1. Préparer la solution de réchauffement.
   1. Dissoudre 17,13 g de saccharose dans 100 ml de médias de culture d'hépatocytes DMEM pour faire la solution de réchauffement. Filtre stérile la solution de réchauffement à l'aide d'un filtre de 0,22 m et chaude à 37 oC.
2. Réchauffez les hépatocytes.
   1. Prenez le tube conique avec des hépatocytes vitrifiés du cryotank et transportez-le dans un dewar d'azote liquide au capot de culture cellulaire.
   2. Desserrer légèrement le bouchon et remettre le tube conique dans l'azote liquide.
   3. Ajouter les gouttelettes d'hépatocyte vitrifiées à un bécher vide, ajouter instantanément la solution de réchauffement chaude (37 oC) et remuer immédiatement pendant 10 s.
      REMARQUE : Il est essentiel de travailler rapidement pour éviter le gel pendant leréchauffement. Selon les exigences de l'étude, quelques gouttelettes vitrifiées peuvent être réchauffées à la fois.
3. Déchargez la solution de réchauffement.
   1. Diviser la solution de réchauffement avec des hépatocytes sur deux tubes coniques de 50 ml.
   2. Centrifuger les deux tubes coniques pendant 2 min à 100 x g à 4 oC sans frein.
   3. Aspirez le supernatant pour laisser un volume total de 12,5 ml en utilisant la marque de graduation du tube conique comme référence et ajoutez 12,5 mL de DMEM glacé par tube conique pour diluer la solution de réchauffement à 50%.
   4. Resuspendre les hépatocytes et incuber sur la glace pendant 3 min.
   5. Ajouter 25 ml de DMEM glacé par tube conique pour diluer la solution de réchauffement à 25%.
   6. Centrifugeuse de 5 min à 50 x g à 4 oC sans frein.
   7. Aspirer le supernatant et resuspendre les hépatocytes en 2 ml du milieu de culture désiré pour une utilisation.
      REMARQUE : La centrifugation de gradient de densité peut être employée pour enlever les hépatocytes morts de la suspension de cellules si désiré.

Résultats

Des hépatocytes primaires fraîchement isolés de cinq foies de rat différents ont été utilisés pour une comparaison directe de la vitrification des gouttelettes en vrac à la cryoconservation classique en utilisant les protocoles prééminents de congélation lente rapportés dans la littérature^{4, 5}. En bref, les hépatocytes ont été suspendus dans UW complétés avec BSA (2.2 mg/mL), glucose (333 mM), et DMSO (10% v/v) et congelés à l'aide d'un cong?...

Discussion

La cryoconservation des hépatocytes par congélation lente entraîne une viabilité réduite et une fonction métabolique. Vitrification offre une alternative prometteuse pour la cryoconservation classique, comme les dommages de congélation est complètement évité⁹. Cependant, la pré-incubation avec les CPA est nécessaire pour abaisser le taux de refroidissement critique⁸. Par conséquent, la vitrification est entravée par la toxicité^{cpA 17} e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips	Fisher Scientific	14-823-435
Beaker	Sigma-Aldrich	CLS1000-250
Belzer UW Cold Storage Solution	Bridge to Life	BUW-001
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP	Cole-Parmer	EW-45508-12
Cryogentic stroage tank / Cryotank	Chart Industries	MVE 800
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM, powder, high glucose, pyruvate	Life Technologies	12800-082
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	107-21-1
Extra long forceps	Fisher Scientific	10-316C
Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure	Fisher Scientific	06-443-18
Fishing line	Stren	SOFS4-15
Liquid nitrogen	Airgas	7727-37-9
Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14	Cole-Parmer	EW-96410-14
Mix Tips, For Use With 3HPW1	Grainger	3WRL7
Nalgene Polypropylene Powder Funnel	ThermoFisher	4252-0100
Needle 20 ga	Becton Dickinson (BD)	305175
Parafilm M - Flexible film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Razor Blade	Fisher Scientific	12-640
Spatula	Cole-Parmer	EW-06369-18
Steriflip sterile filter	Fisher Scientific	SE1M179M6
Sucrose (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S5-500
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container	ThermoFisher	2122