Vitrificazione delle gocce di gocciolamento per la conservazione degli epatiti primari

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un metodo di crioconservazione senza ghiaccio per grandi quantità di epatociti di ratto per cui le cellule primarie sono pre-incubate con agenti crioprotettivi a bassa concentrazione e vetrificate in grandi goccioline.

Abstract

La vetrificazione è una promettente alternativa senza ghiaccio per la crioconservazione classica a freddo (a circa 1 omin/min) di campioni biologici. La vetrificazione richiede velocità di raffreddamento estremamente veloci per ottenere la transizione dell'acqua nella fase del vetro, evitando la formazione dannosa di ghiaccio. Sebbene la pre-incubazione con agenti crioprotettivi (CPA) possa ridurre il tasso di raffreddamento critico dei campioni biologici, sono generalmente necessarie elevate concentrazioni per consentire la crioconservazione senza ghiaccio mediante vitrificazione. Di conseguenza, la vetrificazione è ostacolata dalla tossicità della CPA e limitata a piccoli campioni che possono essere raffreddati rapidamente. Recentemente è stato dimostrato che questi limiti intrinseci possono essere superati dalla vetrificazione delle gocce di gocciolamento. Utilizzando questo nuovo metodo, le cellule vengono prima pre-incubate con una bassa concentrazione di CPA intracellulare. Sfruttando una rapida disidratazione osmotica, il CPA intracellulare è concentrato direttamente prima della vitrificazione, senza la necessità di equilibrare pienamente le concentrazioni di CPA tossiche. La disidratazione cellulare viene eseguita in un dispositivo fluido e integrata con la generazione continua ad alta velocità effettiva di goccioline di grandi dimensioni che sono vetrificate in azoto liquido. Questo metodo di crioconservazione senza ghiaccio con tossicità CPA minima è adatto per grandi quantità di cellule e si traduce in una maggiore vitalità epatocite e funzione metabolica rispetto alla crioconservazione classica a congelamento lento. Questo manoscritto descrive in dettaglio i metodi per il successo della vetrificazione delle gocce di gocciolamento.

Introduzione

La perdita di vitalità cellulare e funzione metabolica dopo la crioconservazione degli epatociti è ancora un problema importante che limita le applicazioni cliniche^1,2,3. Il metodo di riferimento della crioconservazione dell'epatocito è il congelamento lento, che viene eseguito pre-incubando gli epatociti con CPA (solfuro dimetilo [DMSO], glucosio e albumina) e il successivo congelamento del tasso controllato (a circa 1 temperature criogeniche^4,5. Nonostante molte ottimizzazioni segnalate, tossicità CPA insieme a squilibri osmotici dannosi durante il congelamento e lo stress meccanico della formazione del ghiaccio rimangono svantaggi fondamentali di congelamento lento^6,7.

La vetrificazione offre un vantaggio rispetto al congelamento lento in quanto la lesione dovuta alla formazione di ghiaccio è completamente evitata da una transizione di fase diretta dell'acqua nello stato del vetro⁶. Tuttavia, per raggiungere la temperatura di transizione del vetro di acqua pura (-137 gradi centigradi), l'acqua deve essere raffreddata a velocità nell'ordine di un milione di gradi Celsius al secondo (cioè la velocità di raffreddamento critica) per evitare la formazione di ghiaccio al di sopra della temperatura di transizione del vetro⁸ . L'aggiunta di CPA può ridurre la velocità di raffreddamento critica e aumentare la temperatura di transizione del vetro delle soluzioni acquose⁹. Tuttavia, anche con elevate concentrazioni di CPA (ad esempio, 40% v/v DMSO o superiore) i tassi di raffreddamento rapido sono comunque necessari per il successo della vitrificazione^8,9.

I tassi di raffreddamento richiesti e le elevate concentrazioni di CPA provocano due importanti inconvenienti della vetrificazione. In primo luogo, per consentire un raffreddamento rapido, i campioni devono avere una massa termica bassa. In secondo luogo, per raggiungere elevate concentrazioni di CPA evitando lesioni osmotiche, i CPA devono essere lentamente introdotti ed equilibrati completamente tra i compartimenti intra-eextracellulari⁶. Questo aumenta il tempo di esposizione delle cellule alle CPA tossiche. Insieme, questo rende la vitrificazione un processo ingombrante che è limitato a pochi campioni di piccole dimensioni (microlitri) alla volta. Il vetrificazione delle goccioline è stata proposta come una potenziale soluzione a tali restrizioni. Esponendo piccole goccioline cariche di cellule (nanolitri) all'azoto liquido, il tasso di raffreddamento è notevolmente aumentato, il che consente di conseguenza una notevole riduzione della concentrazione di CPA^{10,11,12 ,13,14}. Anche se più ugelli che generano gocciolette ad alta frequenza potrebbero potenzialmente essere utilizzati simultaneamente, la dimensione estremamente ridotta delle gocciolamenti limita la velocità effettiva ai microlitri al minuto¹⁰, il che preclude una vetrificazione efficiente delle grandi cellule volumi con grandi quantità di tassi di lavorazione più elevati nell'ordine dei millilitri al minuto.

Recentemente è stato dimostrato che questi limiti intrinseci di vetrificazione possono essere superati da vetrificazione gocciolamento alla rinfusa¹⁵. Questo nuovo metodo sfrutta la rapida disidratazione osmotica per concentrare una concentrazione intracellulare di CPA del 7,5% v/v glicole di etilene e DMSO immediatamente prima della vitrificazione, eliminando la necessità di un completo equilibrato di concentrazioni di CPA tossici. La disidratazione cellulare viene eseguita in un dispositivo fluido da una breve esposizione degli epatociti a un'alta concentrazione extracellulare di CPA. Anche se questa esposizione provoca una rapida disidratazione osmotica, è troppo breve per l'alta concentrazione di CPA per diffondersi nelle cellule. Immediatamente dopo la disidratazione, le cellule vengono caricate in goccioline che sono direttamente vetrificate in azoto liquido. Questo metodo elimina la necessità di un assorbimento intracellulare completo di alte concentrazioni di CPA, mentre l'elevata concentrazione extracellulare di CPA consente la vitrificazione di goccioline di grandi dimensioni, con conseguenti elevati volumi di throughput con una tossicità CPA minima.

La vetrificazione del vetrino delle gocce migliora la vitalità diretta e a lungo termine dopo la conservazione, così come la morfologia e la funzione metabolica degli epatociti del ratto primario rispetto alla crioconservazione classica con congelamento lento¹⁵. Questo manoscritto fornisce i dettagli metodologici per la vetrificazione delle gocce di rattociti primari.

Protocollo

I principali isolati di epatociti per questo protocollo sono stati eseguiti dal Cell Resource Core (CRC) presso il Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. Il protocollo sugli animali (#2011N000111) è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Massachusetts General Hospital.

1. Vitrificazione delle gocce

1. Preparare le soluzioni di vetrificazione.
   1. Aggiungere 40 mg di albumina di siero bovino (BSA) a 17,0 mL della soluzione dell'Università del Wisconsin (UW) per fare la soluzione di vitrificazione 1 (V1). Sterile filtrare la soluzione V1 utilizzando un filtro da 0,22 m e conservare a 4 gradi centigradi.
      NOTA: UW è una soluzione di conservazione degli organi di uso comune. Contiene 50 g/L di amido di idrossiema, 35,83 g/L di acido lattobionico, 3,4 g/L di fosfato di potassio monobasico, 1,23 g/L di solfato di magnesio eptahydrato, 17,83 g/l raffinose pentahydrate, 1,34 g/l di adenosina, 0,136 g/L allopurinol, 0,992 g/L glutathione totale, 5,61 g/L /L idrossido di potassio e idrossido di sodio per regolare il pH a 7,4.
   2. Combina 7,0 mL di UW, 6,5 mL di DMSO, 6,5 mL di glicole di etilene (EG), 40 mg di BSA e 5,48 g di saccarosio per fare la soluzione di vitrificazione 2 (V2). Filtrare sterilmente la soluzione V2 utilizzando un filtro da 0,22 m. Caricare 3,5 mL di soluzione V2 filtrata sterile in una siringa da 3 mL e conservare a 4 gradi centigradi.
      NOTA: per facilitare la scioglimento dei CPA, le soluzioni vengono preparate in quantità maggiori del necessario.
2. Preparare l'apparato di vitrificazione delle gocciole di massa.
   1. Per preparare l'ago di miscelazione, prima tagliare lungo un lato della manica grigia esterna dell'ago di miscelazione, quindi piegare la manica aperta per rimuoverlo dall'ago di miscelazione.
   2. Far scorrere due sezioni di tubi in silicone da 25 mm sulle insenature dell'ago di miscelazione e fissare la loro posizione con la colla (Figura 1A).
   3. Tagliare l'ago a una lunghezza di 20 mm (cioè la lunghezza dell'elica di miscelazione interna) come mostrato nella Figura 1A.
      NOTA: La lunghezza dell'ago di miscelazione è proporzionale al volume all'interno dell'ago e quindi può essere modificata per controllare il tempo di esposizione degli epatociti alla soluzione di concentrazione di alto CPA.
   4. Inserire la presa di taglio dell'ago di miscelazione in un ago di iniezione da 20 G (Figura 1B).
      NOTA: La dimensione dell'ago di iniezione influenza la dimensione delle goccioline.
   5. Sterilizzare l'assemblaggio dell'ago di miscelazione automatizzando l'autoclaving.
   6. Riempire un Dewar sterile con azoto liquido. Sterilizzare l'esterno del Dewar con isopropanolo prima di collocare il Dewar in una sterile cappa di coltura cellulare flusso laminare.
      NOTA: La contaminazione è una considerazione importante durante l'esposizione diretta delle goccioline all'azoto liquido. Anche se non vi è stata contaminazione utilizzando azoto liquido non sterilizzato nell'attuale protocollo, l'azoto liquido può essere filtrato o irradiato per assicurare la sterilità se necessario¹⁶.
   7. Inserire un imbuto con lo stesso diametro esterno del diametro interno dell'azoto liquido Dewar in un tubo conico da 50 mL per creare il dispositivo di raccolta dellegoccioline( Figura 1C-E).
   8. Immergere il dispositivo di raccolta delle gocciole nell'azoto liquido premendolo lentamente verso il basso nella sua posizione verticale finale utilizzando grandi pinze. Assicurarsi che il tubo conico si trovi in posizione verticale nella parte inferiore del Dewar(Figura 1D-E).
      NOTA: L'imbuto deve rimanere inserito e appoggiato sul tubo conico. Il livello di azoto liquido deve essere di 1 cm al di sotto dell'altezza di inserimento dell'imbuto, come illustrato nella Figura 1D.
   9. Montare una pompa di siringa in posizione verticale sulla parete del cofano di coltura cellulare legando una corda dai piedi della pompa di siringa alle viti sporgenti dalla parete cofano coltura coltura cellulare.
   10. Posizionare l'azoto liquido Dewar con il dispositivo di raccolta delle gocciole sotto la pompa della siringa montata verticalmente (Figura 1E).
3. Pre-incubare con CPA.
   1. Dopo aver ottenuto epatociti di ratto appena isolati, contare la concentrazione di stock da Trypan blue exclusion e prendere 40 milioni di epatociti vitali.
      NOTA: La manipolazione delicata degli epatociti in sospensione è fondamentale per prevenire la morte delle cellule.
   2. Centrifuga a 50 x g per 5 min senza freno.
   3. Aspirare il supernatante e risospendere gli epatociti in 3.4 mL di soluzione V1.
   4. Incubare sul ghiaccio per 3 min.
   5. Aggiungete 150 l di DMSO e 150-L di EG agli epatociti e mescolate delicatamente.
   6. Incubare sul ghiaccio per 3 min.
   7. Aggiungere nuovamente 150 L di DMSO e 150 L di EG agli epatociti e mescolare delicatamente.
   8. Caricare 3,5 mL in una siringa da 3 mL.
4. Eseguire la vetrificazione.
   1. Inserire la siringa con epatociti pre-incubati e le siringhe della soluzione V2 sull'adattatore della pompa della siringa.
   2. Attaccare due adattatori tubo di blocco Luer femminile alle siringhe e far scorrere il tubo in silicone dell'assemblaggio dell'ago di miscelazione sopra i raccordi a barre (Figura 1F).
   3. Posizionare l'intero assieme nella pompa della siringa (Figura 1E).
   4. Tre min dopo l'ultima aggiunta di DMSO e EG agli epatociti, avviare la pompa a 2 mL/min.
   5. Fermare la pompa dopo che tutti gli epatociti sono stati aggiunti all'azoto liquido.

2. Stoccaggio criogenico

1. Foratura 10 piccoli fori nel coperchio di un tubo conico 50 mL utilizzando un ago da 20 G e avvolgere l'esterno del coperchio con una pellicola flessibile, come mostrato nella Figura 1B. Questo crea una valvola che consente la fuoriuscita dell'evaporazione dell'azoto liquido rimanente.
2. Per raccogliere le goccioline di epatociti vetrificati, rimuovere prima l'imbuto dall'azoto liquido Dewar. Successivamente, utilizzare le lunghe pinze per prendere il tubo conico che contiene le goccioline fuori dall'azoto liquido e lentamente versare l'azoto liquido in eccesso dal tubo conico.
3. Chiudere il tubo conico con il coperchio forato e posizionare direttamente il tubo conico chiuso con goccioline di epatociti vetrificate nel liquido azoto Dewar.
4. Trasferire il tubo conico dall'azoto liquido in un criocarro liquido vapore di azoto.

3. Riscaldamento delle goccioline vetrificate di epatociti

1. Preparare la soluzione di riscaldamento.
   1. Sciogliere 17,13 g di saccarosio in 100 mL di media di coltura epatociti DMEM per rendere la soluzione di riscaldamento. Sterile filtrare la soluzione di riscaldamento utilizzando un filtro da 0,22 m e riscaldare a 37 gradi centigradi.
2. Riscaldare gli epatociti.
   1. Prendi il tubo conico con epatociti vetrificati dal criotank e trasportalo in un azoto liquido Dewar alla cappa della coltura cellulare.
   2. Allentaleggermente il tappo e rimettere il tubo conico nell'azoto liquido.
   3. Aggiungere le goccioline vetrificate di epatocito a un becher vuoto, aggiungere istantaneamente la soluzione calda (37 gradi centigradi) e mescolare immediatamente per 10 s.
      NOTA: È fondamentale lavorare rapidamente per evitare il congelamento durante il riscaldamento. A seconda dei requisiti di studio, alcune di tutte le goccioline vetrificate possono essere ririscaldate contemporaneamente.
3. Scaricare la soluzione di riscaldamento.
   1. Dividere la soluzione di riscaldamento con epatociti su due tubi conici da 50 mL.
   2. Centrifugare i due tubi conici per 2 min a 100 x g a 4 gradi centigradi senza freno.
   3. Aspirare il superatante a lasciare un volume totale di 12,5 mL utilizzando il marchio di graduazione del tubo conico come riferimento e aggiungere 12,5 mL di ghiaccio freddo DMEM per tubo conico per diluire la soluzione di riscaldamento al 50%.
   4. Risospendere gli epatociti e incubare sul ghiaccio per 3 min.
   5. Aggiungere 25 mL di ghiaccio freddo DMEM per tubo conico per diluire la soluzione di riscaldamento al 25%.
   6. Centrifuga per 5 min a 50 x g a 4 gradi centigradi senza freno.
   7. Aspirare il supernatante e risospendere gli epatociti in 2 mL del mezzo di coltura desiderato per l'uso.
      NOTA: La centrifugazione del gradiente di densità può essere utilizzata per rimuovere gli epatociti morti dalla sospensione cellulare, se lo si desidera.

Risultati

Gli epatociti primari appena isolati provenienti da cinque diversi fegati di ratto sono stati utilizzati per un confronto diretto tra la vetrificazione delle goccioline sfuse e la crioconservazione classica utilizzando i protocolli di congelamento lento preminenti riportati nella letteratura^{4, 5.}In breve, gli epatociti sono stati sospesi in UW integrati con BSA (2,2 mg/mL), glucosio (333 mM) e DMSO (10% v/v) e congelati con un congelatore a tasso controllato. Do...

Discussione

La crioconservazione degli epatociti con congelamento lento si traduce in ridotta vitalità e funzione metabolica. La vetrificazione offre un'alternativa promettente per la crioconservazione classica, poiché il congelamento delle lesioni è completamente evitato⁹. Tuttavia, la pre-incubazione con CPA è necessaria per ridurre la velocità di raffreddamento critica⁸. Di conseguenza, la vetrificazione è ostacolata dalla tossicità CPA¹⁷ e limitata a ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips	Fisher Scientific	14-823-435
Beaker	Sigma-Aldrich	CLS1000-250
Belzer UW Cold Storage Solution	Bridge to Life	BUW-001
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP	Cole-Parmer	EW-45508-12
Cryogentic stroage tank / Cryotank	Chart Industries	MVE 800
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM, powder, high glucose, pyruvate	Life Technologies	12800-082
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	107-21-1
Extra long forceps	Fisher Scientific	10-316C
Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure	Fisher Scientific	06-443-18
Fishing line	Stren	SOFS4-15
Liquid nitrogen	Airgas	7727-37-9
Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14	Cole-Parmer	EW-96410-14
Mix Tips, For Use With 3HPW1	Grainger	3WRL7
Nalgene Polypropylene Powder Funnel	ThermoFisher	4252-0100
Needle 20 ga	Becton Dickinson (BD)	305175
Parafilm M - Flexible film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Razor Blade	Fisher Scientific	12-640
Spatula	Cole-Parmer	EW-06369-18
Steriflip sterile filter	Fisher Scientific	SE1M179M6
Sucrose (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S5-500
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container	ThermoFisher	2122