Tri cellulaire activée par fluorescence pour l’isolement des populations de cellules sclérosiennes

Résumé

Les coraux créent des écosystèmes de biodiversèses importants pour les humains et les organismes marins. Cependant, nous ne comprenons toujours pas le plein potentiel et la fonction de nombreuses cellules coralliennes. Ici, nous présentons un protocole développé pour l’isolement, l’étiquetage et la séparation des populations de cellules coralliennes pierreuses.

Résumé

Les récifs coralliens sont menacés en raison de facteurs de stress anthropiques. La réponse biologique du corail à ces facteurs de stress peut se produire au niveau cellulaire, mais les mécanismes ne sont pas bien compris. Pour étudier la réponse des coraux aux facteurs de stress, nous avons besoin d’outils pour analyser les réponses cellulaires. En particulier, nous avons besoin d’outils qui facilitent l’application d’essais fonctionnels pour mieux comprendre comment les populations cellulaires réagissent au stress. Dans la présente étude, nous utilisons le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) pour isoler et séparer différentes populations cellulaires dans les coraux pierreux. Ce protocole comprend : (1) la séparation des tissus coralliens du squelette, (2) la création d’une suspension à cellule unique, (3) l’étiquetage des cellules coralliennes à l’aide de divers marqueurs pour la cytométrie des débits, et (4) les stratégies de gating et de tri cellulaire. Cette méthode permettra aux chercheurs de travailler sur les coraux au niveau cellulaire pour l’analyse, les essais fonctionnels et les études d’expression génique de différentes populations cellulaires.

Introduction

Les récifs coralliens sont l’un des écosystèmes les plus importants sur Terre. Ils facilitent la biodiversité en fournissant des habitats essentiels pour les poissons et les invertébrés et sont essentiels pour soutenir les communautés anthropiques en fournissant des moyens de subsistance alimentaires et économiques grâce au tourisme¹. En tant que principal constructeur de récifs coralliens, l’animal corallien (Phylum: Cnidaria) aide également les communautés côtières en créant de grands cadres de carbonate de calcium qui atténuent les dommages causés par les vagues et les tempêtes².

Les coraux à l’âge adulte sont des animaux sessiles qui accueillent un large éventail de partenaires endosymbiotiques, y compris les virus, l’archaea, les bactéries, les protistes, les champignons, et plus particulièrement, les membres de la famille algale dinoflage Symbiodiniaceae³. Les changements dans l’environnement peuvent causer des déséquilibres dans cette communauté, entraînant souvent des épidémies et le blanchiment des coraux dans lesquels les Symbiodiniaceae symbiotiques sont expulsés de la colonie de corail, éliminant ainsi la principale source de nutrition pour le corail. Ces deux scénarios causent souvent la mort de l’hôte corallien^4,5,6. Les effets des facteurs de stress induits par l’anththénie, tels que le changement climatique rapide, accélèrent les décès massifs de coraux, ce qui entraîne un déclin mondial des récifs coralliens⁷.

Récemment, de nombreuses méthodes différentes ont été développées pour aider à atténuer la perte de récifs coralliens. Ces méthodes comprennent l’aménagement de coraux sur les récifs existants, la traversée génétique à l’aide de génotypes tolérants thermiquement, et la manipulation cellulaire des communautés microbiennes et symbiotiques hébergées dans le corail^8,9. Malgré ces efforts, beaucoup reste inconnu sur la diversité des cellules coralliennes et la fonction cellulaire^10,11,12,13. Une compréhension approfondie de la diversité de type de cellules coralliennes et de la fonction cellulaire est nécessaire pour comprendre comment l’organisme corallien se comporte dans des conditions normatives et stressantes. Les efforts visant à maximiser l’efficacité de la restauration et de la préservation bénéficieront d’une meilleure compréhension de la façon dont la diversité cellulaire et le fonctionnement des gènes sont couplés.

Les travaux antérieurs sur la diversité et la fonction cellulaires ont principalement porté sur les études histologiques et l’échantillonnage de l’ARN de tissu entier^14,15,16,17. Pour obtenir plus de détails sur la fonction spécifique de type cellulaire dans les coraux, il doit y avoir des méthodes pour l’isolement de populations spécifiques de cellules coralliennes vivantes. Ceci a été fait avec succès dans les organismes modèles non classiques au moyen de la technologie de cytométrie de débit activée par fluorescence (FACS)¹⁸. FACS utilise une combinaison de lasers réglés à différentes longueurs d’onde pour mesurer différentes propriétés cellulaires endogènes au niveau de la cellule unique comme la taille relative des cellules, la granularité cellulaire et l’autofluorescence. En outre, les cellules peuvent être marquées par des composés étiquetés fluorescents pour mesurer les propriétés spécifiques et souhaitées^18,19.

Jusqu’à présent, l’application de la cytométrie des débits aux cellules coralliennes a été principalement pour l’analyse de Symbiodiniaceae symbiotique et d’autres populations bactériennes en utilisant leur forte, autofluorescence naturelle^20,21,22. FACS a également été utilisé pour estimer la taille du génome corallien en utilisant le signal fluorescent marqueur d’ADN par rapport aux cellules d’organisme modèle de référence^23,24. L’application efficace du FACS fournit trois outils distincts qui sont utiles pour les études de biologie cellulaire : 1) la description morphologique et fonctionnelle des cellules simples ; 2) l’identification, la séparation et l’isolement de populations cellulaires spécifiques pour des études en aval; et 3) l’analyse des tests fonctionnels au niveau de la cellule unique.

Le développement et l’application de divers marqueurs fluorescents exogènes pour l’étude des cellules coralliennes restent presque inexplorés. Ces marqueurs peuvent inclure des protéines étiquetées, des substrats marqués pour les enzymes ou des réponses fluorescentes à d’autres composés. Ces marqueurs peuvent être utilisés pour identifier les types de cellules qui ont des propriétés uniques, telles que la mise en évidence des cellules qui produisent des quantités variables d’une fonction spécifique compartiment cellulaire, comme les lysosomes. Un autre exemple est l’utilisation de perles étiquetées fluorescentes pour identifier fonctionnellement les cellules compétentes pour la phagocytose, ou l’engloutissement d’un agent pathogène ciblé²⁵. Les populations de cellules actives dans les réponses immunitaires peuvent être facilement identifiées par FACS après l’engloutissement de ces perles exogènement appliquées. Tandis que les méthodes histologiques traditionnelles exigent le tissu préservé et beaucoup d’heures pour approximativer le pourcentage de cellules positives pour l’engloutissement de perle, un essai fonctionnel de FACS pour l’engloutissement d’agent pathogène peut être exécuté relativement rapidement sur des cellules vivantes isolées. En plus d’étudier les réponses spécifiques aux cellules au stress, cette technologie a le potentiel de clarifier l’expression spécifique aux gènes et d’éclairer l’histoire évolutive et développementale des types cellulaires entièrement uniques aux cnidarians, tels que les calicoblastes et les cnidocytes.

Récemment, nous avons effectué un dépistage intensif de plus de 30 marqueurs cellulaires qui ont abouti à l’identification de 24 qui sont capables d’étiqueter les cellules coralliennes, dont 16 sont utiles pour distinguer les populations uniques¹⁸, ce qui en fait des grappes de différenciation (CD). Ici, nous décrivons le processus d’isolement des cellules coralliennes dans pocillopora damicornis de l’enlèvement des cellules du squelette de carbonate de calcium à l’identification et l’isolement de populations cellulaires spécifiques avec FACS (figure 1).

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Protocole

1. Dissociation des tissus du squelette de corail par aérographe et compresseur

REMARQUE : Effectuez des marches sur la glace et protégez les mains avec des gants.

1. Assembler le kit d’aérographe en connectant le compresseur d’air, le tuyau et l’aérographe(figure 2). Réglez la jauge de pression entre 276 et 483 kPa.
   REMARQUE : Le compresseur et le tuyau d’air recommandés pour cette étude ont été prédéfinis à une pression maximale de 393 kPa. L’utilisation à l’extérieur de cette plage de 276-483 kPa peut entraîner soit un retrait inadéquat des cellules du squelette, soit une rupture des membranes cellulaires. Cette aire de répartition peut différer pour chaque espèce et nécessiter un test de viabilité. Un test de viabilité peut être effectué avec un sous-ensemble de la boue cellulaire avec un hémocytomètre simple et un test d’exclusion de teinture de 4, 6,6-diamidino-2-2 (DAPI), visualisé sur un microscope composé.
2. Préparer 100 ml de support de coloration cellulaire dans un autoclaved, récipient en verre stérile en ajoutant 33 ml de saline tamponnée au phosphate 10x (PBS; sans calcium et magnésium) à une concentration finale de 3,3x, 2 ml de sérum de veau fœtal (FCS; chaleur inactivée à 56 oC pendant 30 min) à 2 % du volume total, et 2 ml de tampon de 1 M HEPES à une concentration finale de 20 m. Puis couronnez-vous à 100 ml d’eau stérile.
   REMARQUE : La concentration de 3.3x PBS a été choisie pour imiter la salinité de l’eau de mer, comme démontré dans Rosental et al.¹⁸. Cette concentration doit être ajustée pour les espèces présentes dans d’autres environnements pour imiter leur salinité.
3. Transférer 10 ml de support de coloration cellulaire à une bouteille d’aérographe (étiqueté « F » dans la figure 2) et attachez le couvercle d’adaptateur pour le connecteur d’aérographe.
   REMARQUE : De plus grands fragments et des espèces avec des couches de tissu plus épaisses peuvent exiger plus de milieu pour l’élimination adéquate des tissus.
4. Pour les espèces de coraux ramifiées démontrées ici, utilisez un coupeur d’os pour couper ou couper un fragment de corail d’environ 3 à 5 cm de longueur ou 4 cm² dans la région.
   REMARQUE : Le fragment doit être clair des macroalgues et d’autres organismes multicellulaires parce qu’ils ne peuvent pas être retirés de l’échantillon en aval et contaminer l’échantillon au cours des processus d’analyse et de tri du FACS. Un fragment de 1 cm de P. damicornis donne environ 2 à 10 x 10⁶ cellules après le filtrage, la coloration et le lavage.
5. Placez le fragment de corail à l’intérieur d’un sac de collecte en plastique et utilisez l’aérographe pour pulvériser le support de coloration cellulaire sur le corail (figure 2). Poursuivre ce processus jusqu’à ce que la plupart du squelette soit exposé. Retirer le squelette restant du sac de collecte.

2. Dissociation des cellules des tissus coralliens

REMARQUE : Effectuez toutes les marches sur la glace et protégez les mains avec des gants.

1. Filtrer la boue cellulaire à travers une passoire de cellules en nylon de 40 m dans un tube de centrifugeuse de 50 ml afin d’obtenir une suspension à cellule unique.
   REMARQUE : Différentes tailles de maille de paseuse cellulaire peuvent être plus appropriées pour différentes espèces. Cependant, de plus grandes tailles peuvent entraîner une dissociation inadéquate des tissus en raison du passage des débris et des amas cellulaires.
   1. Pour les spécimens avec des couches de mucus plus épaisses, utilisez le piston stérilisé d’une seringue en plastique de 1 ml et broyez-le doucement contre le filtre pour briser les touffes et aider les cellules à passer à travers la passoire. Rincer la passoire et le piston avec des supports de teinture cellulaire dans le tube de centrifugeuse.
2. Pelleter les cellules par centrifugation à 4 oC à 450 x g pendant 5 min. Enlever le supernatant et résuspendre les cellules dans 1 ml de support de coloration cellulaire.

3. Coloration cellulaire

REMARQUE : Effectuez toutes les marches sur la glace et protégez les mains avec des gants. Les taches figurant dans ce protocole sont à des fins de représentation. Les taches alternatives nécessiteront différentes concentrations et temps d’incubation.

1. Transférer 500 L de cellules résutilisées dans un tube de fond rond de 5 ml et réserver comme échantillon témoin. N’ajoutez pas de tache à cet aliquot.
2. À la suspension cellulaire restante, ajoutez 0,42 l de colorant de viabilité DAPI de 12 mM(tableau des matériaux),1 L de 5 M d’espèces réactives d’oxygène (ROS) tache(tableau des matériaux), et 0,1 l de 0,2 M tache de lysosome(Tableau des matériaux). Pipette bien mélanger et incuber sur la glace pendant 30 min dans l’obscurité pour éviter le photoblaching.
   REMARQUE : LE DAPI est utilisé dans cet exemple pour servir de tache d’ADN et de colorant de viabilité pour le gating différentiel des cellules mortes sur la machine FACS. Cela suppose que DAPI pénètre les cellules mourantes en raison de l’intégrité de la membrane. La tache ROS émet de la lumière dans la gamme de 520 nm (vert), tandis que le marqueur lysosomal émet de la lumière à environ 668 nm (rouge).
3. Pellet 500 L des cellules tachées par centrifugation à 4 oC à 450 x g pendant 5 min. Enlever le supernatant et réutiliser la pastille dans 500 l de support de coloration cellulaire. Transférer dans un nouveau tube de fond rond de 5 ml et conserver sur la glace.

4. Démarrage FACS

REMARQUE : Les étapes peuvent varier selon la fonte et le modèle du cytomètre en raison des différences dans les lasers et les canaux. Pour ce protocole, un cytomètre avec 405, 488, 535, et 640 lasers de longueur d’onde nm a été utilisé. Les filtres présentés dans ce protocole sont à des fins de représentation. Les taches cellulaires alternatives peuvent nécessiter un ensemble différent de filtres et de lasers.

1. Commencez à créer un nouveau modèle de projet sur le logiciel de trieur et choisissez le panneau laser. Pour la combinaison représentée de taches et de fluorescence naturelle, sélectionnez les quatre lasers (405, 488, 535 et 640 nm).
2. Sélectionnez les filtres appropriés pour chaque couleur attendue représentée dans l’expérience.
   1. Pour détecter l’émission et l’aide DAPI dans la séparation des cellules vivantes et mortes, utilisez un filtre avec un bandpass (BP) de 450/50 (425-475 nm gamme) comme un filtre DAPI, Hoeschst ou Pacific Blue.
   2. Pour la détection de la lumière émise par le signal vert ROS, utilisez un filtre avec un BP de 530/30 (gamme de longueur d’onde de 515-545 nm) comme un filtre isothiocyanate de fluoresceine (FITC) ou de protéines fluorescentes vertes (GFP). Ce filtre mesurera la concentration de ROS dans chaque cellule.
   3. Ajoutez un filtre supplémentaire avec un filtre BP de 670/30 (655-685 nm) comme un filtre allophycocyanin (APC) pour la détection de l’émission de taches lysosomales.
      REMARQUE : Le canal APC permettra la mesure de l’activité phagocytique. Ce canal détectera également l’autofluorescence générée par les algues symbiotiques coralliennes de la famille Symbiodiniaceae. Ce signal peut être séparé à l’aide d’un canal supplémentaire qui a une longueur d’onde plus longue que le filtre APC, cependant.
   4. Inclure un filtre qui a un BP de 780/60 (750-810 nm gamme), comme la phycoerythrine la plus couramment utilisée, filtre à cyanine (APC-Cy7), qui détecte l’émission d’autofluorescence rouge lointain de Symbiodiniaceae et les aides dans l’isolement des cellules aposymbiotiques.

5. Configuration de gating FACS

REMARQUE : Les étapes peuvent varier selon la fonte et le modèle du cytomètre et du programme d’acquisition couplés au cytomètre.

1. Sur l’écran expérimental du projet du logiciel de cytométrie, créez une parcelle de diffusion et sélectionnez la dispersion vers l’avant (FCS) comme mesure pour l’axe X et la dispersion latérale (SSC) pour l’axe Y.
   REMARQUE : FCS est en corrélation avec la taille de la cellule et SSC est en corrélation avec la granularité. Cela permettra l’enlèvement de la plupart des débris, car la plupart seront de plus petite taille que les cellules intactes.
2. Réglez les axes à des échelles logarithémiques ou biexponentielles, car la taille des cellules et la granularité peuvent varier de plusieurs ordres de grandeur(figure 3A), en particulier chez les coraux.

6. Analyse du FACS et isolement cellulaire

REMARQUE : Les étapes peuvent varier selon la fonte et le modèle du cytomètre et du programme d’acquisition couplé.

1. Placez le contrôle (c.-à-d. le sous-ensemble cellulaire non souillé) dans la chambre d’échantillon du cytomètre et commencez le processus de lecture. Lorsque l’ordinateur commence à recevoir des données de chaque cellule, ou événement, les points commencent à apparaître sur l’intrigue de diffusion. Pour dégager les débris laissés dans les chambres cytomètres des expériences précédentes, laissez passer environ 30 s avant de commencer l’analyse.
2. Dans l’intrigue de dispersion, ajustez la tension du tube photomultiplier (PMT) afin de centrer les points.
   REMARQUE : La tension pmT est utilisée pour amplifier la force du signal des photons mesurés ; si la tension pmT est trop faible, moins de cellules seront lues, et si la tension pmT est trop forte, les cellules seront mesurées près de la valeur maximale et différents types de cellules seront indiscernables les uns des autres. Une tension HT adéquate garantit que des événements indépendamment reconnaissables peupleront la parcelle de dispersion. La séparation des événements est plus facile à visualiser en projetant des échelles logarithémiques ou biexponentielles sur les parcelles de dispersion FSC et SSC.
3. Commencez à enregistrer les événements. Pour conserver l’échantillon, faites une pause dans l’acquisition de données après qu’environ 15 000 événements aient été lus. Dans la plupart des cas, cela sera suffisant pour visualiser les modèles globaux de population cellulaire. Enregistrez plus d’événements si vous analysez et isolent de petites populations de cellules spécialisées.
4. Sur le premier graphique de FSC et SSC, créez une sélection, ou porte, des cellules autour de la marque^{10 2} et plus haut sur l’axe X du FSC. Tout ce qui est inférieur à ce seuil est probablement des débris cellulaires. Dessinez des barrières rectangulaires, qui est une option régulière sur les programmes logiciels de cytométrie d’écoulement et bon pour des populations cellulaires claires et distinctes. Pour les populations cellulaires qui prennent une forme plus irrégulière sur les parcelles de dispersion, utilisez une option de gating polygonal.
   REMARQUE : Un seuil minimum de 10² sur la dispersion vers l’avant devrait sélectionner pour les plus petites cellules coralliennes, mais peut permettre la contamination des débris. Pour modifier cela, augmenter la limite inférieure du gating pour être plus conservateur.
5. Créez une nouvelle parcelle de diffusion exprimant le filtre DAPI sur l’axe X et le filtre APC-Cy7 sur l’axe Y. Pour ce faire, sélectionnez la porte pour les cellules intactes créées dans l’étape 6.4, clic droit, et sélectionnez l’option pour créer une nouvelle parcelle de diffusion. Ajuster les axes à des échelles logarithémiques ou biexponentielles.
   REMARQUE : Les étapes nécessaires pour créer une nouvelle parcelle peuvent varier selon les différents logiciels.
6. Maintenant, retirez l’échantillon de contrôle de la chambre cytomètre et remplacez-le par les cellules tachées. Laissez passer 30 s avant de commencer l’analyse et d’enregistrer les données. Enregistrez environ 15 000 cellules avant de s’arrêter.
   REMARQUE : La population distincte (s) sur l’extrémité supérieure de l’échelle APC-Cy7 sont ceux avec l’autofluorescence rouge élevée de Symbiodiniaceae. Aucune tache n’est nécessaire pour visualiser ces ruptures de population, et elles peuvent également être consultées sur l’enregistrement de l’échantillon témoin(figure 3C). Sélectionnez pour les populations de corail seulement, ceux qui sont plus bas sur l’axe Y, pour une plus grande différenciation.
7. Créez une nouvelle parcelle de diffusion des cellules aposymbiotiques pour visualiser les concentrations de ROS (filtre FITC) et les cellules positives aux lysosomes (filtre APC), utilisant à nouveau des échelles logarithémiques ou biexponentielles.
   REMARQUE : S’il y a plusieurs populations cellulaires distinctes qui sont aposymbiotiques, chacune peut être plus distinguée dans sa propre parcelle de dispersion(figure 3C,D).
8. Comparez le groupe d’échantillons tachés au contrôle, sous-ensemble non souillé en utilisant le premier enregistrement de l’échantillon témoin ou en réintroduisant et en réintérant le groupe témoin. Portez les événements qui sont uniques au groupe d’échantillons tachés.

7. Tri et collecte facS

REMARQUE : Les étapes peuvent varier selon la fonte et le modèle du cytomètre et du programme d’acquisition couplés au cytomètre.

1. Avec une sélection de cellules choisies pour recueillir, placez des tubes de microcentrifuge (contenant 250 à 500 l de milieu de culture cellulaire ou tampon de lyse en fonction du nombre de cellules collectées et de la méthode de stockage) dans la chambre de collecte du cytomètre.
   REMARQUE : Le cytomètre de débit représenté est capable de trier quatre populations différentes à la fois, et la machine peut être configurée pour contenir une variété d’appareils de collecte, y compris divers tubes de centrifugeuse et 96 plaques de puits.
2. Une fois que le cytomètre commence à lire l’échantillon et qu’une quantité appropriée de temps s’est écoulée pour éliminer les débris, commencez à trier les populations désirées et collectez entre 20 000 cellules et plusieurs millions.
   1. Pour plus de 500 000 cellules, ajustez le volume des supports de culture cellulaire ou du tampon de lyse, et le volume du dispositif de collecte.
   2. Pour les études in vitro, entreposez les cellules sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient placées dans un incubateur ou dans un environnement stérilisé.
   3. Pour les études moléculaires, soit commencez immédiatement le processus d’isolement de l’ADN/ARN/protéine, soit congelez le flash et entreposez-les à -80 oC jusqu’à l’extraction.
3. Chaque fois qu’une nouvelle tache, une espèce ou un trieur est utilisé, effectuez un contrôle de pureté sur la population d’intérêt en triant au moins 20 000 cellules d’intérêt en 500 l de support de coloration, puis en ré analysant les cellules triées et en confirmant que les cellules sont lues à l’intérieur de la porte utilisée pour trier initialement(figure 4).

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Résultats

Dans l’ensemble, ce protocole est utile parce qu’il facilite l’identification et la collecte des populations vivantes de cellules coralliennes qui peuvent être utilisées pour des analyses fonctionnelles. Le flux de travail a commencé avec la séparation mécanique des tissus coralliens du squelette sous-jacent de carbonate de calcium(figure 1). Il s’agit de l’une des étapes initiales les plus importantes parce que la technique incorrecte entraî...

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Discussion

Ce protocole a été adapté de Rosental et coll.¹⁸ et développé pour l’identification et l’isolement des cellules de P. damicornis. La méthodologie se concentre sur le processus de filtrage des échantillons pour enlever les débris, les cellules non viables, et les cellules hébergées par Symbiodiniaceae par l’examen de facteurs intrinsèques cellulaires, y compris la taille relative des cellules, la granularité des cellules relatives, l’autofluorescence cellulaire, et la p...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Airbrush Kit & Compressor	TCP Global	ABD KIT-H-SET	Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose
BD FACSAria II	BD	644832
Bone Cutters	Bulk Reef Supply	205357	Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter
Cell Strainer	Corning	352340	40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon
CellRox Green	Life Technologies	C10444	2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm
Collection bag	Grainger	38UV35	Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness
DAPI	Invitrogen	D1306	10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm
Fetal Calf Serum	Sigma-Aldrich	F2442-100ML	Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemacytometer
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H0887
LysoTracker Deep Red	Life Technologies	L12492	1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm
Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294	1.7 mL
Phophate Buffered Saline (PBS)	Gibco	70011-044	pH 7.4; 10X
Round-bottom tubes	VWR	352063	5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube
Syringe	BD	309628	1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate