Identification de nouveaux régulateurs de la transpiration végétale par le dépistage thermique à grande échelle à Helianthus Annuus

Résumé

Nous fournissons une méthode pour identifier les modulateurs de la transpiration foliaire par le criblage à grande échelle d'une bibliothèque composée.

Résumé

L'adaptation des plantes aux stress biotiques et abiotiques est régie par une variété de facteurs, parmi lesquels la régulation de l'ouverture stomatale en réponse au déficit en eau ou aux agents pathogènes joue un rôle crucial. L'identification de petites molécules qui régulent le mouvement stomatal peut donc contribuer à comprendre la base physiologique par laquelle les plantes s'adaptent à leur environnement. Les approches de dépistage à grande échelle qui ont été utilisées pour identifier les régulateurs du mouvement stomatal ont des limites potentielles : certaines dépendent fortement de la voie de signalisation hormonale de l'acide abscisique (ABA), excluant ainsi les mécanismes indépendants de l'ABA, tandis que d'autres s'appuient sur l'observation d'effets physiologiques indirects à long terme tels que la croissance et le développement des plantes. La méthode de dépistage présentée ici permet le traitement à grande échelle des plantes avec une bibliothèque de produits chimiques couplé avec une quantification directe de leur transpiration par imagerie thermique. Puisque l'évaporation de l'eau par transpiration entraîne le refroidissement de surface des feuilles, l'imagerie thermique fournit une approche non invasive pour étudier les changements dans la conductance stomatale au fil du temps. Dans ce protocole, les semis d'annuus de Helianthus sont cultivés hydroponiquement et ensuite traités par l'alimentation de racine, dans lequel la racine primaire est coupée et trempée dans le produit chimique étant examiné. L'imagerie thermique suivie d'une analyse statistique des changements de température cotylédonnaires au fil du temps permet d'identifier les molécules bioactives modulant l'ouverture stomatale. Nos expériences de preuve de concept démontrent qu'un produit chimique peut être transporté de la racine coupée au cotylédon du semis de tournesol en 10 minutes. En outre, lorsque les plantes sont traitées avec aBA comme un contrôle positif, une augmentation de la température de surface des feuilles peut être détectée en quelques minutes. Notre méthode permet ainsi l'identification efficace et rapide de nouvelles molécules régulant l'ouverture stomatale.

Introduction

La tolérance au stress chez les plantes est un trait polygénique influencé par une variété de caractéristiques et de mécanismes moléculaires, cellulaires, développementaux et physiologiques¹. Les plantes dans un environnement fluctuant doivent moduler continuellement leurs mouvements stomatals pour équilibrer la demande photosynthétique de carbone tout en maintenant suffisamment d'eau et en empêchant l'invasion pathogène^2; cependant, les mécanismes par lesquels ces "décisions" de compromis sont prises sont mal compris³. L'introduction de molécules bioactives dans les plantes peut moduler leur physiologie et aider à sonder de nouveaux mécanismes de régulation.

Le dépistage à grande échelle de petites molécules est une stratégie efficace utilisée dans la découverte de médicaments anticancéreux et des essais pharmacologiques pour tester les effets physiologiques de centaines à milliers de molécules dans un court laps de temps^4,5. En biologie végétale, le dépistage à haut débit a montré son efficacité par exemple dans l'identification de la molécule synthétique pyrabactin⁶, ainsi que la découverte du récepteur tant recherché de l'acide abscisique (ABA)^7,8. Depuis lors, les agonistes et les antagonistes des récepteurs ABA, et les petites molécules capables de moduler l'expression des gènes de reporter ABA-inductibles ont été identifiés^{9,10,11,12,13,14,15}. Les approches de dépistage à haut débit actuellement disponibles pour identifier les petits composés qui peuvent moduler l'ouverture stomatale présentent certains inconvénients : (i) les protocoles tournant autour de la voie de signalisation de l'ABA peuvent empêcher l'identification de nouveaux mécanismes indépendants de l'ABA, et (ii) les stratégies in vivo utilisées pour l'identification des petites molécules bioactives dépendent principalement de leurs effets physiologiques sur la germination des graines ou la croissance des semis, et non sur la régulation de la transpiration végétale.

En outre, bien qu'il existe de nombreuses façons de traiter les plantes avec des molécules bioactives, la plupart d'entre elles ne sont pas bien adaptés pour une étude à grande échelle du mouvement stomatal. En bref, les trois techniques les plus courantes sont l'application foliaire par pulvérisation ou trempage, le traitement du système racinaire, et l'irrigation des racines. L'application Foliar n'est pas compatible avec les méthodologies les plus courantes et les plus rapides pour mesurer l'ouverture stomatale puisque la présence de gouttelettes à la surface des feuilles interfère avec la collecte de données à grande échelle. Les principales limites de l'irrigation des racines sont les exigences importantes en volume d'échantillon, la rétention potentielle des composés par des éléments dans la rhizosphère et la dépendance à l'utilisation active des racines.

Ici, nous présentons une méthode à grande échelle pour identifier de nouveaux composés régulant la transpiration des plantes qui n'implique pas nécessairement des mécanismes aBA ou connus sensibles à la sécheresse et permet un traitement efficace et fiable des plantes. Dans ce système, les plantes helianthus annuus sont traitées à l'aide d'une approche d'alimentation des racines qui consiste à couper la racine primaire des semis cultivés hydroponiquement et à tremper le site de coupe dans la solution de l'échantillon. Une fois traité, l'effet de chaque composé sur la transpiration des plantes est mesuré à l'aide d'une caméra thermique infrarouge. Étant donné qu'un déterminant majeur de la température de surface des feuilles est le taux d'évaporation de la feuille, les données d'imagerie thermique peuvent être directement corrélées à la conductance stomatale. Le changement relatif de la température foliaire après le traitement chimique fournit ainsi un moyen direct de quantifier la transpiration de la plante.

H. annuus est l'une des cinq plus grandes cultures d'oléagineux au monde¹⁶ et les découvertes faites directement sur cette plante peuvent faciliter les futurs transferts de technologie. En outre, les semis de H. annuus ont de grands cotylédons plats, ainsi qu'une racine primaire épaisse, qui était idéale pour le développement de ce protocole. Cependant, cette méthode peut être facilement adaptée à d'autres plantes et à une variété de composés.

Ce protocole peut être utilisé pour identifier efficacement les molécules capables de déclencher la fermeture stomatale ou de promouvoir l'ouverture stomatale, ce qui a des implications majeures pour comprendre les signaux qui régulent la conductance stomatale et l'adaptation des plantes à l'environnement Souligne.

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Protocole

1. Cultiver les plantes

1. Ajouter une couche de vermiculite fine de 4 cm d'épaisseur à la norme de 10 po x 20 po (254 mm x 501 mm) plateaux de plantes sans trous.
2. Placer les supports de semences (voir Tableau des matériaux) à 2 cm l'un de l'autre dans les plateaux végétaux.
3. Remplir les porte-graines de vermiculite.
4. Placez une graine de tournesol avec son extrémité pointue vers le bas dans chaque support de graine, poussant vers le bas ainsi la moitié de la graine reste exposée.
   REMARQUE : Une graine de tournesol est asymétrique et l'extrémité pointue d'où le radicle émergera devrait pointer vers le bas. Un bon placement des graines est important car la réorientation de la racine et de la tige n'est pas possible à l'intérieur des porteurs de graines. L'extrémité arrondie de la graine doit s'étendre au-delà du dessus du porte-graines.
5. Une fois les graines en place, recouvrez-les d'une couche supplémentaire de vermiculite fine de 2 cm d'épaisseur. Arroser en brumisant d'en haut. La surface doit rester humide après une heure. Si c'est le cas, recouvrir les plateaux de couvercles.
6. Cultivez des plantes dans une chambre de croissance ou une serre. Les conditions recommandées sont une intensité lumineuse de 140 'mol photons'm^{-2's -1} et une photopériode de 16 h de lumière à 22 'C et 9 h d'obscurité à 20 'C pendant 5 jours.
   REMARQUE : L'arrosage ne devrait pas être nécessaire à moins que la surface ne devienne visiblement sèche.

2. Mise en place du système hydroponique

1. Trouvez un contenant de taille appropriée pour la culture des plantes hydroponique. La taille du conteneur doit être adaptée à l'espace disponible dans la chambre de croissance ou la serre. Une profondeur minimale de 15 cm est recommandée.
2. Remplissez le récipient d'eau distillée et ajoutez de l'engrais hydroponique général tel qu'indiqué par le fabricant. La solution hydroponique qui en résulte doit être aérée et en mouvement constant, ce qui peut être réalisé en utilisant des pompes à air et à eau.
3. Préparer les flotteurs hydroponique.
   1. Couper une feuille de mousse de polystyrène expansée de 2 cm d'épaisseur (voir Tableau des matériaux)aux dimensions du récipient. La feuille doit couvrir la majeure partie de la surface du récipient afin de limiter la croissance des algues. Un outil de combustion du bois est efficace pour couper la mousse de polystyrène et est assez polyvalent pour ce protocole.
      CAUTION : Les fumées ou la vapeur libérées lors de la coupe à chaud de la mousse de polystyrène sont de graves dangers pour la santé. Utilisez une protection respiratoire appropriée. Les utilisateurs peuvent également satisfaire aux exigences de ventilation en coupant la mousse sous une hotte de fumée.
   2. Faire des trous (1-2 cm de diamètre) dans la feuille de mousse en polystyrène à l'aide d'un outil de combustion du bois. La distance entre les centres de deux trous peut être ajustée aux besoins de l'expérience. Cependant, une distance minimale de 2,5 cm est recommandée.

3. Transfert des semis à la culture hydroponique et à la croissance des plantes

1. Retirez délicatement les semis de 5 jours de la vermiculite et transférez-les immédiatement dans un récipient rempli d'eau pendant 30 min. Cette étape éliminera l'excès de vermiculite et adoucira les péricarpes restants. La racine primaire émergente doit être visible.
2. Retirez les parois péricarpes à la main si nécessaire afin d'optimiser l'expansion future des cotylédons.
3. Transférer les semis à l'intérieur des supports de graines sur le flotteur en mousse de polystyrène. Cultivez les plantes avec une intensité lumineuse de 140 'mol photons'm^{-2's -1}, une humidité relative de 65% et une photopériode de 16 h de lumière à 22 'C et 9 h d'obscurité à 20 'C pendant 2 jours.

4. Préparation avant le traitement

REMARQUE : Cette procédure vise à tester 20 produits chimiques provenant d'une petite bibliothèque de composés en tripleté, avec 100 M DAA en 10 mM MES-KOH (pH à 6,2) et 10 mM MES-KOH (pH à 6,2) contenant 1 % (v/v) de sulfoxure de diméthyle (DMSO) comme contrôles positifs et négatifs, respectivement.

1. Assurez-vous qu'il y a suffisamment de plantes prêtes pour le traitement. Les plantes prêtes pour le traitement doivent être suffisamment matures pour avoir des cotylédons entièrement dépliés, mais assez jeunes pour que la prolifération latérale des racines soit minime. Pour faire un criblage standard, 69 de ces usines sont nécessaires.
2. Retirer la plaque de 96 puits contenant les petits composés du congélateur de -80 oC. Décongeler à température ambiante.
3. Préparer 80 ml de tampon MES-KOH de 10 mM ajusté à un pH de 6,2 avec 1 M KOH.
4. Étiqueter les microtubes de 2 ml sans bouchon. Préparer au moins six tubes pour le traitement de contrôle négatif (10 mM MES-KOH (pH 6,2) contenant 1 % (v/v) DMSO). Utilisez trois tubes pour le traitement de l'ABA (100 M ABA dans 10 mM DEM DE M Dh MES-KOH à 6,2), contrôle positif). Utilisez les 60 tubes restants pour analyser l'effet des 20 produits chimiques en triplicate.
5. Transférer 10 l de chaque produit chimique (10 mM en DMSO) dans chacun des trois tubes correctement étiquetés. Pipet 10 'L de 10 mM ABA dissous dans DMSO en trois tubes et 10 'L de DMSO dans les six tubes de commande.
   CAUTION: Par nature, certains composés peuvent causer des effets graves sur la santé et les utilisateurs doivent prendre les mesures de protection appropriées.
6. Ajouter 990 oL de 10 mM DE MES-KOH (pH à 6,2) à chacun des 69 tubes. Distribuez le tampon MES avec assez de force pour mélanger le produit chimique avec le tampon MES, mais soyez très prudent de ne pas utiliser autant de force que les produits chimiques et le tampon MES giclent hors du tube. Alternativement, vortex à basse vitesse.

5. Configurer la caméra thermique

1. Montez la caméra thermique sur un support de copie. Connectez tous les câbles à un ordinateur portable.
   REMARQUE : L'enregistrement se fait dans des conditions de température (20 à 25 oC), d'humidité (50 % à 70 %) et la qualité de la lumière (110 à 140 photons de mol^-2-1) semblable à celles utilisées pour la culture des plantes.
2. Allumez la caméra puis l'ordinateur portable et ouvrez le logiciel d'analyse d'imagerie thermique.
   REMARQUE : Les instructions ultérieures d'enregistrement s'appliquent à un logiciel spécifique utilisé (voir Tableau des matériaux).
3. Ajuster les paramètres d'enregistrement.
   1. Souris sur le bouton rouge d'enregistrement en haut de la fenêtre centrale. Un menu déroulant apparaîtra. Cliquez sur l'icône clé Paramètres d'enregistrement.
   2. Sélectionnez le mode d'enregistrement et les options appropriés. L'option d'enregistrement périodiquement, avec une image capturée par minute et un arrêt manuel pourrait être utilisé. Notez la destination de fichier où le logiciel enregistrera la vidéo. Fermez la fenêtre Paramètres d'enregistrement.

6. Préparation et traitement des plantes

1. Placez les tubes sans bouchon contenant les produits chimiques dans des grilles à tubes. Alternativement, une feuille de mousse de polystyrène peut être coupée et poked avec un outil de combustion de bois comme décrit dans l'étape 2.3 pour faire un support de tube fait sur commande. Le diamètre de chaque trou doit être très proche du diamètre externe des tubes sans capuchon afin de les maintenir fermement.
   REMARQUE : Le champ de vision de la caméra est un facteur limitant qui doit être pris en considération au moment de décider comment les tubes sans bouchon seront maintenus en place.
2. Répartir uniformément les tubes de contrôle positifs et négatifs ainsi que les tubes expérimentaux dans les racks pour tenir compte des biais liés à la position¹⁷.
3. Préparer les matériaux suivants à côté des plantes cultivées hydroponiquement: ciseaux microdissection, un plat peu profond avec de l'eau, lingettes tâche délicate, les 69 tubes sans bouchon contenant les différents produits chimiques.
4. Répétez les étapes suivantes pour chaque plante à traiter. La pousse de tournesol restera toujours dans le porte-graines.
   1. Soulevez soigneusement le porte-graines et trempez rapidement la racine dans le plat peu profond contenant de l'eau.
   2. Couper la racine primaire sous l'eau pour prévenir la cavitation. La coupe doit se produire de 0,8 à 1 cm sous l'extrémité la plus basale du porte-graines.
   3. Inset la plante fraîchement coupée dans l'un des tubes contenant les produits chimiques.
   4. S'il y a des gouttes d'eau sur les cotylédons, tamponnez-les doucement à sec avec une lingette délicate.
      REMARQUE : Ces quatre étapes doivent être effectuées le plus rapidement possible (10 min ou moins) pour prévenir les incohérences dans l'étude cinétique.
5. Déplacez les plantes sous la caméra thermique et assurez-vous que toutes les plantes sont dans le champ de vision de la caméra. Ajustez la hauteur de la caméra et la position des racks au besoin.

7. Enregistrement

1. Concentrez la caméra à la surface des cotylédons en appuyant sur Ctrl et Alt A.
2. Passez la souris sur le bouton rouge et cliquez sur l'option Enregistrer un film. Une nouvelle fenêtre confirmant l'enregistrement doit s'ouvrir.
3. Arrêtez l'enregistrement 1-2 heures plus tard.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

8. Collecte de données

1. Aller à Fichier (fr) Ouvert à l'ouvert Parcourir pour le correct . Fichier SEQ et ouvrez-le.
2. Arrête de jouer au film.
3. Sur le côté gauche de la fenêtre principale, cliquez sur ajouter une icône de réerique de mesure (3x3 pixels). Le retour sur investissement signifie Région d'intérêt.
4. Souris au-dessus du centre d'un cotyledon de la première plante et cliquez à gauche une fois. Le curseur 1 est maintenant en place. Étiqueter le deuxième cotylédon de la première plante en répétant la procédure. L'ordre des étiquettes doit être noté.
5. Répétez la procédure. Toutes les plantes doivent être étiquetées avec deux curseurs.
6. Cliquez sur l'icône Modifier les ROI. Dans la fenêtre principale, cliquez à gauche et maintenez le coin supérieur gauche et faites défiler vers le coin inférieur droit pour sélectionner tous les ROC.
7. Souris sur l'icône Statistic Viewer et sélectionnez Temporal Plot. Une nouvelle fenêtre s'ouvrira.
8. Exécutez le film. Un graphique se remplira avec les données.
9. Dans cette fenêtre, cliquez sur la double flèche dans le coin supérieur droit pour ouvrir un nouveau menu.
10. Cliquez sur l'icône Enregistrer. Enregistrer comme les valeurs X et Y dans l'intrigue (.csv). Fermez le logiciel une fois que les données ont été exportées.

9. Analyse des données

1. Ouvrez le fichier .csv à l'aide d'un logiciel d'analyse de données (par exemple, Microsoft Excel). Notez que les trois premières colonnes (de A à C) fournissent des informations sur le numéro d'image, l'heure absolue et l'heure relative. Les colonnes restantes donnent la température de chaque retour sur investissement au fil du temps.
2. Décider de la nature de l'outil statistique à utiliser; cette décision dépend de différents facteurs, y compris la conception expérimentale.
   REMARQUE : Dans notre exemple, un score standard, ou z-score, est calculé pour chaque échantillon en fonction de la moyenne de la population et de l'écart de la norme de la population. Pour chaque échantillon, une valeur p est ensuite calculée à partir du z-score. Cette méthode permet de confirmer les contrôles positifs et négatifs ainsi que l'identification de nouveaux composés à tester davantage.

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Résultats

Une expérience utilisant le colorant rouge Erythrosine B (0,8 kDa) démontre la capacité des produits chimiques à être visiblement absorbés par une racine coupée dans les cotylédons d'un semis de tournesol dans les 10 minutes (Figure 1).

Lorsque les plantes sont traitées avec aBA, une augmentation de la température des feuilles est détectée dans les cotylédons de tournesol en quelques mi...

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Discussion

Le nombre de composés qui peuvent être testés un jour donné dépend principalement (i) de l'espace écologique disponible pour cultiver les plantes et effectuer l'écran, ainsi que (ii) le nombre d'individus qui peuvent être impliqués dans l'étape 6 du protocole. Nous recommandons l'utilisation de trois répliques expérimentales pour consolider l'interprétation des résultats après le traitement statistique. Dans une journée typique, une à deux personnes peuvent dépister 60 composés dans des tripliques sans...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1020 plastic growing trays without drain holes			Standard 10 x 20 inch trays
2.0 mL microtubes, capless	Genesee Scientific	22-283NC
Abscisic acid (ABA)	Sigma-Aldrich	A1049
Air pump	Active Aqua	AAPA7.8L	2 Outlets, 3W, 7.8 L/min
Airstones
Chemical compound library	MicroSource Discovery		Natural Product Collection
Creative Versa-Tool (wood burning tool)	Nasco	9724549
Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested	Sigma-Aldrich	D4540
Dwarf Sunspot Sunflower seeds	Outsidepride.com
Erythrosin B	Sigma-Aldrich	200964
Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro)	General Hydroponics	GL51GH1421.31.11
Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34155
Laptop	Dell
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933
Microdissection scissors
Microsoft Excel	Microsoft
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
ResearchIR Software	FLIR
R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board	Insulfoam
Seedholders	Araponics	N/A
Super Tub (plastic utility tub)	Maccourt	ST3608	36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics
T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera	FLIR	FLIR-T62101	Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop
Vermiculite
Water filter	SunSun	HW-304B Pro Canister Filter