Identificação de novos reguladores de transpiração vegetal por triagem de imagens térmicas em larga escala em Helianthus Annuus

Resumo

Fornecemos um método para identificar moduladores de transpiração foliar através de triagem em larga escala de uma biblioteca composta.

Resumo

A adaptação vegetal ao estresse biótico e abiótico é regida por uma variedade de fatores, entre os quais a regulação da abertura estomatal em resposta ao déficit hídrico ou patógenos desempenha um papel crucial. Identificar pequenas moléculas que regulam o movimento estomatal pode, portanto, contribuir para entender a base fisiológica pela qual as plantas se adaptam ao seu ambiente. Abordagens de triagem em larga escala que têm sido usadas para identificar reguladores do movimento estomatal têm limitações potenciais: algumas dependem fortemente da via de sinalização hormonal de ácido abscisico (ABA), excluindo assim mecanismos independentes da ABA, enquanto outros dependem da observação de efeitos fisiológicos indiretos e de longo prazo, como crescimento e desenvolvimento vegetal. O método de triagem aqui apresentado permite o tratamento em larga escala de plantas com uma biblioteca de produtos químicos juntamente com uma quantificação direta de sua transpiração por imagem térmica. Uma vez que a evaporação da água através da transpiração resulta em resfriamento da superfície da folha, a imagem térmica fornece uma abordagem não invasiva para investigar mudanças na condução estomatal ao longo do tempo. Neste protocolo, as mudas de helianthus annuus são cultivadas hidroponicamente e depois tratadas pela alimentação radicular, na qual a raiz primária é cortada e mergulhada no produto químico que está sendo testado. A imagem térmica seguida de análise estatística das mudanças de temperatura cotyledonary ao longo do tempo permite a identificação de moléculas bioativas modulando abertura estomatal. Nossos experimentos de prova de conceito demonstram que um produto químico pode ser transportado da raiz cortada até o cotyledon da muda de girassol dentro de 10 minutos. Além disso, quando as plantas são tratadas com ABA como um controle positivo, um aumento na temperatura da superfície da folha pode ser detectado em poucos minutos. Nosso método permite, assim, a identificação eficiente e rápida de novas moléculas que regulam a abertura estomatal.

Introdução

A tolerância ao estresse nas plantas é um traço poligênico influenciado por uma variedade de características moleculares, celulares, dedesenvolvimento e fisiológicas e mecanismos¹. As plantas em um ambiente flutuante precisam modular continuamente seus movimentos estomatais para equilibrar a demanda fotossintética por carbono, mantendo água suficiente e prevenindo a invasão de patógenos²; no entanto, os mecanismos pelos quais essas "decisões" de trade-off são tomadas são mal compreendidas³. Introduzir moléculas bioativas em plantas pode modular sua fisiologia e ajudar a sondar novos mecanismos de regulação.

O rastreamento em larga escala de pequenas moléculas é uma estratégia eficaz usada na descoberta de medicamentos anticâncer e ensaios farmacológicos para testar os efeitos fisiológicos de centenas a milhares de moléculas em um curto período de tempo^4,5. Na biologia vegetal, a triagem de alto desempenho tem mostrado sua eficácia, por exemplo, na identificação da molécula sintética pyrabactin⁶, bem como na descoberta do tão procurado receptor de ácido abscisico (ABA)^7,8. Desde então, agonistas e antagonistas de receptores ABA, e pequenas moléculas capazes de modular a expressão de genes repórteres indutíveis da ABA foram identificados^{9,10,11,12,13,14,15}. Abordagens de triagem de alto-throughput atualmente disponíveis para identificar pequenos compostos que podem modular abertura estomatal têm algumas desvantagens: (i) protocolos girando em torno da via de sinalização ABA podem impedir a identificação de novos mecanismos independentes da ABA, e (ii) em estratégias in vivo utilizadas para a identificação de pequenas moléculas bioativas dependem principalmente de seus efeitos fisiológicos na germinação ou muda de crescimento de sementes, e não na regulação da transpiração vegetal por seção.

Além disso, embora existam muitas maneiras de tratar plantas com moléculas bioativas, a maioria delas não são adequadas para um estudo em larga escala do movimento estomatal. Resumidamente, as três técnicas mais comuns são a aplicação foliar, pulverizando ou mergulhando, tratamento do sistema radicular e irrigação de raízes. A aplicação foliar não é compatível com as metodologias mais comuns e rápidas para medir a abertura estomatal, uma vez que a presença de gotículas na superfície da folha interfere na coleta de dados em larga escala. As principais limitações da irrigação raiz são os grandes requisitos de volume amostral, a retenção potencial dos compostos por elementos na rizosfera e a dependência da captação ativa da raiz.

Aqui, apresentamos um método em larga escala para identificar novos compostos que regulam a transpiração vegetal que não envolve necessariamente mecanismos aba ou conhecidos de resposta à seca e permite um tratamento eficiente e confiável das plantas. Neste sistema, as plantas helianthus annuus são tratadas usando uma abordagem de alimentação raiz que consiste em cortar a raiz primária das mudas cultivadas hidroponicamente e mergulhar o local cortado na solução amostral. Uma vez tratado, o efeito de cada composto na transpiração das plantas é medido usando uma câmera de imagem térmica infravermelha. Uma vez que um grande determinante da temperatura da superfície da folha é a taxa de evaporação da folha, os dados de imagem térmica podem estar diretamente correlacionados com a condução estomatal. A mudança relativa na temperatura foliar após o tratamento químico fornece, assim, um meio direto para quantificar a transpiração da planta.

H. annuus é uma das cinco maiores culturas de oleaginosas do mundo¹⁶ e descobertas feitas diretamente nesta planta podem facilitar futuras transferências de tecnologia. Além disso, as mudas h. annuus possuem cotyledons grandes e planas, bem como uma raiz primária grossa, que era ideal para o desenvolvimento deste protocolo. No entanto, este método pode ser prontamente adaptado a outras plantas e uma variedade de compostos.

Este protocolo pode ser usado para identificar efetivamente moléculas capazes de desencadear o fechamento estomatal ou promover a abertura estomatal, o que tem grandes implicações para entender os sinais que regulam a condução estomatal e a adaptação vegetal ao meio ambiente Salienta.

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Protocolo

1. Cultivando as plantas

1. Adicione uma camada de 4 cm de espessura de vermiculite fina ao padrão 10 em. x 20 em bandejas de plantas de 254 mm x 501 mm) sem orifícios.
2. Coloque os portadores de sementes (ver Tabela de Materiais) 2 cm de distância nas bandejas da planta.
3. Encha os portadores de sementes com vermiculite.
4. Coloque uma semente de girassol com sua ponta pontiaguda em cada suporte de sementes, empurrando para baixo para que metade da semente permaneça exposta.
   NOTA: Uma semente de girassol é assimétrica e a extremidade pontuda de onde o radicle emergirá deve apontar para baixo. A colocação adequada de sementes é importante, pois a reorientação da raiz e do caule não são possíveis dentro dos detentores de sementes. A extremidade arredondada da semente deve se estender além do topo do suporte de sementes.
5. Uma vez que as sementes estejam no lugar, cubra-as com uma camada adicional de 2 cm de espessura de vermiculite fina. Água, névoando de cima. A superfície deve permanecer molhada após uma hora. Se for esse o caso, cubra as bandejas com tampas.
6. Cultivar plantas em uma câmara de crescimento ou uma estufa. As condições recomendadas são uma intensidade leve de 140 fótons μmol·m^-2·s^-1 e um período de fotoperiod de 16h de luz a 22 °C e 9h escuro a 20 °C por 5 dias.
   NOTA: A rega não deve ser necessária a menos que a superfície fique visivelmente seca.

2. Configuração do sistema hidropônico

1. Encontre um recipiente de tamanho adequado para plantas em crescimento hidroponicamente. O tamanho do recipiente deve ser adaptado ao espaço disponível na câmara de crescimento ou estufa. Recomenda-se uma profundidade mínima de 15 cm.
2. Encha o recipiente com água destilada e adicione fertilizante hidropônico geral, conforme indicado pelo fabricante. A solução hidropônica resultante deve ser aerada e em constante movimento, que pode ser alcançada usando bombas de ar e água.
3. Prepare os flutuadores hidropônicos.
   1. Corte uma folha de espuma expandida de poliestireno de 2 cm de espessura (ver Tabela de Materiais) para as dimensões do recipiente. A folha deve cobrir a maior parte da superfície do recipiente, a fim de limitar o crescimento das algas. Uma ferramenta de queima de madeira é eficaz para cortar espuma de poliestireno e é versátil o suficiente para este protocolo.
      ATENÇÃO: Fumaça ou vapor liberado durante o corte quente da espuma de poliestireno são sérios riscos para a saúde. Use proteção respiratória adequada. Os usuários também podem satisfazer os requisitos de ventilação cortando a espuma um capô de fume.
   2. Faça furos (1-2 cm de diâmetro) na espuma de poliestireno usando uma ferramenta de queima de madeira. A distância entre os centros de dois buracos pode ser ajustada às necessidades do experimento. No entanto, recomenda-se uma distância mínima de 2,5 cm.

3. Transferência de mudas para hidropônica e crescimento vegetal

1. Retire suavemente mudas antigas de 5 dias da vermiculite e transfira imediatamente para um recipiente cheio de água por 30 min. Esta etapa removerá o excesso de vermiculite e suavizará os pericarpas restantes. A raiz primária emergente deve ser visível.
2. Remova as paredes pericarpas à mão, se necessário, a fim de otimizar a futura expansão dos cotyledons.
3. Transfira as mudas dentro dos porta-sementes para o flutuador de espuma de poliestireno. Cresça as plantas com uma intensidade leve de 140 fótons μmol·m^-2·s^-1, uma umidade relativa de 65% e um período de 16h de luz a 22 °C e 9h escuro a 20 °C por 2 dias.

4. Preparação antes do tratamento

NOTA: Este procedimento é para testar 20 produtos químicos de uma pequena biblioteca composta em triplicado, com 100 μM ABA em 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) e 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) contendo 1% (v/v) sulfoxide de dimetile (DMSO) como controles positivos e negativos, respectivamente.

1. Certifique-se de que há plantas suficientes prontas para o tratamento. As plantas prontas para o tratamento devem ser maduras o suficiente para ter cotyledons totalmente desdobradas, mas jovens o suficiente para que a proliferação da raiz lateral seja mínima. Para fazer uma triagem padrão, são necessárias 69 plantas desse tipo.
2. Remova a placa de 96 poços contendo os pequenos compostos do congelador -80 °C. Descongele à temperatura ambiente.
3. Prepare 80 mL de 10 mM MES-KOH buffer ajustado a um pH de 6.2 com 1 M KOH.
4. Rotular microtubos de 2 mL sem tampa. Prepare pelo menos seis tubos para o tratamento de controle negativo (10 mM MES-KOH (pH = 6,2) contendo 1% (v/v) DMSO). Use três tubos para tratamento ABA (100 μM ABA em 10 mM MES-KOH pH = 6,2), controle positivo). Use os 60 tubos restantes para analisar o efeito dos 20 produtos químicos em triplicado.
5. Transfira 10 μL de cada produto químico (10 mM em DMSO) em cada um dos três tubos devidamente rotulados. Pipet 10 μL de 10 mM ABA dissolvido em DMSO em três tubos e 10 μL de DMSO nos seis tubos de controle.
   ATENÇÃO: Por natureza, alguns compostos podem causar sérios efeitos à saúde e os usuários devem tomar as medidas protetivas adequadas.
6. Adicione 990 μL de 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) a cada um dos 69 tubos. Dispense o tampão MES com força suficiente para misturar o produto químico com o tampão MES, mas tenha muito cuidado para não usar tanta força que os produtos químicos e tampão MES esguichar para fora do tubo. Alternativamente, vórtice em baixa velocidade.

5. Configure a câmera de imagem térmica

1. Monte a câmera de imagem térmica em um suporte de cópia. Conecte todos os cabos a um laptop.
   NOTA: O registro é feito em condições de temperatura (20 °C a 25 °C), umidade (50% a 70%) e qualidade de luz (110 a 140 μmol fótons·m^-2·s -1 ) semelhante s^-1) semelhante s-1 ) semelhante s-1
2. Ligue a câmera e depois o laptop e abra o software de análise de imagem térmica.
   NOTA: As instruções subsequentes para gravação aplicam-se a um software específico usado (consulte Tabela de Materiais).
3. Ajuste as configurações de gravação.
   1. Mouse sobre o botão vermelho recorde na parte superior da janela central. Um menu suspenso aparecerá. Clique no ícone da chave De Configurações de Gravação.
   2. Selecione o modo de gravação e opções apropriados. A opção de registro periodicamente, com um quadro capturado por minuto e uma parada manual poderia ser usada. Observe o destino do arquivo onde o software salvará o vídeo. Feche a janela De Configurações de Registro.

6. Preparação e tratamento de plantas

1. Coloque os tubos sem tampa contendo os produtos químicos em racks de tubo. Alternativamente, uma folha de espuma de poliestireno pode ser cortada e cutucada com uma ferramenta de queima de madeira como descrito na etapa 2.3 para fazer um rack de tubo personalizado. O diâmetro de cada buraco deve estar muito próximo do diâmetro externo dos tubos sem tampa, a fim de mantê-los firmemente.
   NOTA: O campo de visão da câmera é um fator limitante que deve ser levado em consideração ao decidir como os tubos sem tampa serão mantidos no lugar.
2. Distribua uniformemente os tubos de controle positivos e negativos, bem como os tubos experimentais nos racks para explicar o viés relacionado à posição¹⁷.
3. Prepare os seguintes materiais ao lado das plantas cultivadas hidroponicamente: tesouras de microdisseção, um prato raso com água, lenços delicados de tarefa, os 69 tubos sem tampa contendo os diferentes produtos químicos.
4. Repita as seguintes etapas para que cada planta seja tratada. O broto de girassol sempre permanecerá no suporte de sementes.
   1. Levante cuidadosamente o suporte de sementes e mergulhe rapidamente a raiz no prato raso contendo água.
   2. Corte a raiz primária debaixo d'água para evitar a cavitação. O corte deve ocorrer 0,8-1 cm abaixo da extremidade mais basal do suporte de sementes.
   3. Inset a planta recém-cortada em um dos tubos contendo os produtos químicos.
   4. Se houver alguma gota de água nos cotyledons, gentilmente os seque com um delicado lenço de tarefa.
      NOTA: Essas quatro etapas devem ser feitas o mais rápido possível (10 minutos ou menos) para evitar inconsistências no estudo da cinética.
5. Mova as plantas a câmera de imagem térmica e certifique-se de que todas as plantas estão dentro do campo de visão da câmera. Ajuste a altura da câmera e a posição dos racks conforme necessário.

7. Gravação

1. Concentre a câmera na superfície dos cotyledons pressionando Ctrl + Alt + A.
2. Mouse sobre o botão vermelho e clique na opção Gravar um Filme. Uma nova janela confirmando que a gravação deve ser aberta.
3. Pare a gravação 1-2 horas depois.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

8. Coleta de dados

1. Vá para o Arquivo | Aberto | Procure o correto. Arquivo SEQ e abra-o.
2. Pare de jogar o filme.
3. No lado esquerdo da janela principal, clique em adicionar um ícone ROI cursor de medição (3x3 pixels). Roi significa Região de Interesse.
4. Mouse sobre o centro de um cotyledon da primeira planta e clique à esquerda uma vez. O cursor 1 está agora no lugar. Rotular o segundo cotyledon da primeira planta repetindo o procedimento. A ordem dos rótulos deve ser notada.
5. Repita o procedimento. Todas as plantas devem ser rotuladas com dois cursores.
6. Clique no ícone Editar ROIs. Na janela principal, clique à esquerda e segure no canto superior esquerdo e role até o canto inferior direito para selecionar todos os ROIs.
7. Mouse sobre o ícone do Visualizador Estatístico e selecione Enredo Temporal. Uma nova janela se abrirá.
8. Comande o filme. Um gráfico irá preencher com os dados.
9. Nesta janela, clique na seta dupla no canto superior direito para abrir um novo menu.
10. Clique no ícone Salvar. Salve como valores X e Y na trama (.csv). Feche o software assim que os dados forem exportados.

9. Análise de dados

1. Abra o arquivo .csv usando um software de análise de dados (por exemplo, Microsoft Excel). Observe que as três primeiras colunas (A a C) fornecem informações sobre o número do quadro, o tempo absoluto e o tempo relativo. As colunas restantes dão a temperatura de cada ROI ao longo do tempo.
2. Decida sobre a natureza da ferramenta estatística a ser utilizada; essa decisão depende de diferentes fatores, incluindo o projeto experimental.
   NOTA: Em nosso exemplo, uma pontuação padrão, ou pontuação z, é calculada para cada amostra com base na média populacional e desvio padrão populacional. Para cada amostra, um valor p é então calculado a partir do z-score. Este método permite que a confirmação dos controles positivos e negativos, bem como a identificação de novos compostos a serem testadas ainda mais.

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Resultados

Um experimento usando o corantes vermelhos Eritrosina B (0,8 kDa) demonstra a capacidade dos produtos químicos de serem visivelmente absorvidos através de uma raiz cortada nos cotyledons de uma muda de girassol dentro de 10 minutos(Figura 1).

Quando as plantas são tratadas com ABA, um aumento na temperatura da folha é detectado em cotyledons girassol em poucos minutos. Esse aumento na temperatur...

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Discussão

O número de compostos que podem ser testados em um determinado dia depende principalmente do espaço ambientalmente controlado disponível para cultivar as plantas e realizar a tela, bem como (ii) o número de indivíduos que podem estar envolvidos na etapa 6 do protocolo. Recomendamos o uso de três réplicas experimentais para consolidar a interpretação dos resultados após o tratamento estatístico. Em um dia típico, um a dois indivíduos pode tela 60 compostos em triplicados sem dificuldade testando, por exemplo ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1020 plastic growing trays without drain holes			Standard 10 x 20 inch trays
2.0 mL microtubes, capless	Genesee Scientific	22-283NC
Abscisic acid (ABA)	Sigma-Aldrich	A1049
Air pump	Active Aqua	AAPA7.8L	2 Outlets, 3W, 7.8 L/min
Airstones
Chemical compound library	MicroSource Discovery		Natural Product Collection
Creative Versa-Tool (wood burning tool)	Nasco	9724549
Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested	Sigma-Aldrich	D4540
Dwarf Sunspot Sunflower seeds	Outsidepride.com
Erythrosin B	Sigma-Aldrich	200964
Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro)	General Hydroponics	GL51GH1421.31.11
Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34155
Laptop	Dell
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933
Microdissection scissors
Microsoft Excel	Microsoft
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
ResearchIR Software	FLIR
R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board	Insulfoam
Seedholders	Araponics	N/A
Super Tub (plastic utility tub)	Maccourt	ST3608	36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics
T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera	FLIR	FLIR-T62101	Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop
Vermiculite
Water filter	SunSun	HW-304B Pro Canister Filter