Préparation de SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexs of Liver Alcohol Dehydrogenase

Résumé

La préparation de SNS pincer cobalt (II) complexes modèles de déshydrogénase d’alcool de foie est présentée ici. Les complexes peuvent être préparés en réagissant au précurseur du ligand avec CoCl₂'6H₂O et peuvent ensuite être recrystallisés en permettant à l’éther de diethyl de se diffuser lentement dans une solution d’acétyltrile qui contient le complexe de cobalt.

Résumé

Les complexes de modèles chimiques sont prêts à représenter le site actif d’une enzyme. Dans ce protocole, une famille de précurseurs de ligand de pince tridentate (chacun possédant deux fonctionnalités d’atome de sulfure et d’un donneur d’azote (SNS) et basée sur des composés bis-imidazole ou bis-triazole) sont métallées avec des complexes CoCl₂'6H₂O pour se permettre des complexes tridents de cobalt de pince SNS(II). La préparation des complexes modèles de cobalt (II) pour la déshydrogénase d’alcool du foie est facile. Basé sur un changement de couleur rapide lors de l’ajout de la Solution CoCl_{26H 2}O à l’acétyltrile qui contient le précurseur ligand, le complexe se forme rapidement. La formation du complexe métallique est terminée après avoir permis à la solution de reflux pendant la nuit. Ces complexes de cobalt (II) servent de modèles pour le site actif de zinc dans la déshydrogénase d’alcool de foie (LADH). Les complexes sont caractérisés à l’aide diffraction à rayons X en cristal unique, spectrométrie de masse électrospray, spectroscopie visible ultra-violet et analyse élémentaire. Pour déterminer avec précision la structure du complexe, sa structure cristalline unique doit être déterminée. Les cristaux simples des complexes qui conviennent à la diffraction des rayons X sont ensuite cultivés par la diffusion lente de vapeur de l’éther de diéthyle dans une solution d’acétyltrile qui contient le complexe de cobalt(II). Pour les cristaux de haute qualité, la récrystallisation se fait généralement sur une période d’une semaine, ou plus. La méthode peut être appliquée à la préparation d’autres complexes de coordination des modèles et peut être utilisée dans les laboratoires d’enseignement de premier cycle. Enfin, on croit que d’autres peuvent trouver cette méthode de réhantification pour obtenir des cristaux uniques bénéfiques à leur recherche.

Introduction

Le but de la méthode présentée est de préparer des analogues à petites molécules de la LADH pour mieux comprendre l’activité catalytique des métalloenzymes. LADH est une enzyme dimerique qui contient un domaine cofactor-contraignant et zinc(II) domaine catalytique contenant¹. LADH, en présence du co-facteur NADH, peut réduire les cétones et les aldéhydes à leurs dérivés respectifs de l’alcool². En présence de NAD^,LADH peut effectuer une catalyse inverse de l’oxydation des alcools aux cétones et aux aldéhydes². La structure cristalline du site actif de la LADH montre que son centre métallique de zinc(II) est lié à un atome d’azote, fourni par une chaîne latérale d’histidine et deux atomes de soufre et offert par deux ligands de cystéine³. D’autres recherches ont montré que le centre de zinc métal est ligated avec une molécule d’eau labile, résultant en la géométrie pseudo-tetrahedral autour du centre métallique⁴.

Nous avons déjà signalé et utilisé SNS pinces ligand précurseurs ainsi que métallé les précurseurs ligand avec ZnCl₂ pour former Zn(II) complexes qui contiennent le précurseur de ligand tridentate^5,6,7. Ces précurseurs ligand sont indiqués dans la figure 1. Ces complexes de zinc (II) ont montré l’activité pour la réduction stoichiométrique des aldéhydes électron-pauvres et sont donc des complexes modèles pour LADH. Par la suite, la synthèse et la caractérisation d’une série de complexes de cuivre (I) et de cuivre (II) qui contiennent des précurseurs de ligand SNS ont été rapportés^8,9,10.

Bien que la LADH soit une enzyme de zinc(II), nous sommes intéressés à préparer des complexes modèles de cobalt (II) de LADH afin d’obtenir plus d’informations spectroscopiques sur les analogues de cobalt(II) de LADH. Les complexes de cobalt (II) sont colorés, tandis que les complexes de zinc(II) sont blanc cassé. Puisque les complexes de cobalt (II) sont colorés, des spectres ultraviolets visibles des complexes peuvent être obtenus, dans lesquels des informations sur la force du champ de ligand dans les complexes de cobalt(II) peuvent également être recueillies. En utilisant les informations des calculs gaussiens et les spectres visibles ultra-violets obtenus expérimentalement, les informations sur la force du champ ligand peuvent être déduites. Cobalt(II) est un bon substitut pour le zinc(II), puisque les deux ions ont des radii ioniques similaires et des acidités similaires de Lewis^11,12.

La méthode présentée consiste à synthétiser et caractériser les complexes modèles pour tenter d’imiter le comportement catalytique naturel de LADH^5,6. Nous avons déjà métallé une famille de précurseurs ligand avec ZnCl₂ pour former zinc (II) complexes modèles de LADH, qui a modélisé la structure et la réactivité du site actif de zinc dans LADH⁴. Grâce à de multiples expériences, ces ligands pinces se sont avérés robustes dans des conditions environnementales différentes et sont restés stables avec une collection diversifiée de R-groupes attachés. ^5,6

Les ligands Tridentate sont préférables par rapport aux ligands monodentate, parce qu’ils se sont avérés être plus de succès avec la métalisation en raison des effets chélatés forts des ligands tridentate. Cette observation est due à une entropie plus favorisée de la formation de ligand de pince de tridentate par rapport à un ligand monodentate¹³. En outre, les ligands de pince tridentate sont susceptibles d’empêcher la dimécrétisation des complexes métalliques, ce qui est favorisé parce que la dimerisation est susceptible de ralentir l’activité catalytique d’un complexe¹⁴. Ainsi, l’utilisation de ligands de pince tridentate a été prouvée réussie dans la chimie organométallique dans la préparation des complexes actifs et robustes catalytiques. Les complexes de pinces SNS ont été moins étudiés que les autres systèmes de pinces, car les complexes de pinces contiennent habituellement des métaux de transition de deuxième et troisième^{rangées 15}.

Cette recherche sur les métalloenzymes peut aider à mieux comprendre leur activité enzymatique, qui peut être appliquée à d’autres domaines de la biologie. Cette méthode de synthèse des complexes modèles par rapport à la méthode alternative (synthétiser toute la protéine de LADH) est favorable pour un certain nombre de raisons. Le premier avantage est que les complexes modèles sont faibles en masse moléculaire et sont encore capables de représenter avec précision l’activité catalytique et les conditions environnementales du site actif de l’enzyme naturelle. Deuxièmement, les complexes modèles sont plus simples à travailler et à produire des données fiables et relatables.

Ce manuscrit décrit la préparation et la caractérisation synthétiques de deux complexes modèles de pinces de cobalt(II) de LADH. Les deux complexes disposent d’un ligand pince qui contient du soufre, de l’azote et des atomes de donneurs de soufre. Le premier complexe (4) est basé sur un précurseur imidazole, et le second (5) est basé sur un précurseur triazole. Les complexes montrent la réactivité pour la réduction de stoichiométrie des aldéhydes pauvres d’électrons en présence d’un donneur d’hydrogène. Ces résultats de réactivité seront rapportés dans un manuscrit ultérieur.

Protocole

Synthèse du chloro-(n³-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methyleneimidazole-2-thione)pyridine]cobalt(II)tetrachlorocobaltate [4]

1. Pour préparer le complexe 4, ajouter 0,121 g (3,12 x 10^-4 mol) de 2,6-bis (N-isopropyl-N'-methyleneimidazole-2-thione)pyridine (C₁₉H₂₅N₅S₂)⁶ à 15 mL d’acétonitrile dans un flacon de fond rond de 100 ml. Ensuite, à cette solution, ajouter 0,0851 g (3,58 x 10^-4 mol) de chlorure de cobalt (II) hexahydrate (CoCl₂'6H₂O). La solution de réaction devrait changer la couleur du jaune clair au vert émeraude immédiatement après l’ajout du chlorure de cobalt(II).
2. Ajouter une barre de remuer au flacon. Reflux et remuer la réaction pendant 20 h pour assurer une réaction complète. Retirer le solvant à l’aide d’un rotovap sous pression réduite.

2. Recrystallization of chloro-(n³-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methyleneimidazole-2-thione)pyridine]cobalt(II)tetrachlorocobaltate [4] par diffusion lente de vapeur

1. Dissoudre le soluté dans l’acétonitrile (7,5 ml), filtrer la solution et placer la solution uniformément dans 1 flacons dram. Remplir chaque flacon de 1,5 ml de solution d’acétonitrile.
   1. Ajouter le coton pour plafonner les flacons, ce qui permet une diffusion lente de vapeur. Ajuster le coton confortablement dans l’ouverture au sommet de la fiole.
   2. Placer les flacons dans un bocal de 240 ml contenant 50 ml d’éther de diéthyle. Fermez le pot avec un bouchon.
   3. Laissez les cristaux se développer sur une période de 1 semaine.
      REMARQUE : La recrystallisation peut prendre plus d’un jour.

3. Synthèse du chloro-(n³-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methylenetriazole-2-thione)pyridine]cobalt (II)tétrachlorocobaltate [5]

1. Pour préparer le complexe 5, ajouter 0,183 g (4,70 x 10^-4 mol) de 2,6-bis (N-isopropyl-N'-methylenetriazole-2-thione)pyridine (C₁₇H₂₃N₇S₂)⁶ à 15 mL d’acétonitrile dans un flacon de fond rond de 100 ml. À cette solution, ajouter 0,223 g (9,37 x 10^-4 mol) d’hexahydrate de chlorure de cobalt (CoCl₂à 6H₂O). La solution de réaction devrait changer la couleur du jaune clair au bleu royal immédiatement après l’ajout du chlorure de cobalt(II).
   1. Ajouter une barre de remuer au flacon. Reflux et remuer la réaction pendant 20 h pour assurer une réaction complète. Retirer le solvant à l’aide d’un rotovap sous pression réduite.

4. Recrystallization of chloro-(n³-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methylenetriazole-2-thione)pyridine]cobalt(II)tetrachlorocobaltate [5] par diffusion lente de vapeur

1. Dissoudre le soluté dans l’acétonitrile (9,0 ml), filtrer la solution et placer la solution uniformément dans 1 flacons dram. Remplir chaque flacon de 1,5 ml de solution d’acétonitrile.
   1. Ajouter le coton pour plafonner les flacons, ce qui permet une diffusion lente de vapeur. Ajuster le coton confortablement dans l’ouverture au sommet de la fiole.
   2. Placer les flacons dans un bocal contenant 50 ml d’éther de diéthyle. Fermez la fiole avec un bouchon.
   3. Laissez les cristaux se développer sur une période de 1 semaine.
      REMARQUE : La recrystallisation peut prendre plus d’un jour.

5. Cristallographie aux rayons X

1. Montez un cristal de 4 sur une boucle en nylon. Recueillir les données sur un diffractomètre Rigaku Oxford Diffraction. Ici, les données de diffraction aux rayons X sont collectées à 173(2) K. Résoudre la structure cristalline à l’aide de programmes de solutions de structure Olex2¹⁶ et ShelXT¹⁷ à l’aide de méthodes directes. Affiner la structure avec le paquet de raffinement ShelXL¹⁸ en utilisant la minimisation du moins de carrés.
2. Montez un cristal de 5 sur une boucle en nylon. Recueillir les données de diffraction aux rayons X sur un diffractomètre Rigaku Oxford Diffraction. Ici, les données de diffraction aux rayons X sont collectées à 173(2) K. Résoudre la structure cristalline à l’aide de programmes de solutions de structure Olex2¹⁶ et ShelXT¹⁷ à l’aide de méthodes directes. Affiner la structure avec le paquet de raffinement ShelXL¹⁸ en utilisant la minimisation du moins de carrés.

Résultats

Synthèse
Les synthèses des complexes 4 et 5 ont été réalisées avec succès en réagissant à une solution d’acétylière contenant un précurseur de ligand bis-thione avec l’hexahydrate de chlorure de cobalt (II)(figure 2). Cette réaction s’est produite à une température de reflux en présence de l’air. En général, les complexes 4 et 5 ont été observés pour être solubles dans l’ac...

Discussion

La préparation des complexes 4 et 5 est facile. L’étape clé consiste à ajouter le solide CoCl₂'6H₂O à une solution d’acétylure qui contient le précurseur de ligand respectif. La solution devient vert foncé quelques secondes après l’ajout de CoCl₂6H₂O pour former le complexe 4. La solution devient bleu vif après l’ajout de CoCl₂6H₂O pour former le complexe 5. Pour assurer ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL Round Bottomed Flask	Chem Glass	CG150691	100mL Single Neck Round Bottomed Flask, 19/22 Outer Joint
Acetonitrile	Fisher	HB9823-4	HPLC Grade
Chiller for roto-vap	Lauda	L000638	Alpha RA 8
Cobalt Chloride hexahydrate	Acros Organics	AC423571000	Acros Organics
Diethyl Ether	Fisher	E-138-1	Diethyl Ether Anhydorus
graduated cylinder	Fisher	S63456	25 mL graduated cylinder
hotplate	Fisher	11-100-49SH	Isotemp Basic Stirring Hotplate
jars	Fisher	05-719-481	250 mL jars
Ligand	-----	-----	Synthezied previously by Professor Miecznikowski
medium cotton balls	Fisher	22-456-80	medium cotton balls
one dram vials	Fisher	03-339	one dram vials with TFE Lined Cap
pipet	Fisher	13-678-20B	5.75 inch pipets
pipet bulbs	Fisher	03-448-21	Fisher Brand Latex Bulb for pipet
recrystallizing dish for sand bath	Fisher	08-741 D	325 mL recrystallizing dish for sand bath
reflux condensor	Chem Glass	CG-1218-A-22	Condenser with 19/22 inner joint
Rotovap	Heidolph Collegiate	36000090	Brinkmann; Heidolph Collegiate Rotary Evaporator with Heidolph WB eco bath Heidolph Rotary Evaporator
sea sand for sandbath	Acros Organics	612355000	washed sea sand for sand bath
Stir bar	Fisher	07-910-23	Egg-Shaped Magnetic Stir Bar
Vacum grease	Fisher	14-635-5D	Dow Corning High Vacuum Grease
vacuum pump for rotovap	Heidolph Collegiate	36302830	Heidolph Rotovac Valve Control