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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La génération de rotavirus recombinants à partir de l’ADN plasmide fournit un outil essentiel pour l’étude de la réplication et de la pathogénie du rotavirus, et le développement de vecteurs et de vaccins d’expression de rotavirus. Ici, nous décrivons une approche simplifiée de génétique inverse pour générer des rotavirus recombinés, y compris des souches exprimant des protéines fluorescentes de reporter.

Résumé

Les rotavirus sont une population importante et évolutive de virus à ARN à double brin segmenté qui causent une gastro-entérite sévère chez les jeunes de nombreuses espèces hôtes mammifères et aviaires, y compris les humains. Avec l’avènement récent des systèmes de génétique inverse du rotavirus, il est devenu possible d’utiliser la mutanèse dirigée pour explorer la biologie du rotavirus, modifier et optimiser les vaccins antirotavirus existants, et développer des vecteurs vaccinaux multitargets rotavirus. Dans ce rapport, nous décrivons un système de génétique inverse simplifié qui permet le rétablissement efficace et fiable des rotavirus recombinants. Le système est basé sur la co-transfection des vecteurs de transcription T7 exprimant le rotavirus pleine longueur (MD) ARN et un vecteur CMV codant une enzyme de plafonnement de l’ARN dans les cellules BHK produisant constitutivement la polyméase d’ARN T7 (BHK-T7). Les rotavirus recombinants sont amplifiés en supervisant les cellules BHK-T7 transfectedes avec des cellules MA104, une lignée de cellules rénales de singe qui est fortement permissive pour la croissance du virus. Dans ce rapport, nous décrivons également une approche pour générer des rotavirus recombinants qui expriment une protéine distincte de reporter fluorescent par l’introduction d’un élément de stop-restart translationnel 2A dans le segment 7 du génome (NSP3). Cette approche évite de supprimer ou de modifier l’un des cadres de lecture ouverts viraux, permettant ainsi la production de rotavirus recombinants qui conservent des protéines virales entièrement fonctionnelles tout en exprimant une protéine fluorescente.

Introduction

Les rotavirus sont des causes majeures de gastro-entérite sévère chez les nourrissons et les jeunes enfants, ainsi que les jeunes de nombreuses autres espèces de mammifères et devian1. En tant que membres de la famille Reoviridae, les rotavirus ont un génome segmenté d’ARN à double brin (ARNN). Les segments du génome sont contenus dans une virion icosahedral nonveloped formée à partir de trois couches concentriques de protéines2. Sur la base du séquençage et de l’analyse phylogénétique des segments du génome, neuf espèces de rotavirus (A-D, F-J) ont été définies3. Ces souches comprenant l’espèce de rotavirus A sont responsables de la grande majorité des maladies humaines4. L’introduction de vaccins antirotavirus dans les programmes de vaccination des enfants à partir de la dernière décennie est corrélée avec des réductions significatives de la mortalité et de la morbidité des rotavirus. Plus particulièrement, le nombre de décès infantiles associés au rotavirus est passé d’environ 528 000 en 2000 à 128 500 en 20164,5. Les vaccins antirotavirus sont formulés à partir de souches vivantes atténuées du virus, avec 2 à 3 doses administrées aux enfants avant l’âge de 6 mois. Le grand nombre de souches de rotavirus génétiquement diverses circulant chez l’homme et d’autres espèces de mammifères, combinée à leur capacité d’évoluer rapidement par la mutagénèse et le réassorignement, peut conduire à des changements antigéniques dans les types de rotavirus infectant les enfants6,7,8. Ces changements peuvent miner l’efficacité des vaccins existants, nécessitant leur remplacement ou leur modification.

Le développement de systèmes de génétique inverse entièrement basés sur le plasmide permettant la manipulation de l’un des 11 segments du génome du rotavirus n’a été réalisé que récemment9. Avec la disponibilité de ces systèmes, il est devenu possible de démêler les détails moléculaires de la réplication et de la pathogénie du rotavirus, de mettre au point des méthodes améliorées de dépistage à haut débit pour les composés antirotavirus et de créer de nouvelles classes potentiellement plus efficaces de vaccins antirotavirus. Pendant la réplication de rotavirus, les ARN viraux plafonnés ()RN non seulement guident la synthèse des protéines virales, mais servent également de modèles pour la synthèse des segments du génome de l’ARNS10,,11. Tous les systèmes de génétique inverse de rotavirus décrits à ce jour reposent sur la transfection des vecteurs de transcription T7 dans les lignées cellulaires des mammifères comme source d’ARN dérivés de l’ADN pour récupérer les virus recombinés9,12,13. Dans les vecteurs de transcription, les ADNv virales pleine longueur sont positionnées entre un promoteur T7 en amont et le ribozyme du virus du delta de l’hépatite en aval (HDV) de telle sorte que les ARN virales sont synthétisés par la polymérase à ARN T7 qui contiennent des 5' et 3'termini authentiques(figure 1A). Dans le système de génétique inverse de première génération, des virus recombinants ont été fabriqués en transfectant des cellules rénales de hamster de bébé exprimant la polymérase d’ARN de T7 (BHK-T7) avec des vecteurs de transcription de 11 T7 (pT7), chaque synthèse de direction d’un ARN unique ()RNA de la souche simienne du virus SA11, et trois plasmides d’expression de promoteur-drive CMV, un codant la protéine de fusion de réovirus aviaire p10FAST et deux sous-unités codantes du complexe d’enzymes de plafonnement du virus vaccinia D1R-D12L9. Les virus REcombinants SA11 générés dans les cellules BHK-T7 transfectedes ont été amplifiés en supervisant avec des cellules MA104, une lignée cellulaire permissive pour la croissance du rotavirus. Une version modifiée du système de génétique inverse de première génération a été décrite qui n’utilise plus de plasmides de soutien12. Au lieu de cela, le système modifié génère avec succès des rotavirus recombinés simplement en transfectant les cellules BHK-T7 avec les vecteurs de transcription SA11 T7 11, avec la mise en garde que les vecteurs pour l’usine virale (viroplasme) blocs de construction (protéines nontructurales NSP2 et NSP5) sont ajoutés à des niveaux 3 fois plus élevés que les autres vecteurs14,15. Des versions modifiées du système génétique inverse ont également été développées qui soutiennent la récupération des souches humaines DE KU et Odelia de rotavirus16,17. Le génome du rotavirus est remarquablement favorable à la manipulation par la génétique inverse, avec des virus recombinés générés à ce jour avec des mutations introduites dans VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, et NSP522,23. Parmi les virus les plus utiles générés à ce jour sont ceux qui ont été conçus pour exprimer des protéines de journaliste fluorescent (FPs)9,12,21,24,25.

Dans cette publication, nous fournissons le protocole pour le système génétique inverse que nous utilisons dans notre laboratoire pour générer des souches recombinantes de rotavirus SA11. La caractéristique clé de notre protocole est la co-transfection des cellules BHK-T7 avec les vecteurs de transcription 11 pT7 (modifié pour inclure les niveaux de 3x de la pT7/NSP2SA11 et pT7/NSP5SA11 vecteurs) et un vecteur d’expression CMV codant le virus de la peste porcine africaine (ASFV) NP868R capping enzyme21 (Figure 22). Dans nos mains, la présence du plasmide NP868R conduit à la production de titres plus élevés de virus recombinés par des cellules TRANSfected BHK-T7. Dans cette publication, nous fournissons également un protocole pour modifier le plasmide pT7/NSP3SA11 de telle sorte que des virus recombinés peuvent être générés qui expriment non seulement le produit protéique du segment 7 NSP3, mais aussi un FP distinct. Ceci est accompli en réingénier le cadre de lecture ouverte NSP3 (ORF) dans le plasmide pT7/NSP3SA11 pour contenir un élément d’arrêt-redémarrage translationnel en aval 2A suivi d’un FP ORF(figure 1B)24,26. Grâce à cette approche, nous avons généré des rotavirus recombinés exprimant divers FP: UnaG (vert), mKate (rouge lointain), mRuby (rouge), TagBFP (bleu), CFP (cyan), et YFP (jaune)24,27,28. Ces rotavirus exprimant LE FP sont fabriqués sans supprimer l’ORF NSP3, ce qui donne des virus qui devraient encoder un effectif complet de protéines virales fonctionnelles.

Protocole

1. Préparation des médias et entretien de la culture cellulaire

  1. Obtenez des cellules rénales de hamster de bébé exprimant constitutivement la polymérase d’ARN de T7 (BHK-T7) et les cellules MA104 de rein vert africain de singe.
    REMARQUE : Les cellules BHK-T7 (ou BSR-T7) ne sont pas disponibles dans le commerce, mais sont une lignée cellulaire commune de laboratoires utilisant la génétique inverse pour étudier la biologie du virus de l’ARN. La lignée cellulaire BHK-T7 utilisée dans ce protocole a été obtenue du Dr Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), un co-développeur de la lignée cellulaire originale BHK exprimant la polymérase T7 RNA29. Les cellules MA104 sont disponibles auprès de la Collection européenne des cultures de cellules authentifiées (ECACC) et de l’American Type Culture Collection (ATCC).
  2. Préparer les milieux culturels suivants dans un environnement stérile, de préférence un cabinet de sécurité biologique de classe II. Entreposez les supports dans l’obscurité à 4 oC et réchauffez-vous jusqu’à 37 oC immédiatement avant l’utilisation.
    REMARQUE : Des sources de composants médiatiques sont fournies dans la Table des Matériaux.
    1. Pour préparer le milieu incomplet DMEM, combinez 500 ml du milieu essentiel minimum (MEM) modifié de Dulbecco contenant 4,5 g/L de glucose et 1 % de glutamine avec 5 ml de 100x pen-streptocoque.
    2. Pour préparer le milieu complet DMEM, mélanger 500 ml de milieu incomplet DMEM avec 25 ml de sérum bovin fœtal (FBS).
    3. Pour préparer le milieu incomplet GMEM, combinez 500 ml de milieu essentiel minimum de Glasgow, 5 ml de glutamine 100x, 50 ml de bouillon de tryptose-phosphate (TPB), 5 ml de 100x d’acides aminés non essentiels (NEAA) et 5 ml de 100x stylo-strep.
    4. Pour préparer le support complet GMEM, combinez 500 ml de milieu incomplet GMEM avec 25 ml de FBS inactivé à la chaleur.
    5. Pour préparer le milieu complet GMEM-G, ajoutez 10 ml de 50 mg/mL de génétique (G418) à 500 ml de milieu complet GMEM.
    6. Pour préparer le support incomplet SMEM, combinez 500 ml du MEM de l’Aigle modifié de Joklik, 5 ml de glutamine 100x, 50 ml de TPB, 5 ml de NEAA 100x et 5 ml de 100x pen-strep.
  3. Cellules de culture MA104 dans les flacons T75 ou T175 contenant 12 ou 25 ml de milieu complet de DMEM, respectivement. Pour passer les cellules MA104 qui ont atteint 100% de confluence, rincez le monolayer cellulaire 2x avec saline tamponnée de phosphate (PBS), dissociez avec la trypsine (0,05%)-EDTA (0,1%) et de la résuspendance en 5 (flacon T75) ou 10 ml de (T175 flacon) de DMEM milieu incomplet.
    1. Placer 0,5 à 1,0 ml de cellules résutilisées dans des flacons frais et apporter au volume final approprié en ajoutant le support complet DMEM. Placer les flacons dans un incubateur de 37 oC, 5 % de CO2.
  4. Propager les cellules BHK-T7 dans les flacons T75, en alternance entre l’utilisation de GMEM et le support complet GMEM-G à chaque tour de passage. Pour sous-culture des cellules BHK-T7 qui ont atteint 100% de confluence, rincer le monolayer cellulaire 2x avec PBS, dissocier avec la solution trypsin-EDTA, et resuspendre dans 5 ml de milieu.
    1. Après avoir placé 15 ml de GEM ou de support complet GMEM-G dans un flacon T75 frais, ajoutez quatre gouttes de cellules BHK-T7 résaisie. Placer le flacon dans un incubateur de 37 oC, 5 % de CO2.

2. Préparation Plasmide

  1. Obtenir les plasmides suivants exprimant le rotavirus SA11 ()RNAs d’Addgene : pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11, et pT7/NSP5SA11. Obtenir le plasmide exprimant l’enzyme de plafonnement ASFV (pCMV/NP868R) des auteurs21.
    REMARQUE : Les plasmides modifiés pT7/NSP3SA11 conçus pour exprimer un FP grâce à l’activité d’un élément translationnel 2A (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP) peuvent également être obtenus auprès des auteurs24,26. pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmides exprimant les FPs suivants sont disponibles: UnaG (vert), mKate (rouge lointain), mRuby (rouge), TagBFP (bleu), CFP (cyan), et YFP (jaune)24.
  2. Transformez les plasmides en Ecompétents. coli coli DH5 et propagation de bactéries sur les plaques d’agar de bouillon de Luria contenant l’antibiotique approprié. Cultivez des cultures bactériennes cueillies dans des colonies individuelles et préparez de plus petites quantités de plasmide (20 g) à l’aide d’un kit de purification de miniprep de spin(tableau des matériaux), selon les instructions du fabricant. Préparer de plus grandes quantités de plasmide à partir de cultures bactériennes à l’aide de kits de purification midi et maxi(Tableau des matériaux).
    REMARQUE : Des plasmides adaptés au système génétique inverse ont également été préparés avec d’autres kits de purification plasmide. Il n’est pas nécessaire de préparer des plasmides à l’aide de kits spécialement conçus pour générer du matériel sans endotoxine.
  3. Ajuster les concentrations de plasmides purifiés à 1 mg/mL dans l’eau de grade de biologie moléculaire sans nucléase. Vérifiez la pureté du plasmide en confirmant un rapport d’absorption 260/280 de 1,8 à l’aide d’un spectrophotomètre. En outre, utilisez l’électrophorèse sur les gels agaroses de 0,8 % pour vérifier que les plasmides sont principalement surcoillifiés.
  4. Aliquot purifiait les plasmides en tubes de microcentrifugeuse stériles de 0,5 mL, contenant chacun 10 L. Stocker les plasmides à -80 oC.

3. Génération de virus recombinant

REMARQUE : La recherche sur le rotavirus humain et animal, y compris la production et la caractérisation des souches de rotavirus recombinantes, doit être traitée dans des conditions de biosécurité de niveau 2 (BSL-2) et exigera l’approbation préalable du Comité institutionnel de biosécurité (BAC). Les conditions de laboratoire appropriées de BSL-2 sont décrites dans la biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux (BMBL) produites par les Centers for Disease Control and Prevention (CDC)30.

  1. Jour 1 : ensemencement des cellules BHK-T7 en plaques de 12 puits
    1. Rincer un monolayer fraîchement confluent de cellules BHK-T7 contenu dans un flacon T75 2x avec PBS. Perturber le monolayer cellulaire avec la solution trypsin-EDTA et résaisi les cellules dans 5 mL de gmEM milieu complet.
    2. Utilisez un compteur cellulaire automatisé et une solution bleu trypan pour déterminer la concentration de cellules BHK-T7 viables dans le milieu. Cellules de graines en plaques de culture cellulaire de 12 puits, chaque puits contenant 2 x 105 cellules dans un volume total de 1 ml de GMEM (sans G418) milieu complet. Incuber dans un incubateur de CO2 à 37 oC et à 5 %. Les cellules devraient atteindre 80 à 90 % de confluence d’ici le deuxième jour.
  2. Jour 2 : transfection des cellules BHK-T7 avec mélanges plasmides
    1. Pour préparer le mélange de plasmides, combiner ce qui suit dans un tube de microcentrifuge de 0,5 mL à l’aide de stocks de plasmides ajustés à 1 mg/mL : 0,8 L chacun des plasmides SA11 pT7 VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 et NSP4, 2,4 L chacun des plasmides SA11 pT7 NSP2 et NSP5, et 0,8 L de pCMV/NP868R. Mélanger délicatement les plasmides en tapant sur le tube et recueillir le contenu par centrifugation d’impulsion. Pour préparer les virus recombinés exprimant des FP, remplacez pT7/NSP3SA11 par le plasmide pT7/NSP3-2A-3xFL-FP approprié.
      REMARQUE : Les mélanges de plasmide doivent être conservés sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient utilisés. Un tube séparé doit être préparé pour chaque transfection.
    2. Pour préparer le mélange de réactif moyen/transfection du sérum plasmide/réduction : Ajouter 110 l de milieu de sérum réduit (37 oC) à chaque mélangedeplasmides et mélanger en faisant doucement monter et descendre doucement. Ensuite, ajoutez 32 L de réactif transfection(tableau des matériaux) à chaque mélange moyen de sérum plasmide/réduit; cela donne une concentration de 2,5 l de réactif transfection par g de plasmide dans les mélanges. Les mélanges Vortex se mélangent doucement et incubatent à température ambiante pendant 20 min.
    3. Pendant la période d’incubation de 20 min, rincez les cellules BHK-T7 dans des plaques de 12 puits (préparées le jour 1) une fois avec 2 ml de support incomplet GMEM. Ensuite, ajouter 1 ml de support INmaux SMEM à chaque puits et retourner les plaques à l’incubateur.
    4. Après la période d’incubation de 20 min, ajoutez le mélange moyen/transfection de sérum plasmide/réduit drop-by-drop à chaque puits des plaques de 12 puits à l’aide d’un tuyauteur de 200 L. Plaques de roche et retour à un incubateur de CO2 à 37 oC et à 5 %.
  3. Jour 4 : supervision des cellules BHK-T7 transfectedes avec des cellules MA104
    1. Rincer un monolayer fraîchement confluent de cellules MA104 contenues dans un flacon T75 2x avec PBS. Perturber le monolayer à l’aide de la solution trypsin-EDTA et résuspendez les cellules dans 5 ml de support complet DMEM.
    2. À l’aide d’un compteur cellulaire automatisé et d’une solution bleu trypan, déterminez la concentration de cellules MA104 viables dans le milieu. Ajuster la concentration à 8 x 105 cellules MA104/mL dans le milieu incomplet DMEM et ajouter 0,25 ml de cellules suspendues (2 x 105 cellules) tomber dans le sens de la chute dans les puits contenant des cellules TRANSfected BHK-T7.
    3. Ajuster la concentration de trypsine (porcine de type pancréatique IX) dans le milieu à 0,5 g/mL en ajoutant 0,8 l de 1 mg/mL de bouillon de trypsine à chaque puits.
      REMARQUE : Les stocks de trypsine doivent être préparés dans PBS, aliquoted, et stockés à -20 oC.
    4. Utilisez les cellules MA104 restantes pour préparer des plaques de 6 puits qui seront nécessaires le jour 7 pour amplifier les virus recombinants. Pour ensemencer les plaques de 6 puits, diluer les cellules MA104 résaisies à une concentration de 1,5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet DMEM et placez 2 ml dans chaque puits. Placer les plaques dans un incubateur de CO2 à 37 oC et à 5 %.
  4. Jour 7 : récupération et amplification du virus recombinant des cellules transfectedes
    1. Soumettre les cellules BHK-T7/MA104 dans des plaques de 12 puits à trois cycles de gel-dégel dans des conditions stériles, plaques mobiles entre -20 oC congélateur et une surface de température ambiante. Après avoir transféré des lysates à 1,5 mL tubes, tubes de centrifugeuse pendant 10 min à 500 x g (4 oC) à granulés de gros débris cellulaires. Recueillir le supernatant et le stocker à 4 oC (à court terme) ou à -20 oC (à long terme).
    2. Laver les monocouches MA104 en plaques de 6 puits (préparées le jour 4) 2x avec PBS. Placez 2 ml de DMEM milieu incomplet à chaque puits qui contient 0,5 g/mL trypsin. Ajoutez 300 L de supernatant récupérés à partir de lysates de cellules BHK-T7/MA104 dans des puits et placez les plaques dans un incubateur de 37 oC et 5 % de CO2.
    3. Des plaques incubées pendant 7 jours ou jusqu’à ce que des effets cytopathiques complets (CPE) soient observés. Cellules MA104 de lyse dans des plaques de 6 puits par trois cycles de gel-dégel, puis transférer des lysates à 1,5 mL tubes de microcentrifuge. Pelleter de gros débris cellulaires par centrifugation pendant 10 min à 500 x g (4 oC). Transférer la cellule clarifiée lysates dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et stocker à -20 oC.

4. Isolation plaque des virus recombinants

  1. Activer les virus dans 100 l de lysates cellulaires clarifiés en ajoutant de la trypsine à une concentration finale de 10 g/mL et en incuber à 37 oC pendant 1 h. Préparer une série de dilution série 10 fois allant de 10à 10 à 10 -7 (1 ml chacun) dans le support incomplet DMEM.
  2. Rincer les monocouches MA104 en plaques de 6 puits 2x avec 2 ml de PBS et une fois avec le milieu incomplet DMEM. Ajouter 400 ml de dilutions lysate en double sur les plaques. Incuber les plaques pour 1 h dans un incubateur de CO 2 de 37 oC, de 5 % de CO2, en se balançant toutes les 10 à 15 minutes pour redistribuer les dilutions sur le monolayer.
  3. Préparer une solution de superposition agarose-MEM en combinant des volumes égaux du milieu essentiel minimal de 2x Eagle (EMEM; pré-réchauffer à 37 oC) avec 1,5% d’agarose qui a été fondu dans l’eau à l’aide d’un four à micro-ondes et précoolé à 45 oC. Maintenir la solution de superposition à 42 oC à l’aide d’un bain d’eau et s’ajuster à une concentration finale de 0,5 g/mL trypsin immédiatement avant de les placer sur les cellules.
  4. Retirez les dilutions lysate des plaques de 6 puits, puis rincez les cellules une fois avec 2 ml de DMEM incomplet. Superposer délicatement 3 ml de la solution de superposition agarose-MEM sur le monolayer cellulaire contenu dans chaque puits. Laisser la superposition d’agarose durcir à température ambiante, puis retourner les plaques à l’incubateur.
  5. Trois jours plus tard, préparez une solution de superposition agarose-MEM comme à l’étape 4.3 et porter à 42 oC. Immédiatement avant l’utilisation, ajustez la solution de superposition à une concentration finale de rouge neutre de 50 g/mL(tableau des matériaux).
  6. Ajouter 2 ml de la solution de superposition au-dessus de la couche d’agarose existante dans les plaques de 6 puits. Après avoir laissé durcir la nouvelle couche d’agarose, retourner les plaques à l’incubateur. Protégez les solutions et les plaques contenant du rouge neutre contre l’exposition à la lumière.
  7. Au cours des 6 h suivants, identifiez les plaques de rotavirus dans les plaques de 6 puits à l’aide d’une boîte lumineuse. Choisissez des plaques clairement définies à l’aide de pipets de transfert jetables, récupérant des bouchons d’agarose qui s’étendent entièrement à la couche cellulaire.
  8. Expulser la prise dans un tube de 1,5 mL contenant 0,5 ml de milieu incomplet DMEM et vortex l’échantillon pour 30 s. Amplifier le virus isolé en plaques s’est élancé dans le milieu par propagation sur les monocounteurs MA104 dans des plaques de 6 puits ou des flacons T25 contenant du milieu DMEM et 0,5 g/mL trypsin.
    REMARQUE : Des renseignements supplémentaires concernant l’isolement et le titrage du rotavirus par essai de plaque sont disponibles dans Arnold et coll.31.

5. Gel électrophoresis de dsRNA viral

  1. Placez 600 l de lysates cellulaires infectés clarifiés et 400 l de thiocyanate de guanidinium dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL, le vortex pour 30 s et incubate à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 200 L de chloroforme, vortex pour 30 s, et incuber pour 3 min. Après centrifugage pendant 5 minutes à 13 000 x g (4 oC), transférer 550 L de la phase aqueuse supérieure en tubes frais.
  2. Récupérez le dsRNA viral de la phase aqueuse en ajoutant 2 volumes (900 ll) d’alcool isopropyl froid et tubes d’inversion 4 à 6x. Après avoir cocu à température ambiante pendant 10 min, tubes de centrifugeuse pendant 10 min à 13 000 x g (4 oC). Jetez les supernatants et conservez les granulés d’ARN.
  3. Laver les granulés en ajoutant 1 ml d’éthanol à 75 % dans le tube, inverser une fois et centrifuger pendant 5 min à 7 500 x g (4 oC). Après avoir soigneusement enlevé le lavage à l’éthanol à l’aide d’un tuyauteur, laissez les granulés d’ARN sécher à l’air sur le banc de laboratoire pendant 5 à 10 min. Dissoudre les granulés d’ARN dans 15 l’eau de biologie moléculaire sans nucléase et entreposez-les à -20 oC.
  4. Combinez 10 L d’échantillons dissous d’ARN avec 2 L de tampon de chargement d’ADN de 6x, chargez-les sur des mini gels polyacrylamide préfabriqués de 10 % (ou équivalents moulés à la main) et résolvez les ARN par électrophoresis dans le tampon tris-glycine pendant 2 h sous un courant constant (16 mA). Faire tremper les gels pendant 5 à 10 min dans l’eau contenant du bromure d’éthidium de 1 g/mL et détecter les segments du génome du rotavirus à l’égard d’un transilluminateur UV.

6. Récupération et séquençage du dsRNA viral

  1. Localisez les bandes virales de dsRNA sur les gels de polyacrylamide de préférence en utilisant la lumière UV longue longueur d’onde de basse intensité, pour éviter de générer des liens croisés nucléiques-acides. À l’aide d’une lame de rasoir fraîche, découpez des fragments de gel contenant des bandes dsRNA et transférez-vous dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.
  2. Après avoir ajouté 10 à 20 l’eau sans RNase, écraser chaque fragment avec un pilon de granule jetable sans RNase conçu pour s’adapter à un tube de microcentrifuge de 1,5 mL ou en tirant de haut en bas à travers une aiguille de 18 G. Incuber des fragments écrasés pendant la nuit à 4 oC.
  3. Récupérez 3 L de liquide dans les tubes contenant des fragments de gel concassé. Générer des CDNA des dsRNAs viraux à l’aide d’un kit de réaction en chaîne de polymérase inversée en une seule étape (RT-PCR) kit(Tableau des matériaux) et des amorces oligonucléotides appropriées.
    REMARQUE : Les produits PCR sont purifiés par gel avec un kit de nettoyage PCR(Tableau des matériaux) et envoyés pour le séquençage de nuit, avec les amorces, par les services commerciaux de séquence d’ADN.

7. Analyse immunoblot des protéines virales

  1. Graine plaques de 6 puits avec 3 x 105 cellules MA104 par puits dans un volume total de 2 ml de DMEM moyen complet. Placer les plaques dans un incubateur de 37 oC, 5 % de CO2 et laisser jusqu’à ce que les cellules atteignent la confluence (3 à 5 jours).
    REMARQUE : Les puits avec monolayers confluents contiendront 1,2 x 106 cellules.
  2. Traiter les supernatants clarifiés en incuber avec une trypsine de 10 g/mL à 37 oC pendant 1 h pour activer les particules de rotavirus recombinantes contenues en elles.
  3. Rincer les monocouches MA104 en plaques 6 puits 2x avec 2 ml de PBS. Infecter les cellules en ajoutant, à chaque puits, 200 L d’inoculum contenant 3 à 5 unités de formation de plaque (PFU) par cellule de rotavirus activé par trypsine dans le milieu incomplet DMEM. Remettre les assiettes à l’incubateur.
  4. Tous les 10 minutes, enlever les assiettes et rocher doucement pour redistribuer l’inoculum à travers le monolayer cellulaire. Après 1 h, remplacer l’inoculum par 2 ml de milieu incomplet DMEM.
  5. À 8 h après l’infection, rincer les cellules dans les plaques 6-puits 2x avec PBS. Gratter les cellules en 750 l de PBS et transférer le volume à un tube de microcentrifuge de 1,5 mL. Rincer la plaque avec un autre 750 L de PBS et combiner avec l’échantillon précédent recueilli de 750 l.
  6. Cellules de granule dans l’échantillon par centrifugage à 5.000 x g pendant 10 min à 4 oC. Après avoir jeté le supernatant, entreposez les granulés cellulaires à -80 oC jusqu’à ce qu’ils soient traités.
  7. Préparer le tampon de lyse cellulaire contenant 300 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2% Triton X-100 et 1x EDTA-libre inhibiteur complet de protéase. Après avoir ajouté 300 l de tampon de lyse aux granulés de cellules congelées, brièvement des échantillons de vortex et incubate sur la glace pendant 10 min.
  8. Répétez le processus de vortexing et d’incubation d’échantillons sur la glace 3x. Ensuite, des échantillons de centrifugeuses à 15 000 x g pendant 10 min à 4 oC, puis collectent des supernatants et entreposent à -80 oC.
  9. Résoudre les protéines contenues dans des volumes de 20 L d’échantillons supernatants par électrophoresis sur des mini-gels en polyacrylamide linéaire préfabriqués de 8 à 16 % et transférer dans des membranes de nitrocellulose. Bloquer les membranes en incuber avec PBS-Tween 20 (0,02%) solution contenant 5 % de lait sec non gras.
  10. Sondez les membranes en incuber avec un ou plusieurs anticorps primaires (p. ex., l’anti-NSP3 ou l’anti-VP6 anti-VP6 de souris, l’anticorps anti-flag M2 monoclonal de souris ou l’anticorps anti-PCNA monoclonal de lapin). Détecter les anticorps primaires en incuber les membranes avec l’IgG anti-souris de cheval, le porc anti-guinée IgG, ou les anticorps secondaires de raifort anti-lapin de chèvre IgG peroxidase-conjugués, suivis du substrat de chemiluminescence de chemiluminescence de chemiluminescence de raifort amélioré de chemiluminescence de chemiluminish de chemiluminescence. Visualisez les signaux de luminescence à l’aide d’un système d’imagerie gel (Tableau des matériaux) ou d’un film à rayons X.

8. Imagerie à cellules vivantes des cellules infectées par des virus exprimant le FP

  1. Graine 6-puits plaques avec 3 x 105 cellules MA104 par puits dans un total de 2 mL de DMEM milieu complet. Placer les plaques dans un incubateur de 37 oC, 5 % de CO2 et laisser jusqu’à ce que les cellules atteignent la confluence (3 à 5 jours).
    REMARQUE : Les puits avec monolayers confluents contiendront 1,2 x 106 cellules.
  2. Activer les échantillons de rotavirus, de titer connu, par incubation avec 10 'g/mL trypsin à 37 oC pour 1 h.
  3. Rincer les plaques de 6 puits avec ma104 monolayers 2x avec 2 mL de PBS. Infecter les cellules en ajoutant à chaque puits 200 L d’inoculum contenant 3 à 5 PFU par cellule de rotavirus activé par trypsine dans le milieu incomplet DMEM. Remettre les assiettes à l’incubateur et les plaques de roche délicatement pour redistribuer l’inoculum à travers le monolayer cellulaire toutes les 10 minutes.
    REMARQUE : Les puits qui sont simulés infectés par l’inoculum DMEM sans virus doivent être inclus comme témoins.
  4. Après 1 h d’adsorption virale, rincer monolayer 2x par PBS et remplacer le milieu par 0,5 mL par puits de DMEM milieu incomplet. À 7,5 h après l’infection, remplacez le milieu de culture par le DMEM par une faible fluorescence de fond(tableau des matériaux). À 8 h après l’infection, utilisez un imageur de cellules vivantes pour examiner les cellules au grossissement 20x pour le signal vert, rouge ou bleu de fluorescence.

Résultats

Le protocole de génétique inverse décrit dans cet article se déroule par de multiples étapes distinctes : (1) la co-transfection des cellules BHK-T7 avec des vecteurs de transcription de rotavirus pT7 et un plasmide d’expression pCMV/NP868R, (2) supervision des cellules BHK-T7 transfectedes avec des cellules MA104, (3) amplification des virus recombinés présents dans les cellules BHK-T7/MA104 lysates à l’aide de cellules MA104, et (4) l’isolement de la plaque du virus recombinant à l’aide des cellules MA...

Discussion

Dans notre laboratoire, nous comptons régulièrement sur le protocole de génétique inverse décrit ici pour produire des rotavirus SA11 recombinants. Avec cette approche, les individus ayant peu d’expérience dans les techniques de biologie moléculaire ou de travailler avec des rotavirus récupérer les virus recombinés, même sur leur première tentative. Nous avons généré près de 100 virus recombinés à la suite de ce protocole, y compris ceux dont les génomes ont été repeménent pour exprimer des proté...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R03 AI131072 et R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, et le Lawrence M. Blatt Endowment. Nous remercions les membres du laboratoire IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, et Guido Papa pour leurs nombreuses contributions et suggestions dans l’élaboration du protocole de génétique inversée.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) CellsContact: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-GelBio-Rad45608105
Cellometer AutoT4 viable cell counterNexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging SystemBio-Rad
ChloroformMP194002
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) SubstrateBio-Rad170-5060
Competent E.coli DH5alpha BacteriaLucigen60602-2
Complete Protease InhibitorPierceA32965
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended TipsMTC BioP4113-11
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Lonza12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM)Quality Biological115-073-101
Ethanol, Absolute (200 proof)Fisher BioreagentsBP2818-500
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml)Invitrogen15585-011
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat InactivatedCorning35-011-CV
Flag M2 Antibody, Mouse MonoclonalSigma-AldrichF1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep KitSigmaNA0200-1KT
Geneticin (G-418)Invitrogen10131-027
Gibco FluroBrite DMEMThermoFisherA1896701DMEM with low background fluorescence
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM)Gibco11710-035
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) ConjugatedCell-Signaling Technology7074S
Guinea Pig Anti-NSP3 AntiserumPatton lablot 55068
Guinea Pig Anti-VP6 AntierumPatton lablot 53963
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) ConjugatedKPL5220-0366
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) ConjugatedCell-Signaling Technology7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection KitJH Science25235
Isopropyl alcoholMacron3032-02
L-glutamine Solution (100x)Gibco25030-081
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar)RPI research productsL24020-2000.0
Medium 199 (M199) Culture MediumHycloneSh30253.01
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM)Lonza04-719Q
Monkey Kidney (MA104) CellsATCCATCC CRL-2378.1
NanoDrop One SpectrophotometerThermoScientific
Neutral Red Solution (0.33%)Sigma-AldrichN2889-100ml
Non-Essential Amino Acid Solution (100x)Gibco11140-050
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-GelInvitrogenXP00102BOX
Nuclease-Free Molecular Biology Grade WaterInvitrogen10977-015
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up KitTakara740609.25
Opti-MEM Reduced Serum MediumGibco31985-070
Pellet pestle (RNase-free, disposable)Fisher12-141-368
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep)Corning30-002-Cl
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10xFisher BioreagentsBP399-20
Porcine Trypsin, Type IX-SSigma-AldrichT0303
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1223
Qiagen Plasmid Maxi KitQiagen12162
Qiagen Plasmid Midi KitQiagen12143
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
SA11 pT7 Transcription VectorsAddgene89162-89172
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent ProteinsContact: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE AgaroseLonza50000For gel electrophoresis
SeaPlaque agaroseLonza50100For plaque assay
Superscript III One-Step RT-PCR kitInvitrogen12574-035
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer KitBio-Rad170-4270
Trans-Llot Turbo Transfer SystemBio-Rad
TransIT-LTI Transfection ReagentMirusMIR2306
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x)Bio-Rad161-0772
Triton X 100Fisher BioreagentsBP151-500
Trizol RNA Extraction ReagentAmbion15596026
Trypan blueCorning25-900-CI
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation SolutionQuality Biological118-087-721
Tryptose Phosphate BrothGibco18050-039
Tween-20VWR0777-1L
Vertrel VF solventZoroG0707178
Zoe Fluorescent Live Cell ImagerBio-Rad

Références

  1. Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
  2. Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
  3. . Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019)
  4. Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).
  5. Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
  6. Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
  7. McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
  8. Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
  9. Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
  10. Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
  11. Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
  12. Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
  13. Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
  14. Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
  15. Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
  16. Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
  17. Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
  18. Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
  19. Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
  20. Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
  21. Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
  22. Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
  23. Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
  24. Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
  25. Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
  26. Donnelly, M. L., et al. The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
  27. Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
  28. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
  29. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
  30. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).
  31. Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
  32. Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).

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