JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Генерация рекомбинантных ротавирусов из плазмидной ДНК является важным инструментом для изучения ротавирусной репликации и патогенеза, а также развития переносчиков и вакцин с использованием ротавирусного экспрессии. В этом мы описываем упрощенный обратный подход к генетике для генерации рекомбинантных ротавирусов, включая штаммы, выражающие флуоресцентные белки репортера.

Аннотация

Ротавирусы представляют собой большую и развивающуюся популяцию сегментированных двухцепочечных РНК-вирусов, вызывающих тяжелый гастроэнтерит у молодых многих видов млекопитающих и птиц, включая людей. С недавним появлением ротавирусной системы обратной генетики стало возможным использовать направленный мутагенез для изучения ротавирусной биологии, модификации и оптимизации существующих ротавирусных вакцин и разработки переносчиков ротавирусной многоцелевой вакцины. В этом отчете мы описываем упрощенную систему обратной генетики, которая позволяет эффективно и надежно восстановить рекомбинантные ротавирусы. Система основана на сотрансфокации векторов транскрипции T7, выражающих полноформатный ротавирус (КВ) РНК и вектор CMV, кодирующий фермент РНК в клетки BHK, образующие т7 РНК-полимеразы (BHK-T7). Рекомбинантные ротавирусы усиливаются, контролируя трансинфицированные клетки BHK-T7 с ma104 клетками, линией клеток почек обезьяны, которая является весьма вседозволенной для роста вируса. В этом отчете мы также описываем подход к генерации рекомбинантных ротавирусов, которые выражают отдельный флуоресцентный белок репортера путем введения 2A переводного элемента стоп-перезагрузки в сегмент генома 7 (NSP3). Такой подход позволяет избежать удаляния или модификации любого из вирусных открытых кадров для чтения, что позволяет выпускать рекомбинантные ротавирусы, которые сохраняют полностью функциональные вирусные белки, выражая флуоресцентный белок.

Введение

Ротавирусы являются основными причинами тяжелого гастроэнтерита у младенцев и маленьких детей, а также молодых многих других млекопитающих и птиц видов1. Как члены семейства Reoviridae, ротавирусы имеют сегментированный двухцепочечный геном РНК (dsRNA). Сегменты генома содержатся в неописуемом икосахедря, образованном из трех концентрических слоев белка2. На основе секвенирования и филогенетического анализа сегментов генома было определено девять видов ротавируса (A'D, F-J)3. Эти штаммы, включающие ротавирусного вида А, ответственны за подавляющее большинство болезней человека4. Внедрение ротавирусных вакцин в программы иммунизации детей, начиная с последнего десятилетия, коррелирует со значительным снижением смертности и заболеваемости ротавирусом. Примечательно, что число случаев смерти детей, связанных с ротавирусом, сократилось с примерно 528 000 в 2000 году до 128 500 в 2016 году4,,5. Ротавирусные вакцины формулируются из живых ослабленных штаммов вируса, при этом детям к 6 месяцам вводят от 2 до 3 доз. Большое количество генетически разнообразных штаммов ротавируса, циркулирующих в людях и других видах млекопитающих, в сочетании с их способностью быстро развиваться через мутагенез и реассортизу, может привести к антигенным изменениям в типах ротавирусов, заражающих детей6,,7,8. Такие изменения могут подорвать эффективность существующих вакцин, что требует их замены или модификации.

Разработка полностью плазмедных систем обратной генетики, позволяющих манипулировать любым из 11 сегментов ротавирусного генома, только недавно была достигнута9. С наличием этих систем стало возможным разгадать молекулярные детали репликации ротавируса и патогенеза, разработать усовершенствованные методы скрининга высокой пропускной записи на антиротавирусные соединения и создать новые потенциально более эффективные классы ротавирусных вакцин. Во время репликации ротавируса, ограниченные вирусные (К) РНК не только направляют синтез вирусных белков, но и служат шаблонами для синтеза потомства сегментов генома dsRNA10,11. Все ротавирусные системы обратной генетики, описанные на сегодняшний день, полагаются на трансфекцию переносчиков транскрипции T7 в клеточные линии млекопитающих в качестве источника кДНК-производных (Я)РНК, используемых в восстановлении рекомбинантных вирусов9,12,13. В транскрипции векторов, полнометражные вирусные cDNAs расположены между вверх по течению T7 промоутер и вниз по течению вируса дельты гепатита (HDV) ribozyme таким образом, что вирусные (К) РНК синтезируются T7 РНК полимеразы, которые содержат подлинные 5' и 3'-терминини (Рисунок 1A). В системе обратной генетики первого поколения рекомбинантные вирусы были сделаны путем трансфектирования клеток почек хомяка, выражающего полимеразу T7 РНК (BHK-T7) с 11 векторами транскрипции T7 (pT7), каждый направляющий синтез уникального (к) РНК штамма вируса SA11, и три CMV промоутер-драйв выражение плазмиды, один кодирования птичьего реовируса p10FAST синтеза белка и два encoding подразделения вируса вакцины D1R-D12L capping комплекс9. Рекомбинантные вирусы SA11, генерируемые в трансинфицированных клетках BHK-T7, были усилены путем наблюдения с помощью MA104 клеток, клеточной линии, разрешительной для роста ротавируса. Измененная версия системы обратной генетики первого поколения была описана, что больше не использует поддержку плазмиды12. Вместо этого, модифицированная система успешно генерирует рекомбинантные ротавирусы просто путем трансфектации BHK-T7 клеток с 11 SA11 T7 транскрипции векторов, с оговоркой, что векторы для вирусной фабрики (viroplasm) строительные блоки (неструктурные белки NSP2 и NSP5) добавляются на уровнях 3 раза выше, чем другие векторы14.15 Также разработаны модифицированные версии системы обратной генетики, которые поддерживают восстановление штаммов ротавируса16,,17. Геном ротавируса удивительно поддается манипуляции обратной генетики, с рекомбинантными вирусами, генерируемыми на сегодняшний день с мутациями, введенными в VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, и NSP522,23. Среди наиболее полезных вирусов, генерируемых до сих пор являются те, которые были разработаны, чтобы выразить флуоресцентные белки репортера (FPs)9,12,21,24,25.

В этой публикации мы предоставляем протокол для обратной генетической системы, которую мы используем в нашей лаборатории для генерации рекомбинантных штаммов ротавируса SA11. Ключевой особенностью нашего протокола является совместное перевод конторы клеток BHK-T7 с 11 переносчиками транскрипции pT7 (модифицированные, чтобы включить 3x уровни pT7/NSP2SA11 и pT7/NSP5SA11 векторов) иFigure 2вектор экспрессии CMV, кодирующий африканский свиной вирус (ASFV) NP868R.21 В наших руках наличие плазмиды NP868R приводит к выработке более высоких титрах рекомбинантных вирусов трансфицировоками БХК-Т7. В этой публикации мы также предоставляем протокол для изменения плазмида pT7/NSP3SA11 таким образом, что могут быть созданы рекомбинантные вирусы, которые выражают не только белок сегмента 7 NSP3, но и отдельный FP. Это достигается путем реинжиниринга NSP3 открытого чтения кадра (ORF) в pT7/NSP3SA11 плазмид содержать вниз по течению 2A переводный стоп-перезагрузки элемент следуют FP ORF (Рисунок 1B)24,26. Благодаря этому подходу, мы создали рекомбинантные ротавирусы, выражающие различные FPs: UnaG (зеленый), mKate (далеко-красный), mRuby (красный), TagBFP (синий), CFP (циан), и YFP (желтый)24,27,28. Эти FP-выражения ротавирусов производятся без удаляя NSP3 ORF, таким образом, что дает вирусы, которые, как ожидается, кодируют полный комплект функционирующих вирусных белков.

протокол

1. Подготовка средств массовой информации и поддержание культуры клеток

  1. Получить ребенка хомяка почек клетки, составляющие выражая T7 РНК полимеразы (BHK-T7) и африканской зеленой обезьяны почки MA104 клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: BHK-T7 (или BSR-T7) клетки не коммерчески доступны, но являются общей клеточной линии лабораторий с использованием обратной генетики для изучения биологии РНК вируса. Линия ячейки BHK-T7, используемая в этом протоколе, была получена от доктора Урсулы Бухгольц (Национальные институты здравоохранения, Bethesda, MD, США), соразработчика оригинальной линии клеток BHK, выражающей Полимеразу T7 РНК29. Клетки MA104 доступны в Европейской коллекции аутентифицированных клеточных культур (ECACC) и в Американской коллекции культуры типов (ATCC).
  2. Подготовьте следующие культурные носители в стерильной среде, предпочтительно кабинет биологической безопасности класса II. Храните носители в темноте при 4 градусах Цельсия и нагревайте до 37 градусов по Цельсию непосредственно перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Источники компонентов мультимедиа приведены в таблице материалов.
    1. Для подготовки DMEM неполной среды, объединить 500 мл dulbecco в минимальной существенной среде Eagle (MEM), содержащий 4,5 г / л глюкозы и 1% глутамина с 5 мл 100x перо-стрептококк.
    2. Для подготовки DMEM полной среды, объединить 500 мл DMEM неполной среде с 25 мл сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
    3. Для приготовления гемЭМ неполной среды, объединить 500 мл Глазго минимальной существенной среде, 5 мл 100x глутамина, 50 мл триптоза-фосфатного бульона (TPB), 5 мл 100x несущественных аминокислот (NEAA), и 5 мл 100x пен-стэп.
    4. Для подготовки GMEM полной среде, объединить 500 мл GMEM неполной среде с 25 мл тепло-инактивированных FBS.
    5. Для подготовки гмЭМЗГ полную среду добавьте 10 мл генетики 50 мг/мл (G418) к 500 мл гм. полной среды.
    6. Для подготовки SMEM неполной среды, объединить 500 мл модифицированных Eagle в MEM, 5 мл 100x глутамина, 50 мл TPB, 5 мл 100x NEAA, и 5 мл 100x перо-стрептококка.
  3. Культура MA104 ячеек в T75 или T175 колбы, содержащие 12 или 25 мл DMEM полной среде, соответственно. Для прохождения MA104 клеток, которые достигли 100% сближи, промыть монослой клетки 2x с фосфат-буфером солей (PBS), разъединить с трипсином (0.05%)-EDTA (0.1%) раствор, и повторно в 5 (T75 колба) или 10 мл (T175 колба) DMEM неполной среде.
    1. Поместите 0,5-1,0 мл переитованных ячеек в свежие фляги и доведите до соответствующего конечного объема, добавив Полную среду DMEM. Поместите колбы в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
  4. Распространение клеток BHK-T7 в t75 колбах, чередуясь между использованием GMEM и GMEM-G полной среде с каждым раундом прохождения. Для субкультуры bhK-T7 ячеек, достигшие 100% спущенности, промыть монослой клетки 2x с PBS, разъединить с раствором трипсин-EDTA, и resuspend в 5 мл среды.
    1. После размещения 15 мл GEM или ГМЭМЗГ полной среде в свежей колбе T75, добавьте четыре капли вновь заблокированных ячеек BHK-T7. Поместите колбу в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.

2. Плазмидный препарат

  1. Получить следующие плазмиды, выражающие ротавирус SA11 (яп. ) РНК от Addgene: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11, и pT7/NSP5SA11. Получить плазмид, выражающий ASFV укупорки фермента (pCMV/NP868R) от авторов21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицированные плазмиды pT7/NSP3SA11, разработанные для выражения FP через деятельность переводного элемента 2A (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP), также могут быть получены от авторов24,,26. pT7/NSP3-2A-3xFL-FP плазмиды, выражающие следующие FPs доступны: UnaG (зеленый), mKate (далеко-красный), mRuby (красный), TagBFP (синий), CFP (cyan), и YFP (желтый)24.
  2. Преобразуйте плазмиды в компетентные E. кишечная палочка DH5 " и распространение бактерий на бульон Лурия агар пластин, содержащих соответствующие антибиотики. Выращивайте бактериальные культуры, собранные из отдельных колоний, и подготовьте меньшее количество плазмида (20 мкг) с помощью комплекта очистки мини-подготовки спина(Таблица материалов),в соответствии с инструкциями производителя. Подготовка большего количества плазмиды из бактериальных культур с использованием миди и макси очистки комплекты (Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмиды, пригодные для использования в системе обратной генетики, также были подготовлены с другими наборами плазмидной очистки. Нет необходимости готовить плазмиды с использованием комплектов, специально предназначенных для генерации материала без эндотоксинов.
  3. Отрегулируйте концентрации очищенных плазмидов до 1 мг/мл в воде, свободной от нуклеазы молекулярной биологии. Проверьте чистоту плазмиды, подтвердив коэффициент абсорбции 260/280 в размере 1,8 евро с помощью спектрофотометра. Кроме того, используйте электрофорез на 0,8% гелей агарозы, чтобы убедиться, что плазмиды преимущественно суперкоидные.
  4. Aliquot очищенные плазмиды в стерильные микроцентрифугные трубки 0,5 мл, каждая из которых содержит плазмиды по 10 л.

3. Поколение рекомбинантного вируса

ПРИМЕЧАНИЕ: Исследования ротавируса человека и животных, включая генерацию и характеристику рекомбинантных штаммов ротавирусной системы, должны быть обработаны в условиях уровня биобезопасности 2 (BSL-2) и потребуют предварительного одобрения Институционального комитета по биобезопасности (IBC). Соответствующие лабораторные условия BSL-2 описаны в Биобезопасности в микробиологических и биомедицинских лабораториях (BMBL), производимых Центрами по контролю и профилактике заболеваний (CDC)30.

  1. День 1: посев ячеек BHK-T7 в 12-колодцы пластины
    1. Промыть свежесотый монослой из клеток BHK-T7, содержащихся в колбе T75 2x с PBS. Нарушить монослой клеток с трипсин-EDTA решение и повторной работы клеток в 5 мл ГМЭМ полной среде.
    2. Используйте автоматизированный счетчик ячеек и трипан-синий раствор для определения концентрации жизнеспособных клеток BHK-T7 в среде. Семенные клетки в 12-хорошо клеточной культуры пластин, с каждой хорошо, содержащий 2 х 105 клеток в общей объеме 1 мл ГМЭМ (G418-бесплатно) полной среде. Инкубировать в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, 5% CO2. Клетки должны достигать 80-90% вспуских ко дню 2.
  2. День 2: трансфекция клеток BHK-T7 с плазмидными смесями
    1. Для приготовления плазмидной смеси, объединить следующие в 0,5 мл микроцентрифуговой трубки с использованием запасов плазмида скорректированы до 1 мг/мл: 0,8 л каждый из SA11 pT7 плазмиды VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 и NSP4, 2,4 л каждый из плазмидов SA11 pT7 NSP2 и NSP5, а также 0,8 зл и л pCMV/NP868R. Аккуратно перемешать плазмиды, нажав трубку и собирать содержимое импульс центрифугирования. Для подготовки рекомбинантных вирусов, выражающих FPs, замените pT7/NSP3SA11 соответствующими pT7/NSP3-2A-3xFL-FP плазмид.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмедные смеси должны храниться на льду до использования. Для каждого трансфекции должна быть подготовлена отдельная трубка.
    2. Для подготовки плазмиды / уменьшенной смеси реагента сыворотки/ трансфекционного реагента: Добавьте 110 qL прероразогретой (37 градусов по Цельсию) уменьшенной среде сыворотки(Таблица Материалов)к каждой плазмидной смеси и смешайте, аккуратно пайпетируя вверх и вниз. После этого добавьте 32 злицита реагента(Таблица материалов)к каждой плазмидной/уменьшенной смеси сыворотки; это дает концентрацию 2,5 л трансфекционного реагента на мкг плазмида в смесях. Vortex смеси мягко и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут.
    3. В течение 20 мин инкубационного периода, промыть BHK-T7 клетки в 12-колодцы пластин (подготовлены на день 1) один раз с 2 мл ГМ НЕполных носителей. После этого добавьте 1 мл неполной среды SMEM к каждой скважине и верните пластины в инкубатор.
    4. После 20-минутного инкубационного периода добавьте плазмид/уменьшенную сыворотку среднего/трансфекционного смеси, капли за каплей, к каждой скважине из 12-колодца пластин, используя пипетатор объемом 200 л. Аккуратно рок пластин и вернуться к 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатора.
  3. День 4: наблюдение за трансинфицированными клетками BHK-T7 с ma104 клетками
    1. Промыть свежесводный монослой клеток MA104, содержащихся в колбе T75 2x с PBS. Нарушить монослой с помощью раствора трипсин-EDTA и повторного использования ячеек в 5 мл DMEM полной среде.
    2. Используя автоматизированный счетчик ячеек и трипан-синий раствор, определите концентрацию жизнеспособных клеток MA104 в среде. Отрегулируйте концентрацию до 8 х 105 MA104 ячеек/мл в Неполной среде DMEM и добавьте 0,25 мл взвешенных клеток (2 х 105 ячеек) в скважины, содержащие трансинфицированные клетки BHK-T7.
    3. Отрегулируйте концентрацию трипсина (свиного поджелудочного типа IX) в среднем до 0,5 мкг/мл, добавляя 0,8 л 1 мг/мл трипсина к каждому колодцу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин запасы должны быть подготовлены в PBS, aliquoted, и хранится при -20 градусов по Цельсию.
    4. Используйте оставшиеся клетки MA104 для подготовки 6-колодцев, которые понадобятся на 7-й день для усиления рекомбинантных вирусов. Для семян 6-ну хорошо пластин, разбавить resuspended MA104 клеток до концентрации 1,5 х 105 клеток / мл в DMEM полной среде и место 2 мл в каждой скважине. Поместите тарелки в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
  4. День 7: восстановление и усиление рекомбинантного вируса из трансинфицированных клеток
    1. Обижайте клетки BHK-T7/MA104 в 12-колодцах пластинами до трех циклов замораживания-оттепели в стерильных условиях, перемещая пластины между морозильной камерой -20 градусов и поверхностью комнатной температуры. После переноса лисатов в 1,5 мл труб, центрифуги труб в течение 10 минут при 500 х г (4 кВ) для гранулы большого клеточного мусора. Соберите супернатант и храните при 4 градусах По цельсии (краткосрочный срок) или -20 градусов по Цельсию (долгосрочный).
    2. Вымойте MA104 монослой в 6-колодных пластин (подготовлен на 4 день) 2x с PBS. Поместите 2 мл неполной среды DMEM к каждой скважине, которая содержит 0,5 мкг/мл трипсина. Добавьте 300 зЛ супернатанта, извлеченных из щелочи клеток BHK-T7/MA104, в колодцы и поместите пластины в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
    3. Инкубировать пластины в течение 7 дней или до полного цитопатические эффекты (CPE) наблюдаются. Lyse MA104 клетки в 6-колодчатые пластины на три цикла замораживания оттепели, а затем передать лисаты 1,5 мл микроцентрифуговых труб. Пеллет большой клеточный мусор центрифугированием в течение 10 мин при 500 х г (4 градуса По Цельсию). Перенесите очищенные щелочники клеток в микроцентрифугные трубки 1,5 мл и храните при -20 градусов по Цельсию.

4. Изоляция рекомбинантных вирусов

  1. Активировать вирусы в 100 зЛ очищенных клеточных лисатов, добавляя трипсин до конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубируя при 37 кв. м. Подготовьте 10-кратную серию последовательного разбавления в диапазоне от 10-1 до 10-7 (1 мл каждый) в неполной среде DMEM.
  2. Промыть монослой MA104 в 6-колодцы 2x с 2 мл PBS и один раз с DMEM неполной среде. Добавьте 400 мл разбавления лизатов в дубликате к пластинам. Инкубировать пластины в течение 1 ч в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатор, раскачивая каждые 10-15 минут, чтобы перераспределить разбавления через монослой.
  3. Подготовьте агароз-MEM накладной раствор, объединив равные объемы минимальной существенной среды 2x Eagle (EMEM; предварительно разогретой до 37 градусов по Цельсию) с 1,5% агарозом, который был расплавлен в воде с помощью микроволновой печи и предварительно охлажденный до 45 градусов по Цельсию. Поддерживайте накладываемый раствор при 42 градусах Цельсия с помощью водяной ванны и приспособитесь к конечной концентрации 0,5 мкг/мл трипсина непосредственно перед размещением на клетках.
  4. Нарисуйте лисатные разбавления из 6-колодцев, затем промыть клетки один раз с 2 мл неполного DMEM. Аккуратно наложить 3 мл раствора наложения агарозы-MEM на монослой клетки, содержащийся в каждой скважине. Разрешить агарозной накладки затвердеть при комнатной температуре, а затем вернуть пластины в инкубатор.
  5. Три дня спустя, подготовить агароз-MEM наложения решение, как в шаге 4.3 и довести до 42 градусов по Цельсию. Непосредственно перед использованием отрегулируйте накладной раствор до конечной концентрации 50 мкг/мл нейтрального красного цвета(Таблица материалов).
  6. Добавьте 2 мл накладного раствора поверх существующего слоя агарозы в 6-колодковых пластинах. После того, как новый слой агарозы затвердеет, верните пластины в инкубатор. Защитите растворы и пластины, содержащие нейтральный красный цвет, от воздействия света.
  7. В течение следующих 6 ч, определить ротавирусные бляшки в 6-колодц пластин с помощью световой коробки. Выберите четко определенные бляшки с помощью одноразовых передачpipets, восстановление агарозных вилок, которые полностью распространяются на клеточный слой.
  8. Изгнать вилку в трубку 1,5 мл, содержащую 0,5 мл DMEM неполной среды и вихря образца для 30 s. Усиль бляшковый изолированный вирус eluted в среду путем распространения на MA104 монослой в 6-ну хорошо пластин или T25 колбы, содержащие DMEM неполной среде и 0,5 мкг /мл трипсин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная информация об изоляции и тизеринг ротавируса по налету асссировка доступна в Арнольд и др.31.

5. Гель электрофорез вирусной dsRNA

  1. Поместите 600 л очищенных инфицированных клеточных лисатов и 400 л гуанидина тиоцианата в микроцентрифуговых трубках 1,5 мл, вихрь на 30 с и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить 200 л хлороформ, вихрь на 30 с, и инкубировать в течение 3 мин. После центрифуга в течение 5 мин при 13 000 х г (4 градуса по Цельсию) перенесите 550 евро на верхнюю ваквокную фазу в свежие трубки.
  2. Восстановление вирусной dsRNA из ваквозной фазы, добавив 2 тома (900 евро) холодного изопропилового спирта и инвертирующих труб 4-6x. После инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин, центрифуги трубки в течение 10 мин при 13000 х г (4 градуса по Цельсию). Откажитесь от супернационов и сохраняйте РНК-гранулы.
  3. Вымойте гранулы, добавив 1 мл 75% этанола в трубку, инвертируя один раз, и центрифугирование в течение 5 мин при 7500 х г (4 кв. C). После тщательного удаления этанола мыть с пипеткой, позволяют РНК гранулы воздуха сухой на лабораторной скамейке в течение 5-10 мин. Растворите РНК гранулы в 15 злител без нуклеазы молекулярной биологии класса воды и хранить при -20 градусов по Цельсию.
  4. Объедините 10 ЗЛ распущенных образцов РНК с 2 зл 6-кратным буфером загрузки ДНК, загрузите на предварительно готовые 10% мини-гели полиакриламидов (или эквиваленты ручной литой) и разрешите РНК с помощью электрофорексиса в трехглицине, работая буфером на 2 ч под постоянным током (16 мА). Замочите гели в течение 5–10 минут в воде, содержащей бромид в 1 мкг/мл, и обнаруживайте сегменты ротавирусного генома с помощью УФ-трансиллюматора.

6. Восстановление и секвенирование вирусной dsRNA

  1. Найдите вирусные dsRNA полосы на полякриламид гели предпочтительно с использованием низкой интенсивности длинной длины волны УФ-излучение, чтобы избежать генерации нуклеадокислотных перекрестных связей. Используя свежее лезвие бритвы, вырезать гелевой фрагменты, содержащие dsRNA полос и передачи в 1,5 мл микроцентрифуговых труб.
  2. После добавления 10-20 л воды без RNase, раздавить каждый фрагмент с RNase-бесплатный одноразовый пестик гранулы предназначены для приспособления 1,5 мл микроцентрифуги трубки или путем составления вверх и вниз через 18 G иглы. Инкубировать измельченные фрагменты ночью при 4 градусах Цельсия.
  3. Восстановить 3 зл и жидкости из труб, содержащих фрагменты измельченного геля. Создание cDNAs вирусных dsRNAs с помощью одного шага обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-PCR) комплект (Таблица материалов) и соответствующие праймеры олигонуклеотидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продукты ПЦР гель-очищены с комплектом очистки ПЦР(Таблица материалов)и разосланы для ночного секвенирования, наряду с грунтовками, коммерческими службами последовательности ДНК.

7. Иммуноблотный анализ вирусных белков

  1. Семена 6-колодцы с 3 х 105 MA104 клеток на скважину в общем объеме 2 мл DMEM полной среде. Поместите пластины в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 и оставьте до тех пор, пока клетки не достигнут сплава (3–5 дней).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скважины с сольствуя монослойными будут содержать 1,2 х 106-клеток.
  2. Лечить уточнил супернатанты путем инкубации с 10 мкг /мл трипсина при 37 КК в течение 1 ч, чтобы активировать рекомбинантные ротавирусные частицы, содержащиеся в них.
  3. Промыть монослой MA104 в 6-колодных пластин 2x с 2 мл PBS. Заразить клетки, добавив, к каждой скважине, 200 qL инокулума, содержащего 3'5 бляшки-образующих единиц (PFU) на клетку трипсина активированного ротавируса в DMEM неполной среде. Вернуть тарелки в инкубатор.
  4. Каждые 10 минут, удалить пластины и осторожно рок для перераспределения инокулум через монослой клетки. После 1 ч замените инокулум 2 мл неполной среды DMEM.
  5. На 8 ч после инфекции, промыть клетки в 6-колодцпластины 2x с PBS. Очистите клетки в 750 Л PBS и перенесите объем в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл. Промыть пластину еще 750 л PBS и объединить с предыдущим собранным образцом 750 л.
  6. Клетки пеллет в образце центрифуги при 5000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. После отбрасывания супернатанта, храните пеллеты для клеток при -80 градусов до дальнейшей обработки.
  7. Приготовьте клеточный лисисовый буфер, содержащий 300 мМ NaCl, 100 мм Tris-HCl, рН 7.4, 2% Triton X-100, и 1x EDTA-бесплатный полный ингибитор протеазы. После добавления 300 л люсис буфера замороженных клеточных гранул, кратко вихревые образцы и инкубировать на льду в течение 10 минут.
  8. Повторите процесс вихря и инкубации образцов на льду 3x. После этого, образцы центрифуги при 15000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия, затем собирать супернацианты и хранить при -80 градусов по Цельсию.
  9. Разрешите белки, содержащиеся в 20 мэдалях супернатанта с помощью электрофорасиса на прекастых линейных мини-гелях полиакриламида 8-16% полиакриламида и переносе в мембраны нитроцеллюлозы. Блок мембраны путем инкубации с PBS-Tween 20 (0.02%) раствор, содержащий 5% обезжиренного сухого молока.
  10. Зонд мембраны путем инкубации с одним или более первичных антител (например, морских свинок анти-NSP3 или антисера анти-VP6, мышь моноклональных анти-Флаг M2 антитела, или кролика моноклонального анти-PCNA антитела). Обнаружить первичные антитела путем инкубации мембран с лошадью анти-мышь IgG, анти-морской свинки IgG, или коза анти-кролик IgG хрен дикарь peroxidase-конъюгированных вторичных антител, а затем расширение хемилюминесценции (ECL) хрен chemiluminescence субстрата. Визуализируйте сигналы люминесценции с помощью системы визуализации геля(Таблица материалов)или рентгеновской пленки.

8. Визуализация живых клеток клеток, инфицированных fp-выражающими вирусы

  1. Семена 6-колодцы пластин ы с 3 х 105 MA104 клеток на скважину в общей сложности 2 мл DMEM полной среде. Поместите пластины в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 и оставьте до тех пор, пока клетки не достигнут сплава (3–5 дней).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скважины с сольствуя монослойными будут содержать 1,2 х 106-клеток.
  2. Активировать ротавирусные образцы, известного титра, путем инкубации с 10 мкг/мл трипсина при 37 градусах По кв. м на 1 ч.
  3. Промыть 6-колодцы пластинс с MA104 монослой 2x с 2 мл PBS. Заразить клетки, добавив к каждой скважине 200 qL инокулума, содержащего 3'5 PFU на клетку ротавируса, активированного трипсина, в неполной среде DMEM. Вернуть пластины в инкубатор и мягко рок пластин для перераспределения инокулум через монослой клетки каждые 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уэллы, которые издеваются инфицированных вирусом без DMEM инокулум должны быть включены в качестве контроля.
  4. После 1 ч вирусной адсорбции, промыть монослой 2x с PBS и заменить среду с 0,5 мл на скважину DMEM неполной среде. На 7,5 ч после инфекции, заменить культуры среды с DMEM с низким фоном флуоресценции (Таблица материалов). На 8 ч после инфекции, использовать живой образ клетки для изучения клеток в 20x увеличение для зеленого, красного или синего сигнала флуоресценции.

Результаты

Обратный протокол генетики, описанный в этой статье, проходит через несколько различных шагов: (1) совместное трансфекцию клеток BHK-T7 с ротавирусными векторами транскрипции pT7 и пласмидом выражения pCMV/NP868R, (2) наблюдение за трансинфицированными клетками BHK-T7 с клетками MA104, (3) усиление реко...

Обсуждение

В нашей лаборатории мы обычно полагаемся на описанный здесь протокол обратной генетики для производства рекомбинантных ротавирусов SA11. При таком подходе люди с небольшим опытом работы в методах молекулярной биологии или работающие с ротавирусами восстанавливают рекомбинантные виру...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH гранты R03 AI131072 и R21 AI144881, Индиана университета Start-Up Финансирования, и Лоуренс М. Блатт фонда. Мы благодарим членов лаборатории IU Rotahoosier, Ульриха Дессельбергера и Гвидо Папа за их многочисленный вклад и предложения в разработке обратного протокола генетики.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) CellsContact: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-GelBio-Rad45608105
Cellometer AutoT4 viable cell counterNexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging SystemBio-Rad
ChloroformMP194002
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) SubstrateBio-Rad170-5060
Competent E.coli DH5alpha BacteriaLucigen60602-2
Complete Protease InhibitorPierceA32965
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended TipsMTC BioP4113-11
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Lonza12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM)Quality Biological115-073-101
Ethanol, Absolute (200 proof)Fisher BioreagentsBP2818-500
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml)Invitrogen15585-011
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat InactivatedCorning35-011-CV
Flag M2 Antibody, Mouse MonoclonalSigma-AldrichF1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep KitSigmaNA0200-1KT
Geneticin (G-418)Invitrogen10131-027
Gibco FluroBrite DMEMThermoFisherA1896701DMEM with low background fluorescence
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM)Gibco11710-035
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) ConjugatedCell-Signaling Technology7074S
Guinea Pig Anti-NSP3 AntiserumPatton lablot 55068
Guinea Pig Anti-VP6 AntierumPatton lablot 53963
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) ConjugatedKPL5220-0366
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) ConjugatedCell-Signaling Technology7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection KitJH Science25235
Isopropyl alcoholMacron3032-02
L-glutamine Solution (100x)Gibco25030-081
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar)RPI research productsL24020-2000.0
Medium 199 (M199) Culture MediumHycloneSh30253.01
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM)Lonza04-719Q
Monkey Kidney (MA104) CellsATCCATCC CRL-2378.1
NanoDrop One SpectrophotometerThermoScientific
Neutral Red Solution (0.33%)Sigma-AldrichN2889-100ml
Non-Essential Amino Acid Solution (100x)Gibco11140-050
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-GelInvitrogenXP00102BOX
Nuclease-Free Molecular Biology Grade WaterInvitrogen10977-015
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up KitTakara740609.25
Opti-MEM Reduced Serum MediumGibco31985-070
Pellet pestle (RNase-free, disposable)Fisher12-141-368
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep)Corning30-002-Cl
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10xFisher BioreagentsBP399-20
Porcine Trypsin, Type IX-SSigma-AldrichT0303
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1223
Qiagen Plasmid Maxi KitQiagen12162
Qiagen Plasmid Midi KitQiagen12143
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
SA11 pT7 Transcription VectorsAddgene89162-89172
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent ProteinsContact: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE AgaroseLonza50000For gel electrophoresis
SeaPlaque agaroseLonza50100For plaque assay
Superscript III One-Step RT-PCR kitInvitrogen12574-035
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer KitBio-Rad170-4270
Trans-Llot Turbo Transfer SystemBio-Rad
TransIT-LTI Transfection ReagentMirusMIR2306
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x)Bio-Rad161-0772
Triton X 100Fisher BioreagentsBP151-500
Trizol RNA Extraction ReagentAmbion15596026
Trypan blueCorning25-900-CI
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation SolutionQuality Biological118-087-721
Tryptose Phosphate BrothGibco18050-039
Tween-20VWR0777-1L
Vertrel VF solventZoroG0707178
Zoe Fluorescent Live Cell ImagerBio-Rad

Ссылки

  1. Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
  2. Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
  3. . Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019)
  4. Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).
  5. Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
  6. Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
  7. McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
  8. Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
  9. Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
  10. Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
  11. Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
  12. Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
  13. Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
  14. Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
  15. Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
  16. Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
  17. Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
  18. Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
  19. Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
  20. Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
  21. Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
  22. Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
  23. Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
  24. Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
  25. Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
  26. Donnelly, M. L., et al. The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
  27. Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
  28. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
  29. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
  30. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).
  31. Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
  32. Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

158

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены