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Résumé

La détermination précise des emplacements liant les protéines dans l’ensemble du génome est importante pour comprendre la régulation des gènes. Ici nous décrivons une méthode génomique de cartographie qui traite l’ADN chromatin-immunoprécipité avec la digestion d’exonuclease (ChIP-exo) suivie du séquençage à haut débit. Cette méthode détecte les interactions protéine-ADN avec une résolution cartographique proche de la paire de base et un rapport signal-bruit élevé chez les neurones mammifères.

Résumé

L’identification d’interactions protéine-ADN spécifiques sur le génome est importante pour comprendre la régulation des gènes. L’immunoprécipitation de la chromatine couplée au séquençage à haut débit (ChIP-seq) est largement utilisée pour identifier les emplacements de liaison à l’échelle du génome des protéines liant l’ADN. Cependant, la méthode ChIP-seq est limitée par son hétérogénéité dans la longueur des fragments d’ADN sonicated et de l’ADN de fond non spécifique, ayant pour résultat la résolution de cartographie basse et l’incertitude dans les emplacements ADN-liants. Pour surmonter ces limitations, la combinaison du ChIP avec la digestion d’exonucléase (ChIP-exo) utilise la digestion d’exonuclease de 5' à 3' pour couper l’ADN immunoprécipité de taille hétérogène au site de liaison croisée protéine-ADN. Le traitement d’exonucléase élimine également l’ADN non spécifique de fond. L’ADN préparé par la bibliothèque et digéré par l’exonucléase peut être envoyé pour le séquençage à haut débit. La méthode ChIP-exo permet une résolution cartographique proche de la paire de base avec une plus grande sensibilité de détection et un signal d’arrière-plan réduit. Un protocole ChIP-exo optimisé pour les cellules mammifères et le séquençage de prochaine génération sont décrits ci-dessous.

Introduction

Les emplacements des interactions protéine-ADN donnent un aperçu des mécanismes de régulation des gènes. L’immunoprécipitation de la chromatine couplée au séquençage à haut débit (ChIP-seq) est utilisée depuis une décennie pour examiner les interactions protéine-ADN à l’échelle du génome dans les cellulesvivantes 1,2. Cependant, la méthode ChIP-seq est limitée par l’hétérogénéité dans la fragmentation de l’ADN et la contamination non lié de l’ADN qui conduisent à une faible résolution cartographique, de faux positifs, des appels manqués et un signal d’arrière-plan non spécifique. La combinaison du ChIP avec la digestion d’exonuclease (ChIP-exo) améliore la méthode de ChIP-seq en coupant l’ADN de ChIP aux points de croisement de protéine-ADN, fournissant la résolution proche de base-paire et un signal bas de fond3,4,5. La résolution cartographique grandement améliorée et le faible fond fourni par ChIP-exo permettent de déterminer des emplacements précis et complets de liaison protéine-ADN dans l’ensemble du génome. ChIP-exo est capable de révéler des motifs fonctionnellement distincts liant l’ADN, des interactions coopératives entre les facteurs de transcription (TF), et de multiples sites de liaison protéine-ADN dans un certain endroit de liaison génomique, non détectable par d’autres méthodes de cartographiegénomique 3,4,6,7.

ChIP-exo a d’abord été utilisé dans la levure naissante pour examiner la liaison spécifique à l’ADN des TF, pour étudier l’organisation précise du complexe de transcription pré-initiation, et la structure sous-nucléosomale des histones individuelles à traversle génome 4,8,9. Depuis son introduction en 20114, ChIP-exo a été utilisé avec succès dans de nombreux autres organismes, y compris les bactéries, les souris etles cellules humaines 7,10,11,12,13,14,15,16,17. En 2016, Rhee et coll.14 ont utilisé chIP-exo dans les neurones mammifères pour la première fois pour comprendre comment l’expression neuronale des gènes a été maintenue après la downregulation de la programmation TF Lhx3, qui forme un complexe d’heterodimer avec une autre programmation TF Isl1. Cette étude a montré qu’en l’absence de Lhx3, Isl1 est recruté à de nouveaux exhausteurs neuronaux liés par Onecut1 TF pour maintenir l’expression génétique des gènes effecteurs neuronaux. Dans cette étude, ChIP-exo a révélé comment plusieurs TF reconnaissent dynamiquement le type cellulaire et les éléments de régulation de l’ADN spécifiques au stade cellulaire d’une manière combinatoire à la résolution de cartographie quasi nucléotide. D’autres études ont également utilisé la méthode ChIP-exo pour comprendre l’interaction entre les protéines et l’ADN dans d’autres lignées cellulaires de mammifères. Han et coll.7 ont utilisé ChIP-exo pour examiner l’organisation à l’échelle du génome des TF GATA1 et TAL1 dans les cellules érythroïdes de souris à l’aide de ChIP-exo. Cette étude a révélé que TAL1 est directement recruté à l’ADN plutôt qu’indirectement par des interactions protéine-protéine avec GATA1 tout au long de la différenciation érythroïde. Des études récentes ont également utilisé ChIP-exo pour profiler les emplacements de liaison à l’échelle du génome de CTCF, RNA Polymerase II, et les marques d’histone pour étudier les mécanismes épigénomiques et transcriptionnels dans les lignéescellulaires humaines 18,19.

Il existe plusieurs versions du protocole ChIP-exo disponibles3,5,20. Cependant, ces protocoles ChIP-exo sont difficiles à suivre pour les recherches qui ne sont pas familiers avec la préparation de la bibliothèque de séquençage de prochaine génération. Une excellente version du protocole ChIP-exo a été publiée avec des instructions faciles à suivre et une vidéo21, mais contenait de nombreuses étapes enzymatiques qui nécessitent beaucoup de temps pour terminer. Ici, nous rapportons une nouvelle version du protocole ChIP-exo contenant des étapes enzymatiques réduites et les temps d’incubation, et des explications pour chaque étape enzymatique21. Les réactions de réparation d’extrémité et de dA-tailing sont combinées en une seule étape utilisant l’enzyme de préparation d’extrémité. Les temps d’incubation des étapes de ligature de l’index et de l’adaptateur universel sont réduits de 2 h à 15 min à l’aide d’un exhausteur de ligature. La réaction de kinase après l’étape de ligature d’adaptateur d’index décrite dans le protocole précédent de ChIP-exo est enlevée. Au lieu de cela, un groupe de phosphate est ajouté lors de la synthèse de l’ADN oligo à l’une des extrémités de 5' de l’adaptateur de l’index (tableau 1), qui sera utilisé pour l’étape de digestion de l’exonucléase lambda. Alors que le protocole chip-exo précédent utilisait la digestion de l’exonucléase RecJf pour éliminer les contaminants de l’ADN échoués, cette étape de digestion est enlevée ici parce qu’elle n’est pas critique pour la qualité de la bibliothèque ChIP-exo. En outre, pour purifier l’ADN inversé-croisé après elution de ChIP, une méthode magnétique de purification de perles est employée au lieu du phénol : chloroforme : méthode d’extraction d’alcool d’isoamyl (PCIA). Cela réduit le temps d’incubation de l’extraction de l’ADN. Fait important, il supprime la majorité des dimers adaptateurs formés lors de la ligature de l’adaptateur d’index, ce qui peut avoir un impact sur l’efficacité de la ligature médiée PCR.

Le protocole ChIP-exo présenté ici est optimisé pour la détection d’interactions protéines-ADN précises chez les neurones mammifères différenciés des cellules souches embryonnaires de souris (ES). En bref, les cellules neuronales récoltées et reliées entre elles sont lysées, afin de permettre à la chromatine d’être exposée à la sonication, puis sonnée de sorte que des fragments d’ADN de taille appropriée soient obtenus (figure 1). Les perles enduites d’anticorps sont ensuite utilisées pour immunoprécipifier sélectivement la chromatine fragmentée et soluble à la protéine d’intérêt. Tandis que l’ADN immunoprécipité est toujours sur les perles, la réparation finale, la ligature des adaptateurs de séquençage, la réaction de remplissage et les étapes de digestion d’exonuclease de lambda de 5' à 3' sont exécutées. L’étape de digestion de l’exonucléase est ce qui donne à ChIP-exo sa très haute résolution et son rapport signal-bruit élevé. Lambda exonuclease coupe l’ADN immunoprécipité quelques paires de base (bp) du site de liaison croisée, causant ainsi la contamination de l’ADN à dégrader. L’ADN chip traité à l’exonucléase est éludé des perles enduites d’anticorps, les liens croisés protéine-ADN sont inversés et les protéines sont dégradées. L’ADN est extrait et dénaturé à l’ADN de ChIP simple brin, suivi de l’annealing d’amorce et de l’extension pour faire l’ADN double-échoué (DsDNA). Ensuite, la ligature d’un adaptateur universel aux extrémités traitées par l’exonucléase est effectuée. L’ADN qui en résulte est purifié, puis amplifié par PCR, purifié en gel et soumis au séquençage de la prochaine génération.

Le protocole ChIP-exo est plus long que le protocole ChIP-seq, mais n’est pas très techniquement difficile. N’importe quel ADN immunoprécipité avec succès de ChIP peut être soumis au ChIP-exo, avec plusieurs étapes enzymatiques additionnables. Les avantages notables du ChIP-exo, tels que la résolution de cartographie ultra-élevée, un signal de fond réduit, et la diminution des faux positifs et négatifs, en ce qui concerne les sites de liaison génomique, l’emportent sur le coût du temps.

Protocole

REMARQUE : L’eau distillée et déionisée autoclavée (ddH2O) est recommandée pour la fabrication de tampons et de mélanges maîtres de réaction. Les sections 1−4 décrivent la lyse et la sonication cellulaires, les sections 5−7 décrivent l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), les sections 8−11 décrivent les réactions enzymatiques sur les perles, les sections 12 et 13 décrivent l’élitution du ChIP et la purification de l’ADN, et les sections 14−19 décrivent la préparation de la bibliothèque.

1. Cellules de récolte et de liaison croisée

  1. Après avoir différeté les cellules ES de souris en neurones postmitotic, ajoutez 11% de formaldéhyde aux cellules récoltées à une concentration finale de 1% (v/v). Cellules rocheuses sur une plate-forme berçante (rocker, shaker ou rotateur) pendant 15 min, à température ambiante (RT, 25 °C).
    REMARQUE : Selon la protéine cible à croiser, moins de liaisons entre formaldéhyde (par exemple, une concentration finale de 0,5 %) ou double liaison croisée avec le glutarate de disuccinimidyl (DSG) peut être utilisé.
  2. Ajouter 2,5 M de glycine à une concentration finale de 150 mM pour arrêter la réaction de liaison croisée. Cellules rocheuses sur une plate-forme de basculement à RT, pendant 5 min.
  3. Centrifugeuse les cellules reliées en deux dans des tubes coniques de 15 mL à RT, pendant 6 min, à 1 350 x g. Aspirez la solution, puis résuspendez les cellules dans 5 mL de saline 1x tamponné phosphate (PBS).
    REMARQUE : Les granulés cellulaires reliés entre eux peuvent être stockés à -80 °C après congélation éclair avec de l’azote liquide.

2. Lyse cellulaire

REMARQUE : Les étapes suivantes de ce protocole sont pour environ 2 x 10 cellules neuronalesde 7 différenciées des cellules ES de souris. Pour briser les cellules ouvertes, des tampons de lyse contenant divers détergents seront utilisés. Ajouter 50 μL de stock complet d’inhibiteur de la protéase (IPC) de 1000 x à 50 mL de tampon juste avant l’utilisation.

  1. Préparez des tampons de lyse 1−3 tels que décrits dans le tableau 2.
  2. Décongeler les granulés cellulaires reliés entre les deux cellules sur la glace, puis résuspendre soigneusement les granulés cellulaires dans 3 mL de tampon de lyse 1 dans des tubes coniques de 15 mL. Rock à 4 °C pendant 15 min sur une plate-forme de basculement. Centrifugeuse à 1 350 x g pendant 5 min à 4 °C et aspirer supernatant.
  3. Resuspendez soigneusement les cellules granulées dans 3 mL de tampon de lyse 2. Rock à 4 °C pendant 10 min sur une plate-forme de basculement. Centrifugeuse à 1 350 x g pendant 5 min à 4 °C et aspirer supernatant.
  4. Ajouter 1 mL de tampon de lyse 3 à chaque granulé, puis garder sur la glace. Passez immédiatement à la sonication.

3. Chromatine sonore

REMARQUE : Gardez les échantillons sur la glace ou à 4 °C pendant cette procédure de sonication afin de réduire l’inversion des liens croisés.

  1. À l’aide d’une spatule stérile, ajouter des perles de sonication(Tableau des matériaux)jusqu’à la marque de graduation de 0,2 mL sur des tubes en polystyrène de 15 mL. Laver les perles de sonication en vortexant dans 600 μL de 1x PBS jusqu’à ce qu’aucune taches sèche ne soit visible. Centrifuger les tubes pendant 5 s à 30 x g et aspirer 1x PBS.
    REMARQUE : La sonication dans les tubes de polystyrène est plus efficace que la sonication dans les tubes de polypropylène. Si un plus petit nombre de cellules (par exemple, <106 cellules) est sonique, utilisez des tubes de polystyrène de 1,5 mL sans ajouter de perles de sonication.
  2. Resuspendez soigneusement les lysates nucléaires dans 1 mL de tampon de lyse 3 (à partir de l’étape 2.4), puis transférez-les vers les tubes de polystyrène de 15 mL contenant des perles de sonication. Vortex brièvement les tubes de polystyrène.
  3. Pour fragmenter l’ADN de chromatine relié entre les deux, soniquer les lysates nucléaires à 4 °C pour un nombre optimisé de cycles, avec une amplitude de puissance à 30 W, et des cycles de sonication réglés à 30 s sur/30 s éteints.
    REMARQUE : L’optimisation de la sonication pour chaque type de cellule et chaque lot donnera le meilleur rendement chip-exo. Pour 2 x 107 cellules neuronales de souris, 20−30 cycles de sonication aux arrangements mentionnés fragmentent la chromatine dans la gamme de 100−500 bp.
  4. Une fois la sonication terminée, transférez tous les supernatants (lysates soniques), de chaque échantillon, à des tubes de 1,5 mL. Ajouter 10 % 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol) à chaque échantillon à une concentration finale de 1 %. Mélanger au pipetage.
  5. Pour pelleter les débris cellulaires, les échantillons de centrifugeuses à 13 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférer tous les lysates soniques (supernatants) de chaque échantillon vers de nouveaux tubes de 1,5 mL.
  6. Prenez 30 μL de lysate sonique de chaque échantillon (~3% de lysate sonique) et ajoutez à de nouveaux tubes de 1,5 mL pour vérifier la sonication. Conserver les lysates soniques restants à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être incubation avec des perles recouvertes d’anticorps.

4. Vérification de la sonication

  1. Faire 20 mL de tampon 2x proteinase K en ajoutant 2 mL de 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 2 mL de 0,5 M EDTA, 10 mL de sulfate de dodecyl de sodium (SDS) et 6 mL de ddHautoclavé 2O. N’ajoutez pas l’IPC à ce tampon. Conserver dans un tube de 50 mL à RT.
  2. Pour inverser le lien protéine-ADN, en enlevant les protéines, prenez les 30 μL de chromatine sonique de chaque échantillon (à partir de l’étape 3.6), ajoutez 166 μL de ddH2O autoclavé, 200 μL de tampon 2x proteinase K et 4 μL de 20 mg/mL proteinase K. Vortex brièvement les échantillons, puis incuber à 65 °C pour 1−3 h à 24 x g.
  3. REMARQUE : Les lysates soniques peuvent être reliés en sens inverse à 65 °C pendant la nuit.
  4. Extraire l’ADN à l’aide de pcia (25:24:1) et la méthode de précipitation de l’éthanol comme suit.
    ATTENTION: PCIA est toxique. Utiliser sous un capot de fumée avec l’équipement de protection individuelle standard (PPE).
    1. Ajouter 400 μL de PCIA à chaque échantillon dans des tubes de 1,5 mL, régler le vortex à la vitesse maximale et les échantillons de vortex pendant 20 s. Centrifugeuse à 18 400 x g pendant 6 min à RT. Deux phases seront observées. Transférer délicatement la couche aqueuse supérieure (phase claire) de chaque échantillon vers de nouveaux tubes de 1,5 mL.
    2. Ajouter 1 μL de 10 mg/mL d’échantillons de RNase A. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
    3. Ajouter 1 μL de glycogène de 20 mg/mL à chaque échantillon, puis précipiter avec 1 mL d’éthanol glacé à 100 % (conservé dans un congélateur de -20 °C). Mélanger brièvement, puis incuber les échantillons dans un congélateur à -80 °C pendant 30 min à 1 h. Centrifugeuses à 18 400 x g pendant 10 min à 4 °C et versez soigneusement 100 % d’éthanol.
    4. Laver les granulés avec 500 μL d’éthanol glacé à 70 % (conservé dans un congélateur de -20 °C). Centrifugeuse à 18 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Verser délicatement 70 % d’éthanol.
    5. Incuber des échantillons dans des tubes de 1,5 mL à 50 °C jusqu’à ce que le reste de l’éthanol soit évaporé. Resuspendez les granulés d’ADN dans 15 μL de ddH2O autoclavé ou de ddH2O sans nucléase.
    6. Exécutez les échantillons d’ADN extraits, ainsi qu’une échelle d’ADN, dans un gel d’agarose de 1,5 % à 120−180 V et vérifiez la taille de l’ADN sonore.

5. Incubation d’anticorps avec perles

REMARQUE : Les étapes suivantes de ce protocole sont pour environ 2 x 10 cellules neuronalesde 7 différenciées des cellules ES de souris. Ne pas congeler et décongeler les perles magnétiques à tout moment au cours du protocole ChIP-exo, car les perles peuvent se fissurer, ce qui peut causer une contamination de l’échantillon ou compromettre les performances de l’anticorps.

  1. Après la lyse cellulaire et la sonication, préparer les perles magnétiques protéiques G(tableau des matériaux)pour le ChIP, mélanger les perles magnétiques jusqu’à homogénéité, puis ajouter 25 μL de perles magnétiques à 2 mL de protéines à faible lier les tubes.
    REMARQUE : Le type de perles magnétiques utilisées dépendra de l’espèce des anticorps.
  2. Laver les perles avec 1 mL de solution de blocage (Tableau 2), bien mélanger, puis placer sur une grille magnétique pendant 1 min. Pendant qu’il est encore sur un support magnétique, retirer le surnatant une fois qu’il est clair.
  3. Ajouter 1 mL de solution de blocage aux perles magnétiques. Tubes de roche pendant 10 min à 4 °C sur une plate-forme de basculement. Tournez brièvement, puis placez les tubes sur une grille magnétique et retirez le surnatant.
  4. Répétez l’étape 5.3 deux fois de plus.
  5. Ajouter 500 μL de solution de blocage aux perles magnétiques. Tournez brièvement l’anticorps contre Isl1 (0,04 μg/μL, Tableau des matériaux),puis ajoutez 4 μg d’anticorps aux tubes de liaison bas de protéine de 2 mL correspondants contenant les perles magnétiques dans la solution de blocage.
  6. Répétez l’étape 5.5 sans anticorps (c.-à-d. le contrôle sans anticorps pour chip).
    REMARQUE : La quantité d’anticorps à ajouter peut être déterminée empiriquement en tenant compte de la qualité de l’anticorps et du nombre de cellules utilisées pour le ChIP.
  7. Échantillons de roche à 4 °C pendant 6−24 h sur une plate-forme de basculement.

6. Immunoprécipitation de chromatine (ChIP)

  1. Laver les perles enduites d’anticorps de l’étape 5.8 avec 1 mL de solution de blocage. Placer les échantillons sur une plate-forme de basculement à 4 °C pendant 5 min. Retirer le surnatant.
  2. Répétez l’étape 6.1 deux fois de plus.
  3. Resuspendez les perles enduites d’anticorps dans 50 μL de solution de blocage, puis transférez-les vers de nouveaux tubes à faible liaison protéinés de 2 mL. Pour chaque échantillon de ChIP, ajouter les lysates soniques (~1,0 mL de l’étape 3.6) aux perles recouvertes d’anticorps dans des tubes à faible liaison protéinés de 2 mL.
  4. Incuber chaque échantillon sur une plate-forme de basculement pendant la nuit à 4 °C.

7. Le ChIP se lave

REMARQUE : Gardez les échantillons sur la glace ou à 4 °C pour maintenir la liaison protéine-ADN pendant les lavages au ChIP.

  1. Faire tampon de lavage à haute teneur en sel, tampon de lavage LiCl et tampon Tris-HCl de 10 mM (pH 7.4) tel que décrit dans le tableau 3. Conserver dans des tubes de 50 mL à 4 °C. Ajouter 50 μL de stock iPC 1000x à tous les tampons juste avant l’utilisation.
  2. Faites tourner brièvement des échantillons dans des tubes à faible liaison protéique de 2 mL pour recueillir le liquide des bouchons, puis placez-les sur un support magnétique pendant 1 min et retirez soigneusement le supernatant à l’aide d’une pipette.
  3. Pour les lavages ChIP, ajouter 1 mL de tampon de lyse 3 (à 4 °C) à chaque tube. Mélanger sur une plate-forme à bascule à 4 °C pendant 5 min. Faites tourner brièvement les échantillons, puis placez-les sur une grille magnétique pendant 1 min et retirez le supernatant à l’intérieur d’une pipette.
  4. Ajouter 1 mL de tampon froid de lavage au sel à chaque tube. Mélanger sur une plate-forme à bascule à 4 °C pendant 5 min. Faites tourner brièvement les échantillons, puis placez-les sur une grille magnétique pendant 1 min et retirez le supernatant à l’intérieur d’une pipette.
  5. Ajouter 1 mL de tampon de lavage LiCl froid à chaque tube. Mélanger sur une plate-forme à bascule à 4 °C pendant 5 min. Faites tourner brièvement les échantillons, puis placez-les sur une grille magnétique pendant 1 min et retirez le supernatant à l’intérieur d’une pipette.
  6. Ajouter 1 mL de tampon tris-hcl froid de 10 mM (pH 7,4) à chaque tube. Mélanger sur une plate-forme à bascule à 4 °C pendant 5 min. Faites tourner brièvement les échantillons, puis placez-les sur une grille magnétique pendant 1 min et retirez le supernatant à l’intérieur d’une pipette.
    REMARQUE : Le tampon Tris-EDTA (pH 8.0) peut être utilisé au lieu du tampon Tris-HCl (pH 7.4).
  7. Répétez les étapes 7.4−7.6 trois fois.
  8. Transférer les perles de l’échantillon avec 500 μL de tampon Tris-HCl (pH 7,4) dans des tubes frais de 1,5 mL. Faites tourner brièvement les échantillons, puis placez-les sur une grille magnétique pendant 1 min et retirez le supernatant à l’intérieur d’une pipette.

8. Fin de la réparation et de la réaction de queue dA sur les perles

REMARQUE : La sonication génère souvent des dsDNA finaux non contondants. Une réaction de réparation finale est nécessaire pour faire de l’ADN émoussé avant la réaction de queue dA suivie de l’étape de ligature de l’adaptateur d’index. Pour la ligature collante d’ADN d’extrémité avec l’ADN d’adaptateur d’index, dATP est ajouté à l’extrémité 3' d’un fragment émoussé et dsDNA par la réaction de dA-tailing. Le mélange de réaction de préparation de fin contient dATP.

  1. Après les lavages au ChIP, ajouter 38 μL de ddH2O autoclavé aux perles de l’échantillon dans des tubes de 1,5 mL pour la réparation de l’extrémité et la réaction de résidus dA.
  2. Ajouter 5,6 μL de mélange de réaction de préparation finale et 2,4 μL de mélange d’enzymes de préparation finale(tableau des matériaux)à chaque échantillon (volume total de réaction : 46 μL). Incuber des échantillons à 20 °C pendant 30 min.
  3. Laver les perles décrites dans les étapes de lavage précédentes du ChIP 7.4−7.6.

9. Ligature d’adaptateur d’index sur des perles

REMARQUE : L’adaptateur d’index a 6−10 bases de séquences d’index codées à barres, qui sont spécifiques à un échantillon donné utilisé pour multiplexer plusieurs échantillons dans le séquençage à haut débit. Les séquences d’ADN de l’adaptateur d’index sont décrites dans le tableau 1.

  1. Pour la ligature de l’adaptateur d’index, ajouter 27 μL de tampon tris-hcl froid de 10 mM (pH 7,4) aux perles de l’échantillon. Ajouter 2 μL d’adaptateur d’index de 15 μM, 0,5 μL d’exhausteur de ligature et 15 μL de mélange principal de ligase(tableau des matériaux)à chaque échantillon (volume de réaction total : 44,5 μL).
  2. Incuber des échantillons à 20 °C pendant 15 min. Laver les perles telles que décrites dans les étapes 7.4−7.6.

10. Réaction de remplissage sur les perles

REMARQUE : Après la ligature de l’adaptateur, il n’y a pas de lien de phosphodiester entre l’extrémité de 5' de l’adaptateur et l’extrémité de 3' de l’ADN ChIP. L’entaille peut être réparée par une réaction de remplissage.

  1. Ajouter 47 μL de tampon tris-hcl froid de 10 mM (pH 7,4) aux perles de l’échantillon.
  2. Faire le mélange de réaction de remplissage (tableau 4 et table des matériaux) sur la glace.
  3. Ajouter 11,1 μL de mélange de remplissage à chaque échantillon (volume de réaction total : 58,1 μL). Incuber des échantillons à 30 °C pendant 20 min. Laver les perles telles que décrites dans les étapes 7.4−7.6.

11. Digestion de l’exonucléase lambda sur perles

  1. Après la réaction de remplissage sur les perles, ajouter 50 μL de ddH2O autoclavé froid aux perles de l’échantillon.
  2. Pour digérer l’ADN chip dans la direction de 5' à 3', ajouter 6 μL de tampon d’exonuclease lambda de 10x et 2 μL de 5 U/μL lambda exonuclease(Tableau des matériaux,volume de réaction total : 58 μL). Incuber des échantillons à 37 °C pendant 30 min. Laver les perles telles que décrites dans les étapes 7.4−7.6.

12. Elution et liaison croisée inversée

  1. Faire tampon d’élitution ChIP tel que décrit dans le tableau 5.
    REMARQUE : N’ajoutez pas l’IPC au tampon d’élitution ChIP.
  2. Pour évaporer les échantillons de ChIP des perles, réutilisez des échantillons dans 75 μL de tampon d’élitution ChIP et incubez à 65 °C pendant 15 min à 130 x g.
  3. Ajouter 2,5 μL de 20 mg/mL de proteinase K(Tableau des matériaux)aux échantillons. Brièvement vortex, puis incuber les échantillons pendant la nuit à 65 °C.

13. Extraction d’ADN

  1. Une fois que les échantillons ont incubé pendant la nuit à 65 °C, faites tourner brièvement des échantillons, placez-les sur un support magnétique pendant 1 min, puis transférez le supernatant de chaque échantillon vers de nouveaux tubes de 1,5 mL.
  2. Ajouter 1 μL de 10 mg/mL de RNase A aux échantillons. Brièvement vortex, puis incuber les échantillons à 37 °C pendant 30 min. Ajouter ~25 μL de ddH2O autoclavé au volume jusqu’à 100 μL.
  3. Purifier l’ADN à l’aide de perles magnétiques( Tableau des matériaux). ADN elute avec 16 μL de ddHautoclavé 2O ou nucléase-libre ddH2O.

14. Denaturing, amorce annealing et extension d’amorce

  1. Après l’éution du ChIP et le croisement inverse, transférez 16 μL des échantillons d’ADN extraits de l’étape 13.3 aux tubes PCR.
  2. Faire le mélange d’annealing de denaturing et d’amorce (tableau 6 et table des matériaux)sur la glace. Ajouter 1,2 μL de mélange d’annealage dénaturant et d’amorce à chaque échantillon (volume de réaction total : 17,2 μL). Exécutez des échantillons à l’aide du programme décrit dans le tableau 6 pour dénoter et amorce anneal à l’ADN du modèle.
  3. Faire le mélange d’extensiond’amorce ( tableau 7 et table des matériaux) sur la glace.
  4. Une fois le programme de dénoature et d’amorce anneale terminé, ajouter 3 μL de mélange d’extension d’amorce aux échantillons (volume de réaction total : 20,2 μL). Exécutez des échantillons à l’aide du programme pour l’extension de l’amorce décrite dans le tableau 7.
  5. Procédez immédiatement à la réaction de dA-tailing.

15. réaction dA-tailing

REMARQUE : Pour la ligature collante d’ADN d’extrémité avec l’ADN universel d’adaptateur, le dATP est ajouté à l’extrémité 3' de l’émoussé, dsDNA par la réaction de dA-tailing.

  1. Faire le mélange dA-tailing (tableau 8 et table des matériaux) sur la glace.
  2. Ajouter 4,1 μL de mélange de résidus dA à chaque échantillon (volume de réaction total : 24,3 μL). Exécutez des échantillons à l’aide du programme de suivi dA( tableau 8).
  3. Passez immédiatement à la ligature universelle des adaptateurs.

16. Ligature universelle d’adaptateur

REMARQUE : L’adaptateur universel comprend des séquences spécifiques au séquençage à haut débit pour la reconnaissance de l’échantillon d’ADN pour la chimie du séquençage. Les séquences d’ADN de l’adaptateur universel sont décrites dans le tableau 1.

  1. Après la réaction dA-tailing, faire le mélange universel de ligature d’adaptateur (tableau 9 et table des matériaux)pour la ligature universelle d’adaptateur.
  2. Ajouter 21,5 μL à chaque échantillon (volume de réaction total : 45,8 μL) et incuber des échantillons pendant 15 min à 20 °C.

17. Nettoyage de l’ADN

  1. Purifier l’ADN à l’aide de perles magnétiques( Tableau des matériaux). ADN elute avec 21 μL de ddHautoclavé 2O ou nucléase-libre ddH2O.
  2. Conservez les échantillons à -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à effectuer la purification pcr (LM-PCR) et PCR à ligature.

18. PCR à la ligature

REMARQUE : Les séquences d’amorce LM-PCR sont décrites dans le tableau 1.

  1. Après le nettoyage de l’ADN, faire le mélange LM-PCR (tableau 10 et table des matériaux) sur la glace.
  2. Ajouter 29 μL de mélange LM-PCR à chaque échantillon (volume de réaction total : 50 μL) et exécuter des échantillons à l’aide du programme pour LM-PCR (tableau 10).
  3. Procédez immédiatement à la purification du gel de l’ADN amplifié par PCR, suivi de la purification de l’ADN pour le séquençage à haut débit.

19. Urification de pd’ADN de LM-PCR ADN amplifié

  1. Exécutez les échantillons d’ADN amplifiés LM-PCR, ainsi qu’une échelle d’ADN, dans un gel d’agarose de 1,5 % à 120−180 V et accise 200-400 bandes de pb.
  2. Purifier l’ADN du gel excisé à l’aide d’un kit d’extraction de gel( Table of Materials).
  3. Après la purification de l’ADN, vérifiez la concentration( Tableau des matériaux) de chaque échantillon de bibliothèque ChIP-exo. Soumettez des échantillons pour le séquençage à haut débit pour le séquençage à une seule lecture.
    REMARQUE : La longueur de lecture préférée pour le séquençage à lecture unique est d’au moins 35 pb, ce qui est suffisant pour aligner uniquement les lectures de séquençage sur le génome de référence dans les cellules souris ou humaines. Pour la plupart des facteurs de transcription chez la souris ou les cellules humaines, 10 à 20 millions de lecture par échantillon ChIP-exo sont suffisantes pour identifier leurs emplacements de liaison génomique. Au moins 30 millions de lectures par échantillon sont nécessaires pour cartographier les régions génomiques enrichies en marques d’histone dans les cellules mammifères.

Résultats

La figure 2A illustre les résultats de sonication après la lyse cellulaire et la sonication, avec divers cycles, des cellules de neurones moteurs différenciées des cellules ES de souris. Le nombre optimal de cycles de sonication (par exemple, 12 cycles de la figure 2A) agénéré une forte intensité d’ADN dans des fragments d’ADN de 100 à 400 pb. Les bibliothèques ChIP-exo de haute qualité sont basées sur la taille et la quantité d’ADN chromatine...

Discussion

Dans ce protocole, le ChIP suivi de la digestion de l’exonucléase est utilisé pour obtenir des bibliothèques d’ADN pour l’identification des interactions protéine-ADN dans les cellules mammifères à une résolution cartographique ultra-élevée. De nombreuses variables contribuent à la qualité de l’expérience ChIP-exo. Les paramètres expérimentaux critiques incluent la qualité des anticorps, l’optimisation de la sonication, et le nombre de cycles LM-PCR. Ces paramètres expérimentaux critiques sont ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le membre du laboratoire Rhee d’avoir partagé des données inédites et des discussions précieuses. Ces travaux ont été appuyés par la subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CSERN) RGPIN-2018-06404 (H.R.).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose, UltraPureInvitrogen16500Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1)
Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98%BioShopALB003Blocking Solution
Antibody against Isl1DSHB39.3F7Antibody incuation with beads (Section 5.6)
Bioruptor Pico DiagenodeB01060010Sonicating Chromatin (Section 3.3)
Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology GradeNew England BioLabsB9000SFill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2)
Centrifuge 5424 REppendorf5404000138Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4)
Centrifuge 5804 REppendorf22623508Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1)
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche4693159001Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer
dATP SolutionNew England BioLabsN0440SdA-Tailing Reaction (Section 15.1)
Deoxycholic Acid Sodium Saltfisher scientificBP349Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer
dNTP Mix, Molecular Biology GradeThermo ScientificR0192Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2)
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x Thermo ScientificK1081Ligation-Mediated PCR (Section 18.1)
EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0BioShopEDT111Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer
Ethyl Alcohol Anhydrous, 100%Commercial alcoholsP006EAANChecking Sonication (Section 4.3.3)
Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanolSigmaF8775Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1)
Glycerol, Reagent Grade, min 99.5%BioShopGLY002Lysis Buffer 1
Glycine, Biotechnology Grade, min. 99%BioShopGLN001Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2)
Glycogen, RNA GradeThermo ScientificR0551Checking Sonication (Section 4.3.3)
HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 BioShopHEP003Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer
Klenow Fragment (3->5 exo-)New England BioLabsM0212SdA-Tailing Reaction (Section 15.1)
Lambda exonucleaseNew England BioLabsM0262SLambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2)
Ligase EnhancerNew England BioLabsE7645SNEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1)
Ligase Master MixNew England BioLabsE7645SNEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1)
Lithium Chloride (LiCl), Reagent gradeBioshopLIT704LiCl Wash Buffer
Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G)Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP)Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP)Antibody incubation with beads (Section 5)
Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads)Beckman CoulterA63880DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1)
Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet)Invitrogen12321DUsed in many steps in Sections: 5 - 11, 13
MinElute Gel Extraction KitQiagen 28604Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2)
N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC)Sigma61747Lysis Buffer 3
Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630)BioShopNON999Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1)BioShopPHE512Checking Sonication (Section 4.3.1)
phi29 DNA PolymeraseNew England BioLabsM0269LFill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4)
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x Corning21040CVHarvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1)
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1)
ProFlex PCR SystemApplied BiosystemsProFlex PCR SystemUsed in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2
Protein LoBind Tube, 2.0 mL Eppendorf22431102Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3)
Proteinase K Solution, RNA GradeInvitrogen25530049Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3)
Qubit 4.0 FluorometerInvitrogenQ33226Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)
Quibit dsDNA BR assay kitInvitrogenQ32853Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)
Rnase A, Dnase and Protease-freeThermo ScientificEN0531Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2)
Sodium chloride (NaCl), BioReagent SigmaS5886Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis GradeBioShopSDS001Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer
Sonication beads and 15 mL Bioruptor TubesDiagenodeC01020031Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2)
ThermoMixer F1.5 Eppendorf5384000020Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2
Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4SigmaT219410 mM Tris-HCl Buffer
Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0SigmaT2694Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer
Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn)New England BioLabsE7546SEnd Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2)
VWR Mini Tube Rocker, Variable SpeedVWR10159-752Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7
2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent GradeBioShopTRX506Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer

Références

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