Surveillance de la survie du virus de la grippe à l’extérieur de l’hôte à l’aide d’une analyse cellulaire en temps réel

Résumé

Il est rapporté ici un protocole pour la quantification des particules virales infectieuses en utilisant la surveillance en temps réel de l’impédance électrique des cellules infectées. Une application pratique de cette méthode est présentée en quantifiant la désintégration du virus de la grippe A sous différents paramètres physicochimiques imitant les conditions environnementales.

Résumé

Les méthodes de quantification des particules virales représentent un aspect essentiel de nombreuses études virologiques. Bien qu’il existe plusieurs techniques fiables, elles prennent beaucoup de temps ou sont incapables de détecter de petites variations. Présenté ici est un protocole pour la quantification précise du titre viral en analysant les variations d’impédance électrique des cellules infectées en temps réel. L’impédance cellulaire est mesurée à l’aide de biocapteurs à microélectrodes d’or situés sous les cellules dans des microplaques, dont l’ampleur dépend du nombre de cellules ainsi que de leur taille et de leur forme. Ce protocole permet une analyse en temps réel de la prolifération, de la viabilité, de la morphologie et de la migration cellulaires avec une sensibilité accrue. Un exemple d’application pratique est également fourni en quantifiant la désintégration du virus de la grippe A (VAI) soumise à divers paramètres physicochimiques affectant l’infectiosité virale au fil du temps (c.-à-d. température, salinité et pH). Pour de telles applications, le protocole réduit la charge de travail nécessaire tout en générant des données de quantification précises des particules virales infectieuses. Il permet de comparer les pentes d’inactivation entre différents IAV, ce qui reflète leur capacité à persister dans un environnement donné. Ce protocole est facile à réaliser, est hautement reproductible et peut être appliqué à tout virus produisant des effets cytopathiques en culture cellulaire.

Introduction

La transmission d’un virus repose sur la combinaison de plusieurs facteurs. Pour un virus sécrété dans l’environnement, sa transmission dépend également de sa capacité à persister dans des conditions extérieures à l’hôte. L’étude de l’inactivation virale en général est donc une étape cruciale pour aider les autorités sanitaires nationales et les décideurs politiques à mettre en œuvre des mesures de contrôle et de biosécurité.

Les connaissances sur la persistance du virus dans les milieux naturels et de laboratoire ont considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. Dans le cas des virus de la grippe A (IAV), leurs voies de transmission soumettent les particules virales à un large éventail de conditions environnementales. Plus précisément, ils peuvent être transmis par 1) voies fécales-orales par l’eau (c.-à-d. les virus aviaires), ou 2) par contact direct ou indirect par des fomites contaminés, ainsi que par des aérosols et des gouttelettes respiratoires (c.-à-d. des virus de volaille et de mammifères)¹. Dans tous les cas, les IAV sont soumis à divers paramètres physico-chimiques (p.a., salinité, température et humidité), ce qui affecte plus ou moins rapidement leur infectiosité2,3,4,5,6,7,8,9. Il est très important, en particulier en ce qui concerne les virus zoonotiques et pandémiques, d’évaluer le potentiel des facteurs environnementaux à affecter la dynamique du virus et les risques d’exposition et de transmission interspécifique.

Jusqu’à présent, des techniques virologiques traditionnelles (c.-à-d. la détermination du titre viral par des essais de plaque ou l’estimation de la dose infectieuse par culture tissulaire à 50 %) ont été utilisées pour évaluer l’infectiosité de l’IAV au fil du temps; mais ces techniques prennent beaucoup de temps et nécessitent de nombreux approvisionnements10,11,12. La mesure de l’impédance des cellules infectées au fil du temps avec des microélectrodes est un outil utile pour surveiller la survie aux MII dans différentes conditions environnementales, ainsi que l’inactivation virale en général. Cette méthode fournit des données objectives en temps réel qui remplacent l’observation humaine subjective des effets cytopathiques. Il peut être utilisé pour déterminer le titrage du virus, remplaçant ainsi les mesures traditionnelles par des intervalles de confiance plus faibles et évitant les tests d’évaluation à forte intensité de main-d’œuvre.

Il existe une corrélation linéaire entre les résultats de titrage obtenus par mesure de l’impédance cellulaire et par les méthodes classiques de dosage de la plaque ou _TCID50. Par conséquent, les données obtenues avec la méthode de titrage basée sur l’impédance peuvent être facilement transformées en valeurs _TCID50 ou pfu en créant une courbe standard avec dilution en série du virus13,14,15,16,17. La détection, la quantification et l’efficacité des anticorps neutralisants présents dans les échantillons de sérum peuvent également être obtenues à l’aide de cette approche ^{expérimentale18,19}. Plus récemment, des tests cellulaires basés sur l’impédance ont été utilisés pour dépister et évaluer les composés antiviraux contre les alphaherpèsvirus ^Equid20.

Cette technologie a été utilisée pour évaluer la persistance des IAV dans l’eau saline à différentes températures et pour identifier les mutations dans l’hémagglutinine de l’IAV qui augmentent ou diminuent la persistance de l’IAV dans ^{l’environnement21}. Un tel dépistage nécessiterait un travail approfondi s’il utilisait des méthodes de titrage traditionnelles. Cependant, cette méthodologie peut être utilisée pour tout virus qui a un impact sur la morphologie cellulaire, le nombre de cellules et la force d’attachement de la surface cellulaire. Il peut également être utilisé pour surveiller la persistance dans diverses conditions environnementales (c.-à-d. dans l’air, dans l’eau ou sur les surfaces).

Le protocole décrit ici applique la survie IAV dans l’eau à titre d’exemple. Les virus de la grippe humaine sont exposés à différents paramètres physico-chimiques pendant de longues périodes. L’eau saline (35 g/L de NaCl) à 35 °C a été choisie comme modèle environnemental sur la base des résultats ^{précédents9}. L’infectiosité résiduelle des virus exposés est quantifiée à différents moments par le biais de l’infection cellulaire. Les cellules MDCK, le type de cellule de référence pour l’amplification IAV, sont ensemencées sur 16 plaques de microtitrage de puits recouvertes de capteurs à microélectrodes et infectées par des virus exposés 24 heures plus tard. L’impédance cellulaire est mesurée toutes les 15 minutes et exprimée sous la forme d’une unité arbitraire appelée indice cellulaire (IC). Les effets cytopathiques induits par le virus de la grippe, dont le taux d’apparition dépend directement du nombre de particules virales infectieuses inoculées à la culture cellulaire, entraînent une diminution de l’IC, qui est ensuite quantifiée comme la valeur _CIT50 . Cette valeur correspond au temps nécessaire pour mesurer une réduction de 50 % par rapport à l’IC initial (c.-à-d. avant l’ajout du virus). Les valeurs _CIT50 calculées pour plusieurs temps d’exposition environnementale permettent de déduire la pente d’inactivation d’un virus après régression linéaire des valeurs _CIT50 .

Protocole

Manipuler tous les virus de la grippe selon les exigences appropriées en matière de niveau de biosécurité (BSL-2 ou plus selon le sous-type). Utilisez des souches IAV avec un faible historique de passage (moins de 5x sur les cellules MDCK) pour assurer une faible variation entre les expériences.

1. Préparation des réactifs et des matières premières

1. Préparation de cellules MDCK et d’un milieu de culture cellulaire stérile
   1. Cultiver des cellules du rein canin Madin-Darby (MDCK) dans un milieu d’Eagle modifié (MEM) complété par du sérum de veau fœtal inactivé à la chaleur (FCS) et des antibiotiques (100 unités / mL de pénicilline, 100 mg / mL de streptomycine).
   2. Après décongélation, passage des cellules MDCK au moins 2x avant de les infecter pour assurer une récupération complète (mais moins de 30 passages pour éviter toute dérive dans les phénotypes cellulaires).
   3. Ensemencement de flacons de culture tissulaire de 75 ^cm2 contenant 30 mL de MEM stérile 1x avec 7,5 x ¹⁰⁶ cellules MDCK et incuber à 37 °C dans un incubateur à _CO2 humidifié à 5 %.
2. Préparation de l’équipement de surveillance de l’impédance
   1. Placez l’instrument dans l’incubateur à 35 °C et laissez-le se réchauffer pendant au moins 2 h.
   2. Connectez-le à l’unité de commande placée à l’extérieur de l’incubateur.
   3. Procédez aux procédures de nettoyage recommandées par le fabricant avant de commencer le reste de l’expérience.
3. Production de stocks IAV sur cellules MDCK
   1. Pour propager et amplifier les virus H1N1, ensemencez 7,5 x ¹⁰⁶ cellules MDCK sur deux flacons de culture tissulaire de 75 ^cm2 et incubez pendant 24 h à 37 °C pour atteindre une confluence de 90 % à 100 %.
   2. Décanter le milieu de culture cellulaire de la monocouche cellulaire dans des flacons de 75 ^cm2 . Lavez les cellules avec 5 mL de PBS stérile 1x.
   3. Retirez le PBS et ajoutez 5 mL de 1x PBS pour laver à nouveau les cellules.
   4. Étiquetez une fiole comme témoin et retirez le PBS avant d’ajouter soigneusement 15 mL de milieu de propagation du virus (1x MEM avec 0 % FCS) sur la monocouche. Incuber cette fiole dans un incubateur maintenu à 35 °C avec 5% de _CO2. Utilisez-le pour la comparaison après 3 jours de propagation.
   5. Décongeler un flacon de stock de VAI à TA. Diluer le virus à la concentration appropriée dans un tube de 1,5 mL contenant un milieu de propagation du virus (1x MEM avec 0% FCS).
   6. Retirer 1x PBS de la fiole de 75 ^cm2 et infecter les cellules MDCK à une multiplicité d’infection (MOI) de 1 x ^10-3 ou 1 x ^10-4 unités formant de la plaque par cellule (pfu/cellule) en ajoutant 1 mL du virus dilué à la monocouche cellulaire.
   7. Adsorbez le virus sur les cellules MDCK pendant 45 min à TA en remuant la fiole régulièrement toutes les 15 minutes.
   8. Retirer doucement l’inoculum et ajouter 15 mL de milieux de propagation du virus par fiole contenant 1 μg/mL de TPCK-trypsine (trypsine/L-1-tosylamide-2-phényléthyl chlorométhylcétone), pour cliver l’hémagglutinine virale HA0 en sous-unités HA1 et HA2 (un événement nécessaire à la fusion de l’AH avec la membrane endosomique et à la libération du génome viral)²².
   9. Incuber les flacons à 35 °C et 5 % de _CO2 pendant au moins 3 jours pour répliquer le virus.
   10. Observez les cellules MDCK au microscope à un grossissement de 40x et recherchez des effets cytopathiques (CPE) sur les cellules (en les comparant à la fiole de contrôle cellulaire). Si le CPE n’est pas complet (c’est-à-dire qu’environ 80 % des cellules sont détachées du substrat), remettez les flacons dans l’incubateur pendant 24 heures supplémentaires.
   11. Lorsque le CPE est terminé, décanter le surnageant de culture cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 10 min pour granuler les débris cellulaires.
   12. Transférer le surnageant clarifié dans un tube de 15 mL et les virus de descendance aliquote dans des flacons cryogéniques stériles à usage unique. Placez immédiatement les cryotubes à -80 °C pour congeler et stocker les virus.

2. Détermination de la quantité de cellules appropriée pour infecter les cellules

REMARQUE: Pendant toutes les expériences, conservez les plaques sur des surfaces non électrostatiques en tout temps, telles que les pellicules de papier de l’emballage. Suivez la section 2 ci-dessous pour déterminer la concentration la plus appropriée de cellules à ensemencer dans la plaque de microtitrage électronique (conçue comme E-Plate).

1. Préparer les cellules MDCK dans des flacons de 75 ^cm2 pour obtenir des cellules fraîchement divisées (environ 80% de confluence) 24 h avant l’expérience.
2. Lavez les cellules avec 5 mL de 1x PBS et détachez-les en ajoutant 3 mL de solution de trypsine-EDTA à 0,25%.
3. Ajouter 7 mL de milieu de culture cellulaire frais et compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé avec coloration bleu trypan.
4. Ajuster la concentration cellulaire à 400 000 cellules/mL avec des milieux de culture cellulaire. Effectuer deux dilutions en série dans des tubes supplémentaires pour obtenir des densités cellulaires de 200 000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; et 6 250 cellules/mL. Ajustez la plage de dilution des cellules en fonction du type de cellule et de leur comportement de croissance.
5. Laissez la plaque E (Table des matériaux) à TA pendant plusieurs minutes et ajoutez 100 μL de milieu de culture cellulaire à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal. Ne touchez pas les électrodes de la plaque E.
6. Déverrouillez les berceaux et insérez l’extrémité avant de la plaque dans la poche du berceau de l’instrument de mesure de l’impédance (table des matériaux). Fermez la porte de l’incubateur.
7. Ouvrez le logiciel.
   1. Dans « Configuration du modèle d’expérience par défaut », choisissez le(s) berceau(x) sélectionné(s) et double-cliquez sur la page supérieure, puis entrez le nom de l’expérience. Cliquez sur « Mise en page » et entrez les informations d’échantillon nécessaires pour chaque puits sélectionné de la plaque; puis, cliquez sur « Appliquer » lorsque vous avez terminé. Cliquez sur « Planifier » | | « Étapes » « Ajouter une étape ». Le logiciel ajoute automatiquement une étape de 1 s pour mesurer l’impédance d’arrière-plan (CI).
   2. Cliquez sur « Démarrer/Continuer » dans l’onglet « Exécuter ». Cliquez sur « Tracer », ajoutez tous les échantillons en sélectionnant les puits appropriés et assurez-vous que l’IC se situe entre -0,1 et 0,1 avant de passer à l’étape suivante.
8. Retirez la plaque du berceau.
9. Ajouter 100 μL de chaque suspension cellulaire de l’étape 2.4 en double exemplaire aux puits appropriés et 100 μL de milieu cellulaire dans les puits utilisés comme témoins. Laissez la plaque E dans la hotte à écoulement laminaire pendant 30 minutes à TA pour permettre une distribution uniforme des cellules au fond des puits.
10. Insérez la plaque E dans la poche du berceau. Cliquez sur « Planifier » | « Ajouter une étape » dans le logiciel et entrez des valeurs pour surveiller les cellules toutes les 30 minutes pour 200 répétitions. Ensuite, sélectionnez « Démarrer / Continuer ».
11. Vérifiez et tracez les données CI en cliquant sur le bouton « Tracer » dans le logiciel. Sélectionnez la concentration de cellules qui se trouvent juste avant la phase stationnaire 24 h après l’ensemencement sur la plaque, afin d’obtenir des cellules qui sont encore en phase de croissance pendant l’infection virale. La phase stationnaire est atteinte lorsque l’IC est à son maximum.

3. Corrélation entre les valeurs _CIT50 et la multiplicité de l’infection

1. Ajouter 100 μL de milieu de culture stérile 1x MEM dans chaque puits de la plaque E. Insérez la plaque E dans la poche du berceau de l’instrument à 35 °C. Mesurez l’arrière-plan comme décrit à l’étape 2.7.
2. Retirez la plaque E de la station d’accueil.
3. Ensemencez 3 x ¹⁰⁴ de cellules MDCK fraîchement fendues sur chaque puits de la plaque de microtitrage électronique et cultivez-les pendant 24 h à 35 °C avec 5% de _CO2 afin qu’elles soient dans une phase réplicative pendant l’infection par IAV.
4. Infecter les cellules MDCK avec différentes dilutions 10 fois d’un titre _TCID50/mL connu de 6 _log10/mL du virus H1N1, en utilisant le pipetage inversé pour la reproductibilité en suivant les étapes ci-dessous :
   1. Rincer les cellules MDCK 2x avec 100 μL de MEM sans FCS (milieu de propagation du virus). Veillez à retirer tous les supports après le deuxième lavage pour éviter une dilution supplémentaire de l’inoculum.
   2. Ajouter 100 μL de suspension virale dans chaque puits à l’aide d’une pipette à canal unique. Pour éviter toute contamination, commencez de gauche à droite puis de haut en bas dans la plaque, tout en recouvrant les puits restants avec le couvercle.
   3. Insérez la plaque dans la poche du berceau de l’instrument à 35 °C. Soyez doux pour éviter les mouvements brusques pouvant entraîner des contaminations.
   4. Commencez à surveiller l’impédance cellulaire toutes les 15 minutes pendant au moins 100 h, comme décrit à l’étape 2.10.
   5. Après les deux cycles de mesures (c’est-à-dire 30 min), mettez l’appareil en pause en cliquant sur « Pause » dans l’onglet « Exécuter » et retirez la plaque E du berceau.
   6. Ajouter 1 μg/mL de TPCK-trypsine au milieu de propagation du virus pour cliver l’hémagglutinine virale.
   7. Ajouter 100 μL de milieux de propagation du virus contenant de la TPCK-trypsine dans chaque puits et insérer la plaque E dans la poche du berceau.
   8. Cliquez sur « Démarrer/Continuer » dans l’onglet « Exécuter ».
      REMARQUE: N’oubliez pas de créer un témoin négatif correspondant aux cellules infectées par des simulacres en remplaçant la suspension virale par des milieux de propagation du virus.

4. Cinétique de survie IAV

1. Exposez l’IAV à de l’eau distillée saline à 35 °C et testez leur infectiosité au fil du temps en mesurant la diminution de l’impédance cellulaire.
   1. Préparer de l’eau distillée saline en ajoutant du NaCl à une concentration finale de 35 g/L dans l’eau distillée. Ajouter 900 μL d’eau saline dans 2 mL de cryotubes.
   2. Ajouter 100 μL de matière virale dans de l’eau salée et placer les cryotubes dans un incubateur (35 °C, 5 % de _CO2) pendant 1 h, 24 h ou 48 h.
   3. Semer 100 μL (contenant 3 x ¹⁰⁴) de cellules MDCK fraîchement fendues sur une plaque de microtitrage de 16 puits et croître pendant 24 h à 37 °C et 5 % de _CO2.
   4. Infecter les cellules avec 100 μL de virus exposés (préalablement dilués 10x dans des milieux de culture) en utilisant la méthode de pipetage inversé pour la reproductibilité en répétant la section 3.4.
2. Surveillez l’impédance cellulaire toutes les 15 minutes pendant au moins 100 h.

5. Évaluation de la perte d’infectiosité

1. Détermination des valeurs CIT50 pour quantifier la diminution de l’IC due aux effets cytopathiques induits par le virus avec la valeur _CIT50 .
   1. Cliquez sur « Tracer » et ajoutez tous les échantillons en cliquant sur « Ajouter tout ». Exportez les résultats dans une feuille de calcul en cliquant sur « Exporter les informations de l’expérience ». Considérez l’IC initiale comme une valeur d’impédance cellulaire mesurée 5 h après l’infection cellulaire par des virus exposés (c.-à-d. 24 h après l’ensemencement des cellules MDCK sur la plaque E du microtitrage).
   2. Calculer la valeur _CIT50 correspondant au temps nécessaire pour mesurer une diminution de 50 % par rapport à l’IC initial. Pour calculer la valeur _CIT50 , notez la valeur CI à 5 HPI pour chaque échantillon. Ensuite, recherchez le point temporel auquel la valeur CI est égale à la moitié de la valeur CI à 5 hpi à l’aide des fonctions d’index et de correspondance de la feuille de calcul.
2. Calcul de la pente moyenne d’inactivation
   1. Déterminer les valeurs _CIT50 pour chaque suspension virale exposée, à différents moments d’exposition (en jours).
   2. Calculez une pente de régression linéaire à partir des valeurs tracées _CIT50, appelées pente d’inactivation et exprimées en _CIT50.day-1.

Résultats

Les données brutes obtenues après 120 h avec différentes concentrations de cellules MDCK, de 15 000 à 120 000 cellules par puits, sont présentées à la figure 1. Après 24 h, les mesures de l’IC montrent que les cellules dans les puits ensemencés avec 30 000 cellules étaient encore dans la phase exponentielle de croissance, et cette concentration cellulaire a été utilisée pour d’autres expériences. La figure 2 illustre la corrélation linéaire e...

Discussion

RtCA est une technologie basée sur l’impédance qui est de plus en plus utilisée pour la surveillance en temps réel des propriétés cellulaires, telles que l’adhérence cellulaire, la prolifération, la migration et la cytotoxicité. Dans cette étude, la capacité de cette technologie à évaluer la survie de la VAI à l’extérieur de l’hôte est démontrée en mesurant la pente d’inactivation du virus. Les techniques fastidieuses telles que _TCID50 et les tests de plaque sont remplacées par une...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25%Trypsin	ThermoFisher	25200056
75 cm2 tissue culture flask	Falcon	430641U
E-Plate 16 (6 plates)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	E-plates are avalible in different packaging
FCS	Life technologies (gibco)	10270-106
MEM 1X	Life technologies (gibco)	31095029
PBS 1X	Life technologies (gibco)	14040091
Penicillin-Streptomycin	Life technologies (gibco)	11548876
TPCK-Trypsin	Worthington	LS003740
xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate)