Мониторинг выживаемости вируса гриппа вне хозяина с помощью анализа клеток в режиме реального времени

Резюме

Здесь представлен протокол количественной оценки инфекционных вирусных частиц с использованием мониторинга электрического импеданса инфицированных клеток в режиме реального времени. Практическое применение данного метода представлено путем количественной оценки распада вируса гриппа А при различных физико-химических параметрах, имитирующих условия окружающей среды.

Аннотация

Методы количественной оценки вирусных частиц представляют собой критический аспект многих вирусологических исследований. Хотя существует несколько надежных методов, они либо отнимают много времени, либо не могут обнаружить небольшие вариации. Здесь представлен протокол для точной количественной оценки вирусного титра путем анализа вариаций электрического импеданса инфицированных клеток в режиме реального времени. Клеточное сопротивление измеряется с помощью биосенсоров микроэлектрода золота, расположенных под клетками в микропластинах, величина которых зависит от количества клеток, а также их размера и формы. Этот протокол позволяет в режиме реального времени анализировать пролиферацию, жизнеспособность, морфологию и миграцию клеток с повышенной чувствительностью. Также приведен пример практического применения путем количественной оценки распада вируса гриппа А (IAV), представленного различным физико-химическим параметрам, влияющим на вирусную инфекционность с течением времени (т.е. температуре, солености и рН). Для таких приложений протокол снижает необходимую рабочую нагрузку, а также генерирует точные количественные данные инфекционных вирусных частиц. Это позволяет сравнивать склоны инактивации между различными IAV, что отражает их способность сохраняться в данной среде. Этот протокол прост в исполнении, обладает высокой воспроизводимостью и может быть применен к любому вирусу, вызывающему цитопатические эффекты в клеточной культуре.

Введение

Передача вируса зависит от сочетания нескольких факторов. Для вируса, секретируемого в окружающей среде, его передача также зависит от способности сохраняться в условиях вне хозяина. Таким образом, изучение вирусной инактивации в целом является решающим шагом в оказании помощи национальным органам здравоохранения и лицам, формирующим политику, в осуществлении мер контроля и биобезопасности.

За последнее десятилетие значительно возросли знания о персистенции вируса в естественных и лабораторных условиях. В случае вирусов гриппа А (IAV) их пути передачи представляют вирусные частицы в широком диапазоне условий окружающей среды. В частности, они могут передаваться через 1) фекально-оральные пути через воду (т.е. птичьи вирусы) или 2) прямой или косвенный контакт зараженных фомитов, а также аэрозолей и респираторных капель (т.е. вирусов домашней птицы и млекопитающих)¹. В любом случае, IAV подвергаются различным физико-химическим параметрам (т.е. рН, солености, температуре и влажности), что более или менее быстро влияет на их инфекционность2,3,4,5,6,7,8,9. Очень важно, особенно в отношении зоонозных и пандемических вирусов, оценить потенциал факторов окружающей среды, влияющих на динамику вируса, и риски воздействия и межвидовой передачи.

До настоящего времени для оценки инфекционной активности IAV с течением времени использовались традиционные методы вирусологии (т.е. определение титра вируса с помощью анализов бляшек или 50% оценка инфекционной дозы культуры тканей); но эти методы отнимают много времени и требуют многих расходных материалов10,11,12. Измерение импеданса инфицированных клеток с течением времени с помощью микроэлектродов служит полезным инструментом для мониторинга выживаемости IAV в различных условиях окружающей среды, а также вирусной инактивации в целом. Этот метод предоставляет объективные данные в режиме реального времени, которые заменяют субъективное наблюдение человека за цитопатическими эффектами. Его можно использовать для определения титрования вируса, тем самым заменяя традиционные измерения более низкими доверительными интервалами и избегая трудоемких анализов конечных точек.

Существует линейная корреляция между результатами титрования, полученными путем измерения импеданса клеток, и классическим анализом бляшек или методами _TCID50. Поэтому данные, полученные методом титрования на основе импеданса, могут быть легко преобразованы в значения _TCID50 или pfu путем создания стандартной кривой с последовательным разбавлением вируса13,14,15,16,17. Обнаружение, количественная оценка и эффективность нейтрализующих антител, присутствующих в образцах сыворотки, также могут быть достигнуты с использованием этого экспериментального ^{подхода18,19}. Совсем недавно клеточные анализы на основе импеданса использовались для скрининга и оценки противовирусных соединений против альфагерпесвирусов ^Equid20.

Эта технология была использована для оценки стойкости IAV в соленой воде при различных температурах и для выявления мутаций в гемагглютинине IAV, которые увеличивают или уменьшают стойкость IAV в окружающей ^среде21. Такой скрининг потребует обширной работы при использовании традиционных методов титрования. Однако эта методология может быть использована для любого вируса, который оказывает влияние на морфологию клеток, количество клеток и силу прикрепления клеточной поверхности. Он также может быть использован для мониторинга стойкости в различных условиях окружающей среды (например, в воздухе, в воде или на поверхностях).

Протокол, описанный здесь, применяет выживание IAV в воде в качестве примера. Вирусы гриппа человека подвергаются воздействию различных физико-химических показателей в течение длительных периодов времени. Соленая (35 г/л NaCl) вода при 35 °C была выбрана в качестве экологической модели на основе предыдущих ^{результатов9}. Остаточная инфекционность подвергшихся воздействию вирусов количественно определяется в разные моменты времени через клеточную инфекцию. Клетки MDCK, тип эталонных клеток для амплификации IAV, засеивают на 16 микротитрных пластинах, покрытых микроэлектродными датчиками, и заражаются облученными вирусами через 24 ч. Импеданс клеток измеряется каждые 15 мин и выражается в виде произвольной единицы, называемой клеточным индексом (CI). Цитопатические эффекты, индуцированные вирусом гриппа, скорость начала которого напрямую зависит от количества инфекционных вирусных частиц, привитых культуре клеток, приводит к снижению ДИ, которое впоследствии количественно определяется как значение _CIT50 . Это значение соответствует времени, необходимому для измерения снижения на 50% от исходного ДИ (т.е. до добавления вируса). Значения _CIT50 , рассчитанные на несколько раз воздействия на окружающую среду, позволяют вывести наклон инактивации вируса после линейной регрессии значений _CIT50 .

протокол

Обрабатывать все вирусы гриппа в соответствии с соответствующими требованиями уровня биобезопасности (BSL-2 или выше в зависимости от подтипа). Используйте штаммы IAV с низкой историей прохождения (менее 5x на клетках MDCK), чтобы обеспечить низкую вариацию между экспериментами.

1. Подготовка реагентов и исходных материалов

1. Подготовка клеток MDCK и стерильной клеточной культуральной среды
   1. Культивируйте клетки собачьей почки Мадина-Дарби (MDCK) в модифицированной среде Орла (MEM), дополненной 10% инактивированной теплом сывороткой для телят плода (FCS) и антибиотиками (100 единиц / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина).
   2. После оттаивания проходите клетки MDCK не менее 2 раз перед их заражением, чтобы обеспечить полное выздоровление (но менее 30 проходов, чтобы избежать любого дрейфа в клеточных фенотипах).
   3. Колба (колбы) семенной культуры 75 ^см2 , содержащая 30 мл стерильной 1x MEM с 7,5 x ¹⁰⁶ клетками MDCK и инкубируем при 37 °C в увлажненном 5% _CO2 инкубаторе.
2. Подготовка оборудования для контроля импеданса
   1. Поместите инструмент в инкубатор при температуре 35 °C и дайте ему прогреться не менее 2 ч.
   2. Подключите его к блоку управления, размещенному вне инкубатора.
   3. Приступайте к процедурам очистки в соответствии с рекомендациями производителя перед началом оставшейся части эксперимента.
3. Производство запасов IAV на ячейках MDCK
   1. Для размножения и амплификации вирусов H1N1 посеяли клетки 7,5 x ¹⁰⁶ MDCK на двух колбах тканевых культур по 75 ^см2 и инкубировали в течение 24 ч при 37 °C до достижения 90-100% слияния.
   2. Декантировать питательную среду клеток из клеточного монослоя в колбы размером 75 ^см2 . Промыть клетки 5 мл стерильного 1x PBS.
   3. Удалите PBS и добавьте 5 мл 1x PBS, чтобы снова промыть клетки.
   4. Пометьте одну колбу в качестве контрольной и удалите PBS перед добавлением 15 мл среды распространения вируса (1x MEM с 0% FCS) осторожно на монослой. Инкубируйте эту колбу в инкубаторе, поддерживаемом при 35 °C с 5% _CO2. Используйте его для сравнения после 3 дней размножения.
   5. Разморозьте один флакон с запасом IAV на RT. Разбавьте вирус до соответствующей концентрации в пробирке объемом 1,5 мл, содержащей среду распространения вируса (1x MEM с 0% FCS).
   6. Удалите 1x PBS из колбы объемом 75 ^см2 и заразите клетки MDCK при кратности инфекции (MOI) 1 x ^10-3 или 1 x ^10-4 бляшки, образующих единицы на клетку (pfu / клетка), добавив 1 мл разбавленного вируса в клеточный монослой.
   7. Адсорбировать вирус к клеткам MDCK в течение 45 мин при RT путем регулярного перемешивания колбы каждые 15 мин.
   8. Осторожно удаляют инокулятор и добавляют 15 мл среды распространения вируса на колбу, содержащую 1 мкг/мл TPCK-трипсина (трипсин/L-1-тозиламид-2-фенилэтилхлорметилкетон), чтобы расщепить вирусный гемагглютинин HA0 на субъединицы HA1 и HA2 (событие, которое требуется для слияния ГК с эндосомальной мембраной и высвобождения вирусного генома)²².
   9. Инкубируйте колбы при 35 °C и 5% _CO2 в течение не менее 3 дней для репликации вируса.
   10. Наблюдайте за клетками MDCK под микроскопом при 40-кратном увеличении и ищите цитопатические эффекты (CPE) на клетки (по сравнению с клеткой контроля клеток). Если CPE не является полным (т. Е. Около 80% клеток отделяются от субстрата), поместите колбы обратно в инкубатор еще на 24 часа.
   11. Когда CPE будет завершен, декантируйте супернатант клеточной культуры и центрифугу при 300 х г в течение 10 мин, чтобы гранулировать клеточный мусор.
   12. Перенос осветленного супернатанта в пробирку объемом 15 мл и вирусов потомства аликвоты в одноразовые стерильные криогенные флаконы. Немедленно поместите криотрубы при -80 °C, чтобы заморозить и запастись вирусами.

2. Определение соответствующего количества клеток для заражения клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время всех экспериментов всегда держите пластины на неэлектростатических поверхностях, таких как бумажные упаковки из упаковки. Следуйте разделу 2 ниже, чтобы определить наиболее подходящую концентрацию клеток, которые должны быть засеяны в электронную микротитерную пластину (разработанную как E-Plate).

1. Готовят клетки MDCK в колбах объемом 75 ^см2 для получения свежерасщепленных клеток (примерно 80% слияния) за 24 ч до начала эксперимента.
2. Промыть клетки 5 мл 1x PBS и отсоединить их, добавив 3 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА.
3. Добавьте 7 мл свежей клеточной культуральной среды и подсчитайте клетки с помощью автоматизированного счетчика клеток с окрашиванием трипаном в синий цвет.
4. Отрегулируйте концентрацию клеток до 400 000 клеток/мл с помощью клеточной культуральной среды. Выполняют двукратное последовательное разведение в дополнительных пробирках для получения плотности клеток 200 000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; и 6 250 клеток/мл. Отрегулируйте диапазон разбавления клеток в соответствии с типом клеток и их поведением роста.
5. Оставьте Е-пластину (Таблицу материалов) в RT на несколько минут и добавьте 100 мкл клеточной культуральной среды в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Не прикасайтесь к электродам электронной пластины.
6. Разблокируйте люльки и вставьте передний конец пластины в карман колыбели прибора для измерения импеданса (Таблица материалов). Закройте дверцу инкубатора.
7. Откройте программное обеспечение.
   1. В разделе «Настройка шаблона эксперимента по умолчанию» выберите выбранную подставку (подставки) и дважды щелкните на верхней странице, затем введите название эксперимента. Нажмите кнопку «Макет» и введите необходимую информацию о образце для каждого выбранного колодца плиты; затем нажмите «Применить», когда закончите. Нажмите "Расписание" | | "Шаги" "Добавить шаг". Программа автоматически добавляет шаг 1 с для измерения фонового импеданса (CI).
   2. Нажмите «Пуск/Продолжить» на вкладке «Выполнить». Нажмите «График», добавьте все образцы, выбрав соответствующие скважины, и убедитесь, что CI находится между -0,1 и 0,1, прежде чем перейти к следующему шагу.
8. Снимите пластину с люльки.
9. Добавить 100 мкл каждой клеточной суспензии со стадии 2.4 в дубликате к соответствующим скважинам и 100 мкл клеточной среды в скважинах, используемых в качестве контрольных. Оставьте Е-пластину в ламинарной проточной вытяжке на 30 мин при РТ, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек на дне скважин.
10. Вставьте электронную пластину в карман колыбели. Нажмите "Расписание" | «Добавить шаг» в программном обеспечении и ввести значения для мониторинга ячеек каждые 30 минут в течение 200 повторений. Затем выберите «Пуск/Продолжить».
11. Проверьте и отобразите данные CI, нажав на кнопку «График» в программном обеспечении. Подбирают концентрацию клеток, которые находятся непосредственно перед стационарной фазой через 24 ч после посева на пластину, для того чтобы получить клетки, которые еще находятся в фазе роста во время вирусной инфекции. Стационарная фаза достигается, когда КИ находится на максимуме.

3. Корреляция между значениями _CIT50 и множественностью инфекции

1. Добавьте 100 мкл стерильной 1x MEM питательной среды в каждую лунку Е-пластины. Вставьте электронную пластину в карман колыбели инструмента при 35 °C. Измерьте фон, как описано в шаге 2.7.
2. Снимите Е-образную пластину с люльки.
3. Посейте 3 x ¹⁰⁴ свежерасщепленных клеток MDCK на каждой лунке электронной микротитровой пластины и выращивайте их в течение 24 ч при 35 °C с 5% _CO2 , чтобы они находились в репликативной фазе во время инфекции IAV.
4. Инфицируйте клетки MDCK различными 10-кратными разведениями известного титра 6 _{log10 TCID50}/mL вируса H1N1, используя обратное пипетирование для воспроизводимости, выполнив следующие шаги:
   1. Промыть клетки MDCK 2x со 100 мкл MEM без FCS (среда распространения вируса). Помните об удалении всех сред после второй промывки, чтобы избежать дальнейшего разбавления инокулята.
   2. Добавьте 100 мкл вирусной суспензии в каждую лунку с помощью одноканальной пипетки. Чтобы избежать загрязнения, продолжайте, начиная слева направо, затем сверху вниз в пластине, при этом закрывая оставшиеся колодцы крышкой.
   3. Вставьте пластину в карман колыбели инструмента при 35 °C. Будьте осторожны, чтобы избежать резких движений, потенциально приводящих к загрязнениям.
   4. Начинают контролировать сопротивление ячейки каждые 15 мин в течение не менее 100 ч, как описано на этапе 2.10.
   5. После двух циклов измерений (т.е. 30 мин) приостановите работу аппарата, нажав на кнопку «Пауза» во вкладке «Выполнить», и снимите Е-пластину с подставки.
   6. Добавьте 1 мкг/мл TPCK-трипсина в среду распространения вируса для расщепления вирусного гемагглютинина.
   7. Добавьте 100 мкл среды распространения вируса, содержащей TPCK-трипсин, в каждую лунку и вставьте Е-пластину в карман колыбели.
   8. Нажмите «Пуск/Продолжить» на вкладке «Выполнить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте создать отрицательный контроль, соответствующий мок-инфицированным клеткам, заменив вирусную суспензию средами распространения вируса.

4. Кинетика выживания IAV

1. Подвергайте IAV воздействию соленой дистиллированной воды при 35 °C и проверяйте их инфекционность с течением времени, измеряя снижение импеданса клеток.
   1. Приготовьте соленую дистиллированную воду, добавив NaCl к конечной концентрации 35 г/л в дистиллированной воде. Добавьте 900 мкл соленой воды в криотрубки объемом 2 мл.
   2. Добавьте 100 мкл вирусного вещества в соленую воду и поместите криотрубки в инкубатор (35 °C, 5% _CO2) на 1 ч, 24 ч или 48 ч.
   3. Семена 100 мкл (содержащие 3 х ¹⁰⁴) свежерасщепленных клеток MDCK на 16-луночной микротитровой пластине и растут в течение 24 ч при 37 °C и 5% _CO2.
   4. Инфицировать клетки 100 мкл подвергшихся воздействию вирусов (предварительно разбавленных в 10 раз в питательных средах) с использованием метода обратного пипетирования для воспроизводимости путем повторения раздела 3.4.
2. Контролируйте сопротивление ячейки каждые 15 мин в течение не менее 100 ч.

5. Оценка потери инфекционности

1. Определение значений CIT50 для количественной оценки снижения CI из-за вызванных вирусом цитопатических эффектов со значением _CIT50 .
   1. Нажмите «График» и добавьте все образцы, нажав «Добавить все». Экспортируйте результаты в электронную таблицу, нажав «Экспортировать информацию об эксперименте». Рассмотрим начальный CI как значение клеточного импеданса, измеренное через 5 ч после инфицирования клеток облученными вирусами (т.е. через 24 ч после посева клеток MDCK на микротитрную E-пластину).
   2. Рассчитайте значение _CIT50 , соответствующее необходимому времени для измерения снижения на 50% от исходного ДИ. Чтобы рассчитать значение _CIT50 , обратите внимание на значение CI в 5 hpi для каждого образца. Затем найдите точку времени, в которой значение CI равно половине значения CI при 5 hpi, используя функции индекса и сопоставления в электронной таблице.
2. Расчет среднего уклона инактивации
   1. Определите значения _CIT50 для каждой подвергшейся воздействию вирусной суспензии в разное время воздействия (в днях).
   2. Рассчитайте наклон линейной регрессии из построенных значений _CIT50, называемых наклоном инактивации и выраженных в _CIT50.day-1.

Результаты

Исходные данные, полученные через 120 ч при различных концентрациях клеток MDCK, от 15 000 до 120 000 клеток на лунку, показаны на рисунке 1. Через 24 ч измерения CI показывают, что клетки в колодцах, засеянных 30 000 клеток, все еще находились в экспоненциальной фазе роста, и эта концент?...

Обсуждение

RTCA - это технология на основе импеданса, которая все чаще используется для мониторинга свойств клеток в режиме реального времени, таких как клеточная адгезия, пролиферация, миграция и цитотоксичность. В этом исследовании способность этой технологии оценивать выживаемость IAV вне хозяин...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25%Trypsin	ThermoFisher	25200056
75 cm2 tissue culture flask	Falcon	430641U
E-Plate 16 (6 plates)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	E-plates are avalible in different packaging
FCS	Life technologies (gibco)	10270-106
MEM 1X	Life technologies (gibco)	31095029
PBS 1X	Life technologies (gibco)	14040091
Penicillin-Streptomycin	Life technologies (gibco)	11548876
TPCK-Trypsin	Worthington	LS003740
xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate)