Extraction et dissection du cerveau de porc domestiqué

Résumé

Ce protocole détaille la technique d’ablation du cerveau porcin dans son intégralité et la dissection de plusieurs régions du cerveau couramment étudiées en neurosciences.

Résumé

L’utilisation du porc comme modèle animal préclinique et traduisible a été bien documentée et acceptée par les domaines de recherche qui étudient les systèmes cardiovasculaires, les systèmes gastro-intestinaux et la nutrition, et le porc est de plus en plus utilisé comme un grand modèle animal en neurosciences. En outre, le porc est un modèle accepté pour étudier le neurodéveloppement car il affiche des modèles de croissance et de développement du cerveau similaires à ce qui se produit chez l’homme. En tant que modèle animal moins courant en neurosciences, les interventions chirurgicales et dissection sur les porcs peuvent ne pas être aussi familières ou bien pratiquées chez les chercheurs. Par conséquent, un protocole visuel normalisé détaillant des méthodes cohérentes d’extraction et de dissection peut s’avérer utile pour les chercheurs travaillant avec le porc. La vidéo suivante présente une technique pour enlever le cerveau du porc tout en gardant le cortex et le tronc cérébral intacts et passe en revue les méthodes pour disséquer plusieurs régions cérébrales couramment étudiées, y compris le tronc cérébral, le cervelet, le midbrain, l’hippocampe, le striatum, le thalamus et le cortex préfrontal médial. Le but de cette vidéo est de fournir aux chercheurs les outils et les connaissances nécessaires pour effectuer systématiquement une extraction cérébrale et une dissection sur le porc de quatre semaines.

Introduction

Le porc a été bien documenté et accepté comme modèle animal traduisible pour la recherche dans les systèmes^{cardio-vasculaires 1,}les systèmes gastro-intestinaux^2,la nutrition^3,4,le^{diabète 5,}la toxicologie^6,et les techniques^{chirurgicales 7}. L’utilisation du porc en neurosciences commence à augmenter, car PubMed recherche les mots clés « modèle animal du cerveau porcin » se traduire par quatre fois plus de résultats de 1996-2005 que la période précédente de 10 ans⁸, et encore plus de résultats à l’heure actuelle. Une raison principale que la popularité du modèle de porc est en expansion est due à ses similitudes dans la croissance, la structure et la fonction du cerveau par rapport aux humains. Par rapport au cerveau humain, le cerveau du porc présente des motifs gyraux similaires, la vascularisation et la distribution de la matière grise et blanche⁹. En outre, le cerveau de porc a été employé dans les procédures de neuroimagerie, a évoqué l’enregistrement potentiel, et en établissant des techniques de neurochirurgie^8,9. Contrairement à d’autres modèles animaux, cependant, le porc et l’expérience humaine poussées de croissance du cerveau périnatal, par opposition aux poussées de croissance pré- ou post-natal. À la naissance, le cerveau humain et porcin pèse environ 27 et 25 pour cent de leur poids cérébral adulte, respectivement, par rapport au cerveau de rat qui pèse 12 pour cent de son poids cérébral adulte et le cerveau de singe rhésus à 76 pour cent du poids adulte¹⁰.

L’une des raisons pour laquelle le porc n’a été adopté que lentement comme modèle animal pour les neurosciences est que de nombreux chercheurs ne connaissent pas l’animal dans ce contexte. Les chercheurs peuvent ne pas être conscients de ses utilisations potentielles sur le terrain ou ne pas connaître les techniques appropriées requises pour utiliser un tel modèle. Comme l’utilisation du porc comme modèle biomédical et préclinique attire l’attention et l’utilisation en neurosciences, il est nécessaire d’établir des procédures normalisées d’enlèvement des tissus afin d’assurer une comparaison précise des données entre les études. Bien que la dissection et les techniques chirurgicales impliquant le cerveau de porc ont été^{publiées ailleurs 11,12,13}, il est nécessaire de protocoles simples et normalisés pour recueillir les tissus cérébraux des porcs, en particulier pour une utilisation dans les essais biochimiques. En tant que tel, le but de cette vidéo est de fournir les connaissances nécessaires pour permettre aux chercheurs d’effectuer une extraction et une dissection normalisées du cerveau. Cette vidéo illustre une technique appropriée pour enlever le cerveau du porc tout en gardant le cortex et le tronc cérébral intacts, et ensuite examiner les méthodes pour disséquer plusieurs régions clés du cerveau.

Protocole

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de l’Illinois à Urbana-Champaign

NOTE: Avant l’euthanasie, le porc a été anesthésié par injection intramusculaire avec une combinaison de telazol:kétamine:xylazine (50,0 mg de tiletamine HCl plus 50,0 mg de zolazepam HCl reconstitué avec 1 2,50 mL de kétamine HCl (100 g/L) et 2,50 mL de xylazine (100 g/L) et administrés à 0,06 mg/kg BW). Une fois anesthésié, le porc a été euthanasié par administration intracardiaque de pentobarbital de sodium (390 mg/mL administré à 1 mL/5 kg BW). Pour la dissection du cerveau, il est recommandé que la méthode d’euthanasie soit choisie en fonction de la procédure analytique souhaitée du tissu. La méthode d’euthanasie devrait causer le moins de dommages possible au cerveau.

1. Extraction du cerveau de porc

1. Après l’euthanasie sans cruauté, décapiter le porc en coupant au-dessus de la nuque, entre la première et la deuxième vertèbre (atlas et axe, respectivement).
2. Fixez la tête dans un étau de banc immobilisé modifié pour inclure des pointes. Assurez-vous que la tête est complètement immobilisée avant de procéder.
   1. À l’aide d’un scalpel, faire une coupe sagittale le long de la ligne médiane du crâne qui continue à la postérieure de la tête.
   2. Faire une deuxième coupe (transversale) sur le postérieur de la tête.
   3. Faire une troisième coupe (transversale) sur l’extrémité postérieure du museau et en ligne avec les yeux. Coupez la peau aussi loin que possible du crâne pour assurer un accès facile au crâne.
3. À l’aide d’une scie osseuse, faire deux coupes antérieures à postérieures latérales à la ligne médiane, s’étendant des yeux à l’apex de la courbure du crâne. Biseauté la scie vers la ligne médiane et coupé juste assez profond pour pénétrer dans le crâne.
   1. Répétez le processus ci-dessus sur les côtés perpendiculaires, créant une « fenêtre » rectangulaire dans le crâne.
4. À l’aide d’un hameçon à viande, pendez la section rectangulaire du crâne. Commencez par placer le crochet dans l’un des coins de la section et appliquez une pression ascendante pour desserrer la pièce du crâne. Prenez soin de placer le crochet à viande seulement au niveau du crâne pour éviter par inadvertance pénétrer le tissu cérébral.
5. Si des couches méningées restent sur le cerveau, utilisez des forceps et des ciseaux contondants (ou alternativement, un scalpel) pour enlever doucement les couches sans couper dans le cerveau.
6. Utilisez un scalpel pour couper le muscle et la graisse à la partie postérieure de la tête, exposant la partie postérieure du crâne.
   1. Faire deux coupes transversales le long du postérieur du crâne. Assurez-vous de ne pas couper dans les tissus cérébraux.
   2. Fixez la tête en plaçant une main ferme sur le museau et appliquez une pression vers l’arrière pour retirer la partie postérieure du crâne, exposant le cervelet.
7. Retirer la tête du banc vice et placer sur un tapis chirurgical.
8. Utilisez un long outil mince, comme l’extrémité émoussée d’un scalpel, pour enlever le cerveau. Inverser la tête et utiliser un mouvement de scooping doux pour amadouer le cerveau hors de la cavité du crâne sans endommager la surface du cerveau.
   REMARQUE: Il sera nécessaire de couper les nerfs crâniens pour enlever le cerveau. Faites-le doucement et n’essayez pas de tirer le cerveau avec force. Le cerveau tombera tout seul lorsqu’il sera correctement et complètement détaché du crâne et de la colonne vertébrale.

2. Dissection du cerveau de porc

REMARQUE : Il peut être utile d’utiliser un atlas cérébral ou un guide de dissection des fibres¹⁴ comme représentation visuelle pendant les procédures de dissection. Assurez-vous que les échantillons de tissus disséqués sont stockés correctement en fonction des besoins propres au projet lors de l’enlèvement de chaque échantillon (décrit plus en détail ci-dessous). En outre, veuillez noter que pour les besoins de cette vidéo, toutes les régions du cerveau montrées ont été disséquées de l’hémisphère droit, mais cela peut différer par laboratoire en fonction d’objectifs expérimentaux.

1. Pour enlever le tronc cérébral (principalement la médulle), faire une coupe coronale caudale au cervelet.
2. Pour enlever le cervelet, faire une coupe coronale postérieure au cortex. Isoler les régions désirées (p. ex., vermis, flocculus, etc.) du cervelet de cet échantillon. Assurez-vous de ne pas inclure de parties du tronc cérébral dans cet échantillon.
3. Séparez les deux hémisphères du cerveau en faisant une coupe mi-sagittale le long de la fissure longitudinale. Faites cette coupe comme un mouvement continu pour éviter de causer des dommages au cortex.
4. Pour enlever le midbrain, disséquer une quantité désirée de tissu juste ventral au colliculi supérieur et inférieur.
5. Pour enlever l’hippocampe, placez l’extrémité émoussée d’un scalpel dans la partie postérieure du corpus callosum et roulez doucement l’hippocampe, à l’aide d’un mouvement « J » à partir de la partie postérieure du corpus callosum; une corne hippocampe entière est en forme de haricot.
6. Le striatum (noyau caudate est principalement montré) est une région grise et blanche rayée de matière juste en dessous du corpus callosum et antérieure à l’hippocampe. Biseauté le scalpel et enlever cette région, révélant tissu strié lors de l’enlèvement.
7. Pour enlever le cortex préfrontal médial, disséquez le tissu du gyrus frontal au corpus callosum, en enlevant la partie la plus médiale de cette section. Le cortex droit doit rester après l’ablation du cortex préfrontal médial.
8. Pour enlever le thalamus, enlever la structure en forme d’ampoule au centre de la surface médiane du cerveau et rostral au cerveau moyen. Le thalamus a une forme sphérique et aura l’air légèrement plus foncé que le tissu environnant.

3. Post-dissection

1. À la fin de la dissection, conservez correctement les échantillons de tissus pour des analyses ultérieures. L’omission de cette étape entraînera une autolyse et une dégradation significatives en aussi peu que 20 minutes.
2. Laissez chaque région du cerveau intacte au moment de la dissection si des analyses structurelles seront effectuées, ou hachez les tissus pour créer un échantillon homogène de tissu avant la conservation. Les méthodes courantes de conservation des échantillons pour les tissus cérébraux comprennent la cryopréservation et la fixation chimique à l’aide d’agents de liaison^{croisée 15}.
3. Pour les analyses de laboratoire standard (p. ex., expression des gènes ou des protéines), plongez dans de l’azote liquide ou des solutions qui stabilisent le matériel génétique avant le stockage à long terme à -80 °C afin de fournir des méthodes de conservation pratiques et rentables.
4. Si le maintien de la structure tissulaire est une priorité, préservez les tissus cérébraux au moyen de méthodes de fixation traditionnelles (p. ex., utiliser des fixatifs à base d’aldéhyde pour croiser les protéines), soit sans ou avec perfusion de l’animal ou de l’organe d’intérêt avant la dissection tissulaire.

Résultats

Cette section décrit des exemples de résultats obtenus après l’extraction et la dissection correctes d’un cerveau de porc de 4 semaines. La figure 1 décrit la forme de chaque région du cerveau pour être utilisé comme guide pendant la dissection. Une partie du tronc cérébral peut rester dans le crâne après l’ablation du cervelet (Figure 1B). Ceci peut être enlevé tout en isolant la région désirée du cervelet. Le tableau 1 af...

Discussion

Les techniques décrites ci-après ont été conçues pour les porcs âgés d’environ 4 semaines. Il est essentiel d’effectuer ces étapes immédiatement après que le porc a été euthanasié humainement pour s’assurer que l’intégrité de la structure des tissus cérébraux est maintenue, en particulier lors de l’examen des essais biochimiques ultérieurs. Il est utile d’utiliser un atlas ou des guides de dissection^{de fibre 16} lors de l’apprentissage des techniques. Il est recomman...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#22 Scalpel Blades for #4 Handles	Ted Pella, inc.	549-4S-22
11 1/2" Satterlee Bone Saw	Leica Biosystems	38DI13425
5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook)	Leica Biosystems	38DI37636
5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise	Pony	29050
Butcher Knife 25cm	Victorinox	5.7403.25	Sharpen before use
CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps	Bessey	00655BC3120
Diamond Hone Knife Shaper	Chef’s Choice	436-3
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4	ThermoScientific	5334
Tissue Forceps	Henry Schein	101-5132
Vinyl Dissecting pad	Carolina	629006