길들여진 돼지 뇌의 추출 및 해부

요약

이 프로토콜은 일반적으로 신경 과학에서 공부 여러 뇌 영역의 전체 및 해부에 돼지 뇌의 제거를위한 기술을 자세히 설명합니다.

초록

돼지를 전임상 및 전염성 동물 모델로 사용하는 것은 심혈관 시스템, 위장 시스템 및 영양을 조사하는 연구 분야에서 잘 문서화되고 받아들여졌으며 돼지는 점점 더 신경 과학의 큰 동물 모델로 사용되고 있습니다. 또한, 돼지는 인간에서 일어나는 것과 유사한 두뇌 성장 및 발달 패턴을 표시하기 때문에 신경 발달을 공부하는 허용된 모형입니다. 신경 과학에서 덜 일반적인 동물 모델로, 돼지에 외과 및 해부 절차는 연구원 중 친숙 하거나 잘 연습 되지 않을 수 있습니다. 따라서 일관된 추출 및 해부 방법을 자세히 설명하는 표준화된 시각적 프로토콜은 돼지와 함께 일하는 연구자에게 가치가 있음을 증명할 수 있습니다. 다음 비디오는 피질과 뇌간을 그대로 유지하면서 돼지 뇌를 제거하는 기술을 보여주고 뇌간, 소뇌, 중뇌, 해마, 줄무늬, 시상 및 내측 전두엽 피질을 포함하여 여러 일반적으로 조사되는 뇌 영역을 해부하는 방법을 검토합니다. 이 비디오의 목적은 연구원에게 4주 된 돼지의 뇌 추출 및 해부를 일관되게 수행하는 데 필요한 도구와 지식을 제공하는 것입니다.

서문

돼지는 잘 문서화되어 심혈 관계 시스템^1,위장 시스템^2,영양^3,4,당뇨병^5,독성학⁶및 수술 기술^7에서연구를위한 번역 가능한 동물 모델로 받아들여졌습니다. PubMed가 "돼지 뇌 동물 모델"이라는 키워드를 검색하여 1996-2005년 보다 4배 더 많은 결과를 초래함에 따라 신경 과학에서 돼지의 사용이 증가하기^{시작했으며,}현재는 더 많은 결과가 나타나고 있습니다. 돼지 모델의 인기가 확대되는 주된 이유는 인간과 비교할 때 뇌의 성장, 구조 및 기능의 유사성 때문입니다. 인간의 뇌에 비해 돼지 뇌는 회색과 백색 물질의 유사한 자랄 패터닝, 혈관화 및 분포를 나타낸다^9. 더욱이, 돼지 뇌는 신경 이미징 절차에 사용되어, 잠재적인 기록을 불러 일으켰으며, 신경외과 기술^수립8,9. 다른 동물 모델과는 달리, 그러나, 돼지와 인간의 경험 주산기 뇌 성장 분출, 산전 또는 산후 성장 분출 반대로. 출생 시, 인간과 돼지 뇌는 성인 뇌 체중의 약 27%와 25%의 무게를 가지고 있으며, 성인 뇌 체중의 12%와 성인 체중^10%의rhesus 원숭이 뇌의 무게가 있는 쥐 뇌에 비해 각각 무게를 측정합니다.

돼지가 신경 과학을 위한 동물 모형으로 서게 채택된 한 가지 이유는 많은 연구원이 이 맥락에서 동물에 익숙하지 하기 때문입니다. 연구원은 필드에 있는 그것의 잠재적인 사용을 인식하지 않을 수 있습니다 또는 그 같은 모형을 사용하는 데 필요한 적당한 기술을 모르는 수 있습니다. 생물 의학 및 전임상 모델로 돼지를 사용하면 신경 과학에 대한 관심과 사용이 증가함에 따라 연구 전반에 걸친 데이터의 정확한 비교를 보장하기 위해 조직 제거의 표준화 된 절차를 수립해야합니다. 돼지 뇌와 관련된 해부 및 외과 기술은 다른 곳에서 출판되었지만^11,12,13,돼지 뇌 조직을 수집하는 간단하고 표준화 된 프로토콜에 대한 필요성이있다, 특히 생화학 적 분석에 사용하기 위해. 따라서 이 비디오의 목적은 연구원이 표준화된 뇌 추출 및 해부를 수행할 수 있도록 하는 데 필요한 지식을 제공하는 것입니다. 이 비디오는 피질과 뇌간을 그대로 유지하면서 돼지 뇌를 제거하는 하나의 적절한 기술을 설명하고, 그 후 여러 주요 뇌 영역을 해부하는 방법을 검토합니다.

프로토콜

어바나 샴페인 일리노이 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 동물 과목과 관련된 절차가 승인되었습니다.

참고 : 안락사 전에, 돼지는 텔라졸 : 케타민 : 자일라진의 조합과 근육 주사를 통해 마취되었다 (50.0 타일 타민 HCl 플러스 졸라제팜 H의 50.0 mg Cl은 케타민 HCl (100 g/L)의 2.50 mL및 자일라진 (100 g /L)의 2.50 mL로 재구성하고 0.06 mg / kg BW로 투여됩니다. 일단 마취되면, 돼지는 나트륨 pentobarbital의 심내 투여를 통해 안락사되었다 (390 mg / mL에서 투여 1 mL/ 5 kg BW). 뇌 해부에 대 한, 안락사의 방법은 조직의 원하는 분석 절차에 따라 선택 하는 것이 좋습니다. 안락사의 방법은 가능한 한 뇌에 작은 손상을 야기한다.

1. 돼지 뇌의 추출

1. 인도적 안락사에 따라, 목의 목덜미 위에 절단하여 돼지를 참수, 첫 번째와 두 번째 척추 사이 (아틀라스와 축, 각각).
2. 스파이크를 포함하도록 수정된 고정된 벤치 바이스로 머리를 고정합니다. 진행 하기 전에 머리가 완전히 고정 되어 있는지 확인 합니다.
   1. 메스를 사용하여 두개골의 중간선을 따라 처질절단을 하여 머리 뒤쪽으로 계속 자른다.
   2. 머리 뒤쪽에서 두 번째(횡방향)를 잘라내십시오.
   3. 주둥이의 후방 끝에 세 번째(횡방향)를 자르고 눈과 함께 합니다. 두개골에 쉽게 접근할 수 있도록 가능한 한 멀리 두개골에서 피부를 잘라냅니다.
3. 뼈 톱을 사용하여, 두 개의 전방 후방 컷중간으로 잘라, 두개골 곡률의 정점에 눈에서 확장. 톱을 미드라인쪽으로 베벨을 하고 두개골을 관통할 수 있을 만큼 깊이 잘라냅니다.
   1. 수직 측면에 위의 프로세스를 반복하여 두개골에 직사각형 "창"을 만듭니다.
4. 고기 갈고리를 사용하여 두개골의 직사각형 부분을 벗겨내시다. 먼저 후크를 섹션의 모서리 중 하나에 넣고 위쪽으로 압력을 가하여 두개골 조각을 풀어줍니다. 실수로 뇌 조직을 관통하는 것을 방지하기 위해 두개골의 수준에 만 고기 후크를 배치하는 주의하십시오.
5. 뇌에 수막 층이 남아 있는 경우, 집게와 무딘 가위(또는 메스)를 사용하여 뇌로 절단하지 않고 층을 부드럽게 제거하십시오.
6. 메스를 사용하여 머리의 뒤쪽 부분에서 근육과 지방을 잘라 두개골의 후위 부분을 노출시하십시오.
   1. 두개골 의 후방을 따라 두 개의 횡방향 컷을 확인합니다. 뇌 조직으로 잘라하지 않도록해야합니다.
   2. 주전자에 단단한 손을 얹고 뒤로 압력을 가하여 두개골의 후방 부분을 당겨 소뇌를 노출시켜 머리를 고정하십시오.
7. 벤치 부사장에서 머리를 제거하고 수술 매트에 배치합니다.
8. 메스의 무딘 끝과 같은 긴 날씬한 도구를 사용하여 뇌를 제거하십시오. 머리를 반전하고 뇌의 표면을 손상시키지 않고 두개골 구멍에서 뇌를 동축부드러운 스쿱 모션을 사용합니다.
   참고 : 뇌를 제거하기 위해 두개골 신경을 끊어야합니다. 부드럽게 그렇게하고 강제로 뇌를 당겨하려고하지 않습니다. 뇌가 두개골과 척추에서 제대로 완전히 분리되면 스스로 떨어질 것입니다.

2. 돼지 뇌의 해부

참고: 해부 시 뇌 아틀라스 또는 섬유 해부^{가이드(14)를} 시각적 표현으로 사용하는 것이 유용할 수 있습니다. 해부된 조직 샘플은 각 샘플을 제거할 때 프로젝트별 필요에 따라 제대로 저장되는지 확인하십시오(아래 자세히 설명됨). 또한,이 비디오의 목적을 위해, 표시된 모든 뇌 영역은 오른쪽 반구에서 해부되었다, 그러나 이것은 실험 목표에 따라 실험실마다 다를 수 있습니다.

1. 뇌간 (주로 수질)을 제거하려면 소뇌에 관상 절단 된 코달을 만듭니다.
2. 소뇌를 제거하려면 피질에 관상 절단 후방을 만듭니다. 이 샘플에서 소뇌의 원하는 영역(예: vermis, flocculus 등)을 분리합니다. 이 샘플에 뇌 줄기의 어떤 부분을 포함 하지 않도록 해야 합니다.
3. 세로 균열을 따라 중간 처검 컷을 만들어 뇌의 두 반구를 분리합니다. 피질에 손상을 일으키는 것을 방지하기 위해 연속 동작으로이 절단을합니다.
4. 중뇌를 제거하려면 원하는 양의 조직을 우수하고 열등한 콜리큘리에 해부하십시오.
5. 해마를 제거하기 위해, 코퍼스 캘로섬의 후부에 메스의 무딘 끝을 놓고 부드럽게 해마를 굴려, 코퍼스 캘로섬의 후방 부분에서 시작하는 "J"모션을 사용하여; 전체 해마 뿔은 '콩 모양'입니다.
6. striatum (caudate 핵은 주로 표시됩니다)는 해마에 코퍼스 캘로섬과 전방 바로 아래 회색과 흰색 물질 줄무늬 영역입니다. 메스를 베벨과 제거시 수축 된 조직을 드러내며이 부위를 제거하십시오.
7. 내측 전두엽 피질을 제거하려면 전두엽 자이루스에서 코퍼스 캘로섬으로 조직을 해부하여 해당 섹션의 가장 내측 부분을 제거합니다. 오른쪽 피질은 내측 전두엽 피질을 제거 한 후에도 남아 있어야합니다.
8. 시동을 제거하려면 뇌의 중증 표면의 중앙에 전구와 같은 구조를 제거하고 중뇌로 장밋빛으로 제거하십시오. 시상은 구형 모양을 가지고 있으며 주변 조직보다 약간 어둡게 보입니다.

3. 해부 후

1. 해부가 완료되면 후속 분석을 위해 조직 샘플을 적절하게 보존하십시오. 이 단계를 생략하면 20분 이내에 상당한 자동 분해와 저하가 발생합니다.
2. 구조 분석이 수행될 경우 해부 시에 각 뇌 영역을 그대로 두거나 보존 전에 균질성 조직 샘플을 만들기 위해 조직을 다진다. 뇌 조직을 위한 일반적인 견본 보존 방법은 교차 연결 에이전트를 사용하여 냉동 보존 및 화학 고정을 포함합니다⁽¹⁵⁾.
3. 표준 실험실 연구제(예를 들어, 유전자 또는 단백질 발현)의 경우-80°C에서 장기 저장하기 전에 유전 물질을 안정화시키는 액체 질소 또는 용액에 몰입하여 편리하고 비용 효율적인 보존 방법을 제공합니다.
4. 조직 구조를 유지하는 것이 우선 순위인 경우, 전통적인 고정 방법(예: 알데히드 기반 고정제를 사용하여 단백질을 교차링크하는) 조직 해부 이전에 동물 또는 관심 기관의 관류없이 또는 관류로 뇌 조직을 보존하십시오.

결과

이 섹션에서는 4주 된 돼지 뇌의 정확한 추출 및 해부 후 얻은 결과의 예를 설명합니다. 그림 1은 해부 동안 가이드로 사용하기 위해 각 뇌 영역의 모양을 간략하게 설명합니다. 뇌의 일부는 소뇌의 제거 후 두개골에 남아있을 수 있습니다(도 1B). 이것은 소뇌의 원하는 영역을 격리하는 동안 제거 될 수있다. 표 1은 해부된 각 뇌 영역(n=5)에 ?...

토론

본 명세서에 기술된 기술은 약 4주 의 돼지를 위해 디자인되었다. 돼지가 뇌 조직 구조의 무결성을 유지하기 위해 인도적으로 안락사 된 직후이러한 단계를 수행하는 것이 중요합니다, 특히 후속 생화학 적 분석을 고려할 때. 처음 기술을 배울 때 아틀라스 또는 섬유¹⁶ 해부 가이드를 사용하는 것이 도움이됩니다. 실험자는 데이터 수집을 위한 샘플을 얻기 전에 여러 뇌 추출 및 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#22 Scalpel Blades for #4 Handles	Ted Pella, inc.	549-4S-22
11 1/2" Satterlee Bone Saw	Leica Biosystems	38DI13425
5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook)	Leica Biosystems	38DI37636
5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise	Pony	29050
Butcher Knife 25cm	Victorinox	5.7403.25	Sharpen before use
CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps	Bessey	00655BC3120
Diamond Hone Knife Shaper	Chef’s Choice	436-3
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4	ThermoScientific	5334
Tissue Forceps	Henry Schein	101-5132
Vinyl Dissecting pad	Carolina	629006