Techniques moléculaires et immunologiques dans un modèle murin génétiquement modifié de tumeur stromale gastro-intestinale

Résumé

L’objectif de ce manuscrit est de décrire le modèle de souris Kit^V558Δ/+ et les techniques de dissection et de traitement réussis des spécimens de souris.

Résumé

La tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) est le sarcome humain le plus courant et est généralement entraînée par une seule mutation du récepteur KIT. Parmi les types de tumeurs, de nombreux modèles murins ont été développés afin d’étudier la prochaine génération de thérapies contre le cancer. Cependant, dans GIST, la plupart des études in vivo utilisent des modèles murins de xénogreffe qui ont des limites inhérentes. Ici, nous décrivons un modèle murin immunocompétent et génétiquement modifié de tumeur stromale gastro-intestinale hébergeant une mutation Kit^{V558Δ /} +. Dans ce modèle, le KIT mutant, l’oncogène responsable de la plupart des TIST, est entraîné par son promoteur endogène conduisant à un GIST qui imite l’apparence histologique et l’infiltrat immunitaire observés dans les GIST humains. En outre, ce modèle a été utilisé avec succès pour étudier à la fois des thérapies moléculaires et immunitaires ciblées. Nous décrivons ici l’élevage et l’entretien d’une colonie de souris Kit^V558Δ/+ . De plus, cet article détaille le traitement et l’approvisionnement du GIST, du ganglion lymphatique mésentérique drainant et du caecum adjacent chez les souris kit^V558Δ/+ , ainsi que la préparation des échantillons pour les analyses moléculaires et immunologiques.

Introduction

GIST est le sarcome le plus fréquent chez l’homme avec une incidence d’environ 6 000 cas aux États-Unis d’Amérique¹. GIST semble provenir des cellules du stimulateur cardiaque gastro-intestinal appelées cellules interstitielles de Cajal, et est généralement entraîné par une seule mutation dans la tyrosine kinase KIT ou PDGFRA². La chirurgie est le pilier du traitement de la GIST et peut être curative, mais les patients atteints d’une maladie avancée peuvent être traités avec l’inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK), l’imatinib. Depuis son introduction il y a plus de 20 ans, l’imatinib a transformé le paradigme de traitement dans GIST, améliorant la survie dans les maladies avancées de 1 à plus de 5 ans ^3,4,5. Malheureusement, l’imatinib est rarement curatif en raison de mutations KIT acquises, de sorte que de nouveaux traitements sont nécessaires pour cette tumeur.

Les modèles murins sont un outil de recherche important dans la recherche de nouvelles thérapies contre le cancer. Plusieurs modèles de xénogreffe sous-cutanée et de xénogreffe dérivés du patient ont été développés et étudiés dans GIST ^6,7. Cependant, les souris immunodéficientes ne représentent pas entièrement les GIST humains, car les TIST présentent des profils immunitaires différentiels en fonction de leur mutation oncogène, et la modification du microenvironnement tumoral gastro-intestinal améliore les effets du traitement par TKI ^8,9. La souris Kit^V558Δ/+ a une délétion germinale hétérozygote dans l’exon 11 du Kit, qui code le domaine juxtamembranaire, le site le plus fréquemment muté dans le GIST¹⁰ humain. Les souris Kit^{V558Δ / +} développent un seul GIST cæcal avec une pénétrance de 100%, et les tumeurs ont une histologie, une signalisation moléculaire, une infiltration immunitaire et une réponse au traitement similaires à celles de la GIST^humaine 8,11,12,13. Ici, nous décrivons la sélection, le traitement et l’isolement et le traitement des échantillons chez des souris Kit^{V558Δ / +} pour une utilisation dans la recherche moléculaire et immunologique dans GIST.

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Protocole

Toutes les souris ont été hébergées dans des conditions exemptes d’agents pathogènes à l’Université de Pennsylvanie conformément aux directives des NIH et avec l’approbation de l’IACUC de l’Université de Pennsylvanie. L’euthanasie a été effectuée conformément aux procédures opérationnelles normalisées des ressources pour animaux de laboratoire de l’Université de Pennsylvanie.

1. Kit^V558Δ/+ élevage de souris

1. Rétrocroisez les souris Kit^V558Δ/+ plus de 10 fois sur un fond C57BL/6J à l’aide de souris C57BL/6J. Pour ce faire, élevez les souris mâles Kit^V558Δ/+ avec des souris femelles C57BL/6J dans un rapport de 1:2.
   REMARQUE: Le génotype homozygote Kit^{V558Δ / V558Δ} est létal in utero. Il est possible d’élever des souris femelles Kit^{V558Δ/+ avec des} souris mâles C57BL/6J, mais la taille de la portée est environ la moitié de celle observée chez les souris femelles de type sauvage C57BL/6J. De plus, les souris femelles Kit^V558Δ/+ produisent des portées limitées après l’âge de 4 mois.
2. Génotype des chiots à l’âge de 7 à 14 jours par écrêtage des orteils pour confirmer la présence du génotype Kit^V558Δ/ +. Utilisez l’amorce avant : TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; rapporteur 1 : CCTCGACAACCTTCCA; amorce inverse: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; et rapporteur 2 : TCTCCTCGACCTTCCA pour le génotypage.

2. Kit^V558Δ/+ traitement de la souris

1. L’âge et le sexe correspondent aux souris Kit^V558Δ/+ avant le traitement. Utilisez les souris appariées selon l’âge et le sexe dans les cohortes, car les tumeurs des souris femelles Kit^{V558Δ / +} sont plus grandes que celles des souris mâles. Traitez les souris âgées de 8 à 12 semaines, moment auquel les tumeurs sont établies (Figure 1).
2. Administrer des inhibiteurs de la tyrosine kinase par voie orale ou par injection intrapéritonéale (i.p.); Les tumeurs du Kit^V558Δ/+ sont sensibles aux inhibiteurs de la tyrosine kinase. Fournir de l’imatinib à une dose de 600 mg/L dans l’eau potable ou des injections intra-atmosphériques de 45 mg/kg deux fois par jour. Mesurer la réduction du poids de la tumeur à l’aide de balances numériques après dissection de la tumeur, comme indiqué à l’étape 3, qui est d’environ 50% à 1 semaine et de 80% à 4 semaines après le traitement par l’imatinib (Figure 2).

3. Kit^V558Δ/+ prélèvement d’organes de souris

1. Euthanasier les souris par narcose au CO₂ à un débit de 60% de volume de chambre par min. Laissez les souris dans la chambre pendant au moins 2 minutes après l’arrêt de la respiration, puis effectuez une luxation cervicale pour confirmer la mort.
2. Stérilisez tous les instruments, portez des gants tout au long de la procédure et maintenez un champ stérile. Préparez la peau avec de l’éthanol à 70%. Faites une incision verticale médiane de 2 cm à l’aide de ciseaux et entrez dans la cavité abdominale. Lyser brusquement toutes les adhérences intra-abdominales.
3. Pour enlever le ganglion lymphatique mésentérique drainant, suivez les étapes décrites ci-dessous.
   1. Identifiez le caecum et soulevez son mésentère de manière supérieure. Environ à mi-chemin de la base du mésentère du côlon, identifiez le ganglion lymphatique mésentérique et disséquez-le brusquement. Le ganglion lymphatique est blanc cassé et mesure environ 0,5 cm x 0,5 cm.
   2. Divisez le tissu ganglionnaire en tiers pour l’isolement des protéines, l’histologie et la suspension unicellulaire, au besoin. Pour les suspensions unicellulaires, placer le tissu ganglionnaire lymphatique dans 20 mL de milieu libre sérique (RPMI) et le garder sur la glace.
4. Pour isoler le GIST et le caecum, suivez les étapes décrites ci-dessous.
   1. Le caecum des souris Kit^V558Δ/+ est principalement remplacé par un GIST. Divisez soigneusement la jonction iléocolique de la base de la tumeur. Pour recueillir le caecum, divisez à nouveau le côlon, à 2 cm proximal de la base de la tumeur.
   2. Chez 50% à 60% des souris Kit^{V558Δ / +} , la tête de la tumeur contient un capuchon de tissu cæcal, qui contient généralement du liquide séreux mais peut rarement contenir du pus (Figure 3). Disséquez brusquement le tissu de la calotte loin du tissu tumoral.
   3. Divisez le tissu tumoral et / ou le caecum en tiers pour l’isolement des protéines, l’histologie et la suspension unicellulaire, au besoin. Pour les suspensions unicellulaires, placez le tissu tumoral ou le caecum dans HBSS avec 2% de FCS, assez pour couvrir l’échantillon et le garder sur la glace.

4. Analyse par transfert Western du tissu GIST

1. Préparer un tampon de lyse tissulaire contenant 50 mM de TrisHCl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 5 mM d’EDTA, 1 % de détergent non dénaturant, 2 mM Na₃VO₄, 1 mM pmSF, 10 mM NaF et 20 μl/ml de mélange inhibiteur de protéinase.
2. Préparez une solution saline tamponnée 1x Tris avec 1% Tween 20 (TBST) en combinant 1800 mL d’eau désionisée, 2 mL de Tween 20 et 200 mL de solution saline tamponnée Tris (TBS).
3. Remettre en suspension le tissu de l’étape 3.4.3 dans un tube FACS dans 5 mL/g de tampon de lyse tissulaire et homogénéiser deux fois avec un homogénéisateur mécanique à 15 000 tr/min pendant 15 s sur glace. Incuber lysat pendant 30 min sur glace.
4. Transférer le lysat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Centrifuger à vitesse maximale pendant 20 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation.
5. Exécuter les lysats sur un gel gradient de 4% à 15%, puis transférer sur une membrane de nitrocellulose, comme décrit au^{point 14}.
6. Lavez la membrane une fois dans 1x TBS pendant 5 min, puis bloquez la membrane dans du lait à 5% pendant 1 h. Encore une fois, lavez la membrane une fois dans 1x TBS pendant 10 min.
7. Incuber la membrane dans un anticorps primaire dilué à 1:1000 dans 5% de BSA à 4 °C pendant la nuit. Laver la membrane 3x en 1x TBST pendant 10 min chacun. Éponger avec un anticorps secondaire dilué à 1:2500 dans du lait à 2,5% pendant 1 h à température ambiante.
8. Laver la membrane une fois dans 1x TBS pendant 5 min. Ajoutez suffisamment de substrat HRP pour couvrir la membrane, généralement de 200 à 500 μL, et utilisez un imageur numérique pour détecter et quantifier la chimiluminescence.

5. Immunohistochimie du tissu GIST

1. Fixer les tissus de l’étape 3.3.2 ou 3.4.3 dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit. Conservez les tissus dans 70 % d’EtOH jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour le traitement. Incorporer et découper des blocs d’une épaisseur de 5 μm sur des lames de verre, comme décrit^15,16.
2. Détection immunohistochimique complète à l’aide d’un kit d’immunodétection de base, comme décrit précédemment¹⁷.

6. Suspension unicellulaire du ganglion lymphatique mésentérique

1. Versez le milieu RPMI avec un échantillon de ganglions lymphatiques de l’étape 3.3.2 sur un filtre de 100 μm. Déplacez le filtre vers un nouveau ganglion lymphatique conique et écrasez-le de 50 mL avec l’extrémité souple d’une seringue en plastique de 3 mL. Filtre de lavage avec 20 mL de média RPMI.
2. Centrifuger le filtrat à 450 x g à 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
3. Remettre en suspension la pastille dans 20 mL de 1 % de FBS dans du PBS (tampon de billes) et verser sur un filtre de 40 μm. Recueillir le filtrat cellulaire. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
4. Centrifuger le filtrat à 450 x g à 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans un tampon de billes à 6 x 10⁷ cellules/mL pour la cytométrie en flux.

7. Suspension à cellule unique du GIST

1. Préparer un tampon de collagénase en ajoutant 250 mg de collagénase IV, un comprimé d’inhibiteur de la protéase sans EDTA et 100 μL de DNase I à 50 mL de HBSS. Faire pivoter pendant 10 min à température ambiante jusqu’à dissolution.
2. Placez GIST dans un plat stérile et ajoutez 2,5 mL de tampon de collagénase. Mince tumeur en utilisant un scalpel stérile et des ciseaux jusqu’à ce que la tumeur soit en fragments fins. Utilisez une pipette à gros alésage pour aspirer la tumeur et la collagénase dans un tube de 50 mL.
3. Incuber dans un incubateur à agitation à 100 tr/min à 37 °C pendant 30 min. Réaction de trempe avec 2 mL de FBS.
4. Versez la collagénase avec un échantillon GIST sur un filtre de 100 μm et écrasez la tumeur avec l’extrémité molle d’une seringue en plastique de 3 mL et collectez dans un tube de 50 mL. Filtre de lavage avec 20 mL de HBSS. Centrifuger le filtrat à 450 x g, 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
5. Remettre la pastille dans 20 mL de tampon de billes et verser sur un filtre de 40 μm. Prélever le filtrat et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifuger le filtrat à 450 x g, 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans un tampon de billes à 6 x 10⁷ cellules/mL pour la cytométrie en flux.

8. Suspension unicellulaire de caecum

1. Préparer le tampon de collagénase comme à l’étape 7.1. À l’aide de ciseaux, fendez le caecum longitudinalement pour exposer la muqueuse interne. Couper en sections de 0,5 cm et placer dans un tube de 50 mL avec 5 mL de HBSS avec 2% de FBS. Agiter vigoureusement pendant 30 s, centrifuger à 450 x g pendant 20 s, puis aspirer le surnageant.
2. Ajouter 5 mL de HBSS avec 2 mM d’EDTA. Incuber dans un incubateur à agitation à 37 °C à 100 tr/min pendant 15 min. Centrifuger à 450 x g pendant 20 s. Aspirer le surnageant.
3. Ajouter 5 mL de HBSS. Agiter vigoureusement pendant 30 s, centrifuger à 450 x g pendant 20 s, puis aspirer le surnageant. Répétez une fois de plus.
4. Ajouter 5 mL de tampon de collagénase. Incuber dans un incubateur à agitation à 37 °C pendant 30 min à 100 tr/min. Agiter vigoureusement toutes les 10 minutes. Réaction de trempe avec 2 mL de FBS.
5. Versez la collagénase avec un échantillon de caecum sur un filtre de 100 μm et écrasez-la avec l’extrémité souple d’une seringue en plastique de 3 mL. Filtre de lavage avec 20 mL de HBSS. Collecter le filtrat.
6. Centrifuger le filtrat à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension la pastille dans 20 mL de tampon de billes et verser sur un filtre de 40 μm. Recueillir le filtrat et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
7. Centrifuger le filtrat à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans un tampon de billes à 6 x 10⁷ cellules/mL pour la cytométrie en flux.

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Résultats

Le modèle ^{murin Kit V558Δ/+} permet d’étudier des traitements dans un modèle murin immunocompétent. Les souris kit^V558Δ/+ ont une durée de vie moyenne de 8 mois en raison d’une occlusion intestinale progressive (Figure 4). Les tumeurs des souris Kit^V558Δ/+ expriment des marqueurs canoniques de GIST, y compris la tyrosine kinase KIT et le canal transmembranaire DOG1 (

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Discussion

Le modèle ^{murin Kit V558Δ/+} est un puissant outil de recherche dans l’analyse moléculaire et immunologique du GIST. Bien que la stratégie de sélection nécessite un seul croisement, l’utilisation de cohortes de souris Kit^{V558Δ / +} dans des expériences analysant la réponse tumorale nécessite une reproduction approfondie. Les souris doivent être appariées selon l’âge et le sexe pour assurer des poids tumoraux similaires, et 10% des souris meurent avant l’âge de 8...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 micron filter	EMSCO	1194-2360
1x RBC lysis buffer	Life Technologies	00-4333-57
3mL syringe	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl	Bio-Rad	4561083
4% Paraformaldehyde Solution	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
40 micron filter	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
70 micron filter	EMSCO	1194-2350
AKT antibody (C67E7)	Cell Signaling	4691
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory
Collagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
Complete mini edta free protease inhibitor	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific
Disposable Scalpels	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 antibody	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
FIJI software	FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Homogenizer	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	University of Pennsylvania Cell Center
Imatinib mesylate	Selleck Chemicals	S1026
KIT antibody (D13A2)	Cell Signaling	3074
KitV558Δ/+ Genotyping	Transnetyx
Microcentrifuge tubes (1.5mL)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm	Rio-Rad	1620145
Nonfat Dry Milk	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
p-AKT antibody (S473)	Cell Signaling	4060
p-ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9101
p-KIT antibody (Y719)	Cell Signaling	3391
PMSF Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	University of Pennsylvania Cell Center
Sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	201154
Sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	University of Pennsylvania Cell Center
Tissue culture dish (100mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
vivaCT 80 platform	Scanco medical