Détermination in vitro de la dissolution de composants multi-index en médecine tibétaine Granules de rhodiola

Résumé

Ici, nous testons la dissolution des granules de Rhodiola (RG) in vitro, traçons des courbes de dissolution du salidroside, de l’acide gallique et du gallate d’éthyle dans de l’eau ultrapure, et ajustons les courbes à différents modèles mathématiques. Ce protocole fournit des informations et des conseils pour les études de bioéquivalence in vivo et de corrélation in vivo-in vitro de RG.

Résumé

La composition des granules de rhodiola (RG) de la médecine tibétaine est complexe et la qualité globale du RG est difficile à déterminer. Par conséquent, l’établissement d’une méthode pour déterminer la dissolution in vitro multicomposant du RG est d’une grande importance pour le contrôle de la qualité. Cette étude utilise la deuxième méthode de pagaie de la quatrième règle générale 0931 de la pharmacopée chinoise (édition 2020), conforme à l’appareil 2 de la pharmacopée des États-Unis (USP). L’appareil de dissolution a été réglé sur une vitesse de rotation de 100 tr/min avec de l’eau ultrapure comme milieu de dissolution. Un volume d’échantillon de 1 mL a été prélevé à chaque point temporel. De plus, la dissolution cumulative de l’acide gallique, du salidroside et de l’acide éthylgallique dans le RG à différents moments a été déterminée par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Enfin, les courbes de dissolution ont été dessinées et les courbes ont été ajustées aux équations de GompertzMod, de Gompertz, de logistique et de Weibull. Les résultats ont montré que la dissolution cumulative de l’acide gallique dans RG était supérieure à 80% à 1 min, la dissolution cumulative du salidroside et de l’acide éthylgallique était supérieure à 65% à 5 min, et la dissolution cumulative de chaque composant de l’indice diminuait après 30 min. L’ajustement de la courbe a démontré que l’équation de GompertzMod était le modèle le mieux ajusté pour chaque composante d’indice de RG. En conclusion, la méthode d’essai de dissolution décrite dans ce protocole est simple, précise et fiable. Il peut caractériser le comportement de dissolution des composants de l’indice dans RG in vitro, ce qui fournit une référence méthodologique pour le contrôle de la qualité du RG et l’évaluation de la qualité d’autres composés ethniques.

Introduction

En Chine, la prévalence des maladies cardiovasculaires continue d’augmenter et les taux de morbidité et de mortalité des maladies cardiovasculaires occupent la première place parmi les résidents chinois¹. L’angine de poitrine de la maladie coronarienne est causée par une sténose luminale due à l’athérosclérose coronarienne, ce qui entraîne un apport sanguin coronaire relativement insuffisant et une ischémie myocardique et une hypoxie². Ces dernières années, l’effet curatif de la médecine traditionnelle chinoise dans le traitement des maladies coronariennes a été reconnu par de nombreux médecins³.

La médecine traditionnelle chinoise joue un rôle important dans le soulagement des symptômes cliniques et l’amélioration de la qualité de vie des patients⁴. Les granules de Rhodiola (RG) sont extraits et raffinés de la plante médicinale du plateau tibétain Rhodiola rosea L. Les principaux composants de RG sont le salidroside, la rhodiosine et les flavonoïdes ^5,6. RG a pour effet de compléter le Qi⁷ et d’activer et de favoriser la circulation sanguine pour soulager la douleur. Cliniquement, il est utilisé pour traiter les obstructions thoraciques causées par une carence en Qi et une stase sanguine, une maladie coronarienne, une angine de poitrine⁸. La détermination du contenu ne reflète pas entièrement la qualité intrinsèque des médicaments, car la désintégration et la dissolution in vitro peuvent affecter la biodisponibilité et l’efficacité des médicaments ^9,10. Les méthodes d’inspection pour la dissolution de la médecine chinoise comprennent la méthode du panier rotatif, la méthode de la pagaie et la méthode de la petite tasse. L’inconvénient de la méthode du panier rotatif est que seule la partie extérieure du panier rotatif entre en contact avec le milieu de dissolution pendant la rotation, ce qui ne reflète pas le comportement de dissolution réel. La méthode de la pagaie peut surmonter la lacune ci-dessus, ce qui la rend plus appropriée que la méthode du panier pour certaines préparations de médecine chinoise solides¹¹. À l’heure actuelle, il n’existe aucun rapport sur l’analyse de dissolution in vitro du RG. Afin de contrôler la qualité du RG de manière plus complète, le comportement de dissolution des trois composants de l’indice (acide gallique, salidroside et gallate d’éthyle) dans le RG a été étudié. Cette étude fournit des données pour le contrôle de la qualité du RG et une référence méthodologique pour l’évaluation de la qualité d’autres préparations de composés ethniques.

Protocole

1. Préparation de la solution

1. Préparer la solution mère de la substance de référence : Peser 10,6 mg de salidroside, 5,24 mg d’acide gallique et 5,21 mg d’acide éthylgallique séparément sur une balance d’analyse électronique et les ajouter individuellement dans une fiole jaugée de 5 mL. Ensuite, ajouter du méthanol de qualité CLHP pour le dissoudre et le diluer à 5 mL. Enfin, bien agiter pour obtenir la solution mère de la substance de référence avec des concentrations massiques de 2,120 mg/mL, 1,048 mg/mL et 1,042 mg/mL, respectivement.
   NOTA : La solution mère de la substance de référence contient 2,120 mg/mL de salidroside, 1,048 mg/mL d’acide gallique et 1,042 mg/mL de gallate d’éthyle comme solution mère de chaque solution de la courbe étalon suivante.
2. Préparer la solution de l’échantillon d’essai. Extraire 2,8 g de RG (Table of Materials) avec 10 mL de méthanol de qualité CLHP à l’aide d’une machine de nettoyage à ultrasons (Puissance : 200 W, fréquence : 40 kHz) pendant 30 min, puis filtrer avec un filtre de 0,22 μm pour le test d’adaptabilité du système.
3. Préparer une solution de référence mélangée contenant 0,590 mg/mL de salidroside, 2,030 mg/mL d’acide gallique et 1,930 mg/mL de gallate d’éthyle.
   NOTE: Chaque étalon (2,950 mg de salidroside, 10,150 mg d’acide gallique et 9,650 mg d’acide éthyl-gallique) est dissous dans une fiole jaugée de 5 mL dans du méthanol de qualité CLHP comme milieu de dissolution.
4. Obtenir le contenu théorique de chaque composant caractéristique du RG pour l’extraction d’eau ultrapure.
   1. Placer 2,8 g de RG dans une fiole conique de 500 mL, ajouter 200 mL d’eau ultrapure et extraire par ultrasons (Puissance : 200 W, fréquence : 40 kHz) pendant 60 min. Ensuite, filtrez-le avec un filtre de 0,22 μm.
   2. Déterminer le contenu de la solution d’essai selon l’équation linéaire obtenue dans l’expérience suivante.

2. Condition chromatographique

1. Réglez les conditions chromatographiques comme indiqué dans le tableau 1 pour la chromatographie liquide à haute performance. Pour plus de détails sur l’instrument utilisé, reportez-vous au Tableau des matériaux.

3. Test d’adaptabilité du système

1. Étudiez la relation linéaire.
   1. Diluer les solutions mères de référence d’acide gallique et de gallate d’éthyle de 5, 10, 25, 50 et 125 fois, et les solutions mères de référence de salidroside de 2, 4, 8, 16 et 32 fois pour obtenir la solution de concentration de gradient permettant de tracer une courbe étalon.
      NOTA: Ajuster le taux de dilution de la courbe étalon en fonction de l’expérience préliminaire du traitement de l’échantillon. Dans l’expérience préliminaire, les solutions mères des trois étalons ont d’abord été diluées 5, 10, 25, 50 et 125 fois, puis la première courbe étalon a été tracée. Cependant, lorsque la concentration de l’échantillon d’essai a été détectée, il a été constaté que les concentrations de salidroside ne se situaient pas dans la plage linéaire de cette courbe standard et, par conséquent, les concentrations ont été ajustées pour les inclure dans la courbe. En résumé, les expériences préliminaires ci-dessus ont été utilisées pour déterminer les concentrations de dilution finales des trois échantillons d’essai pour les études expérimentales ultérieures.
2. Test de précision: Injecter 10 μL de la solution de référence mélangée dans le système CLHP six fois par jour et exécuter les échantillons avec les mêmes conditions CLHP décrites à l’étape 2.1. Enregistrez la zone de pointe de chaque composant d’entité.
3. Expériences d’essai de stabilité: Injecter 10 μL de la solution échantillon préparée et déterminer les zones de pics de la CLHP en fonction des conditions chromatographiques après 0 h, 6 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h et 24 h, respectivement.
   NOTE: Les zones de pic sont enregistrées automatiquement par le système HPLC.
4. Test de reproductibilité: Prélever six échantillons du même lot de RG pour préparer la solution de l’échantillon d’essai selon la méthode décrite à l’étape 1.2. Injecter 10 μL de chaque échantillon dans le système HPLC. Exécutez les exemples comme décrit à l’étape 2.1 et déterminez la reproductibilité.
   REMARQUE : La répétabilité a été évaluée en comparant les différences de concentration entre les six échantillons.
5. Expérience de récupération
   1. Préparer six portions du même lot de RG pour la solution d’essai. Ensuite, ajouter environ 50% de la substance de référence de chaque composant de l’indice dans la solution d’essai pour calculer le taux de récupération. Exécutez ces échantillons dans le système HPLC dans les mêmes conditions que celles décrites à l’étape 2.1.
   2. Calculez le taux de récupération.
      NOTA: Taux de récupération = (C - A) / B x 100, où A est la quantité de composant à mesurer dans la solution d’essai, B est la quantité de substance de référence ajoutée et C est la valeur mesurée de la solution contenant la substance de référence et l’échantillon de GR. Reportez-vous à l’étape 2.1 pour connaître les conditions chromatographiques permettant d’effectuer les étapes ci-dessus (c.-à-d. les étapes 3.1 à 3.5).

4. Test de dissolution in vitro

1. Effectuer le test de dissolution en utilisant la méthode de la palette de la deuxième méthode de la règle générale 0931 de la pharmacopée chinoise (édition 2020)¹².
   REMARQUE : Technique et équipement d’échantillonnage : L’appareil de dissolution de médicaments (table des matériaux) est muni d’une coupelle de dissolution, d’une palette, d’un système de contrôle de la température et d’un système de réglage de la vitesse. Avant de commencer l’expérience de dissolution, l’eau est préchauffée à une température définie, puis la vitesse correspondante est réglée. Commencez à enregistrer l’heure immédiatement après l’ajout de RG.
2. Ajouter 100 ml d’eau ultrapure dans la coupelle de dissolution de l’appareil de dissolution du médicament et maintenir la température à 37 °C ± 0,5 °C. Réglez la vitesse de rotation sur 100 tr/min.
   REMARQUE: L’appareil de dissolution dispose d’un dispositif de chauffage qui permet de régler la température à l’intérieur du système. Il n’y avait pas de différence significative dans le taux de dissolution du salidroside dans l’eau, le suc gastrique artificiel (16,4 mL d’acide chlorhydrique dilué [234 mL d’acide chlorhydrique concentré dilué à 1000 mL avec de l’eau] avec environ 800 mL d’eau et 10 g de pepsine, bien agité et dilué avec de l’eau à 1 000 mL), et le suc intestinal artificiel (tampon phosphate [pH 6,8] contenant de la trypsine)¹³. L’eau la plus facilement disponible (ultrapure) a été choisie comme milieu de dissolution.
3. Ajouter 2,8 g de RG dans une tasse de dissolution et commencer à enregistrer immédiatement la durée de la dissolution. Prélever un total de 1 mL de l’échantillon à l’aide d’un injecteur (voir le tableau des matières) à 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min et 60 min, et compléter immédiatement le volume dans la coupelle de dissolution avec le milieu de dissolution à la même température.
   REMARQUE: Le tube d’échantillonnage dans la coupelle de dissolution ne peut pas prélever de petits volumes d’échantillon, de sorte que l’injecteur est utilisé pour prélever l’échantillon. Les échantillons doivent être prélevés rapidement pour éviter de manquer des points temporels de collecte spécifiés.
4. Filtrer immédiatement les échantillons prélevés à travers une membrane microporeuse de 0,22 μm et prélever le filtrat suivant. Déterminer la teneur de chaque composant à chaque point temporel par CLHP (selon l’étape 2.1) et calculer la dissolution cumulative.
   1. Pour calculer la dissolution cumulée, calculez la dissolution de chaque point temporel (X_n) :
      X_n = A / B x 100, où A est la quantité de composants mesurée à chaque point temporel et B est le contenu théorique de chaque composant.
   2. Ensuite, calculez la dissolution cumulative (Y) :
      Y = X n + (X 1 + ... + X_n-1) x V₂ / V 1, où V ₁ est le volume total du milieu de dissolution et_V2 est le volume de soluté ajouté après chaque échantillonnage.
      NOTA : En raison des faibles valeurs de réponse du salidroside et de l’acide gallique dans le chromatogramme, la dissolution cumulative du salidroside et du gallate d’éthyle au point temporel de 1 min n’a pas été tracée dans la courbe de dissolution.

5. Adaptation au modèle de dissolution

1. Importez les données de dissolution cumulées à chaque point temporel dans le logiciel d’analyse des données.
2. Utilisez le plug-in d’analyse de dissolution de médicament dans le logiciel d’analyse de données pour ajuster l’équation GompertzMod, l’équation de Gompertz, l’équation logistique et l’équation de Weibull¹⁴. Plus la valeur de R² est grande, meilleur est l’effet d’ajustement de la courbe.
   1. Démarrez le logiciel, sélectionnez la fenêtre Book1 pour accéder à la fenêtre Origin Data Editing .
   2. Dans la première colonne A(X)-Nom long Entrez Time, définissez Time comme temps et entrez chaque temps de détermination de la dissolution. Les données d’entrée dans la deuxième colonne B(Y)-Nom long, définissent les données comme la dissolution cumulée, entrez le pourcentage de dissolution cumulé de chaque temps de détermination de la dissolution.
   3. Après la saisie des données, sélectionnez les colonnes A(X) et B(Y), puis sélectionnez le plug-in Analyse de dissolution de médicament dans la barre de menu du logiciel et cliquez sur Données de dissolution d’ajustement > Concaténate Ajustement > OK. Le logiciel génère les résultats d’ajustement de chaque modèle.

Résultats

Dans cette étude, la précision, la stabilité, la répétabilité et la récupération de l’échantillon de RG se situaient toutes dans la plage méthodologique spécifiée dans la pharmacopée chinoise (volume 4, 2020)¹², ce qui indique que la méthode était réalisable. Après un débogage répété, il a été déterminé que le gradient d’élution utilisé dans cette étude avait une bonne résolution (figure 1) pour les trois composantes de l’indice dans...

Discussion

Le test de dissolution est une méthode in vitro idéale pour simuler la désintégration et la dissolution de préparations orales solides dans le tractus gastro-intestinal¹⁵. C’est un indice important pour évaluer et contrôler la qualité des préparations orales solides. Par conséquent, le test de dissolution joue un rôle essentiel dans le développement de préparations orales médicamenteuses solides¹⁶. En particulier, avec le développement de la techno...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromatographic column	ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4.6 mm x 250 mm, 5 µm
Drug dissolution tester	Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd.	RCZ-6B3
Electronic analytical balance	Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd.	FA1004
Ethyl gallate (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM006301
Function drawing software	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2022
Gallic acid (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM000802
High performance liquid chromatography	Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd.	Agilent 1260 Infinity
HPLC grade methanol	Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.	216565
Injector	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd.	0.7 (22 G)
Millipore filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	φ13 0.22 Nylon66
Rhodiola granules	Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd.	210501
Salidroside (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DST200425-037
Ultra pure water systemic	Merck Millipore Ltd.	Milli-Q
Ultrasonic cleansing machine	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200 DTS