Uma determinação de dissolução in vitro de componentes multiíndices em grânulos de Rhodiola da medicina tibetana

Resumo

Aqui, testamos a dissolução de grânulos de Rhodiola (RG) in vitro, desenhamos curvas de dissolução de salidrósido, ácido gálico e galato de etila em água ultrapura e ajustamos as curvas a diferentes modelos matemáticos. Este protocolo fornece informações e orientações para estudos de bioequivalência in vivo e de correlação in vivo-in vitro do GP.

Resumo

A composição do medicamento tibetano Rhodiola granules (RG) é complexa, e a qualidade geral do RG é difícil de determinar. Portanto, estabelecer um método para determinar a dissolução multicomponente in vitro do RG é de grande importância para o controle de qualidade. Este estudo utiliza o método do segundo remo da quarta regra geral 0931 da Farmacopeia Chinesa (edição 2020), compatível com o aparelho 2 da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP). O aparelho de dissolução foi ajustado para uma velocidade de rotação de 100 rpm com água ultrapura como meio de dissolução. Um volume de amostra de 1 mL foi coletado em cada ponto de tempo. Além disso, a dissolução cumulativa de ácido gálico, salidrosídeo e ácido etílico-gálico em RG em diferentes momentos foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Finalmente, as curvas de dissolução foram desenhadas, e as curvas foram ajustadas às equações de GompertzMod, Gompertz, Logística e Weibull. Os resultados mostraram que a dissolução cumulativa do ácido gálico no GP foi superior a 80% em 1 min, a dissolução cumulativa de salidrósida e ácido etílico-gálico foi superior a 65% em 5 min e a dissolução cumulativa de cada componente do índice diminuiu após 30 min. O ajuste da curva demonstrou que a equação de GompertzMod foi o modelo de melhor ajuste para cada componente do índice do GP. Em conclusão, o método de teste de dissolução descrito neste protocolo é simples, preciso e confiável. Pode caracterizar o comportamento de dissolução dos componentes do índice no GP in vitro, o que fornece um referencial metodológico para o controle de qualidade do GP e avaliação da qualidade de outros compostos étnicos.

Introdução

Na China, a prevalência de doenças cardiovasculares continua a aumentar, e as taxas de morbidade e mortalidade de doenças cardiovasculares ocupam o primeiro lugar entre os residentes chineses¹. A angina de peito da doença coronariana é causada por estenose luminal devido à aterosclerose coronariana, o que leva a suprimento sanguíneo coronariano relativamente insuficiente e isquemia miocárdica e hipóxia². Nos últimos anos, o efeito curativo da medicina tradicional chinesa no tratamento da doença coronariana tem sido reconhecido por muitos médicos³.

A medicina tradicional chinesa desempenha um papel importante no alívio dos sintomas clínicos e na melhoria da qualidade de vida dos pacientes⁴. Os grânulos de Rhodiola (RG) são extraídos e refinados da planta medicinal do planalto tibetano Rhodiola rosea L. Os principais componentes do RG são salidrosídeo, rodiosina e flavonoides ^5,6. RG tem o efeito de suplementar Qi⁷ e ativar e promover a circulação sanguínea para aliviar a dor. Clinicamente, é usado para tratar obstruções torácicas causadas por deficiência de Qi e estase sanguínea, doença coronariana, angina de peito⁸. A determinação do conteúdo por si só não reflete totalmente a qualidade intrínseca dos fármacos, pois tanto a desintegração quanto a dissolução in vitro podem afetar a biodisponibilidade e a eficácia dos fármacos ^9,10. Os métodos de inspeção para a dissolução da medicina chinesa incluem o método da cesta rotativa, o método da pá e o método do copo pequeno. A desvantagem do método da cesta rotativa é que apenas a parte externa da cesta rotativa entra em contato com o meio de dissolução durante a rotação, o que não reflete o comportamento de dissolução do mundo real. O método do remo pode superar a deficiência acima, o que o torna mais adequado do que o método da cesta para algumas preparações sólidas da medicina chinesa¹¹. Atualmente, não há relato sobre a análise de dissolução in vitro do RG. A fim de controlar a qualidade do GP de forma mais abrangente, investigou-se o comportamento de dissolução dos três componentes do índice (ácido gálico, salidrosídeo e galato de etila) no GP. Este estudo fornece dados para o controle de qualidade do GP e um referencial metodológico para avaliação da qualidade de outras preparações de compostos étnicos.

Protocolo

1. Preparação da solução

1. Preparar a solução-mãe da substância de referência: Pesar 10,6 mg de salidrósido, 5,24 mg de ácido gálico e 5,21 mg de ácido etílico-gálico separadamente numa balança analítica electrónica e adicioná-los individualmente num balão aferido de 5 ml. Em seguida, adicione metanol de grau HPLC para dissolver e diluir para 5 mL. Finalmente, agitar bem para obter a solução-estoque da substância de referência com concentrações mássicas de 2,120 mg/mL, 1,048 mg/mL e 1,042 mg/mL, respectivamente.
   NOTA: A solução-mãe da substância de referência contém 2,120 mg/ml de salidrósido, 1,048 mg/ml de ácido gálico e 1,042 mg/ml de galato de etilo como solução-mãe de cada solução na curva-padrão subsequente.
2. Prepare a solução de amostra de teste. Extraia 2,8 g de RG (Tabela de Materiais) com 10 mL de metanol de grau HPLC usando uma máquina de limpeza ultrassônica (Potência: 200 W, frequência: 40 kHz) por 30 min e, em seguida, filtre-o com um filtro de 0,22 μm para o teste de adaptabilidade do sistema.
3. Preparar uma solução de referência mista que contenha 0,590 mg/ml de salidrósido, 2,030 mg/ml de ácido gálico e 1,930 mg/ml de galato de etilo.
   NOTA: Cada padrão (2,950 mg de salidrósido, 10,150 mg de ácido gálico e 9,650 mg de ácido etílico-gálico) é dissolvido em um balão aferido de 5 mL em metanol de grau HPLC como meio de dissolução.
4. Obter o conteúdo teórico de cada componente característico do RG para extração de água ultrapura.
   1. Colocar 2,8 g de RG em um balão cônico de 500 mL, adicionar 200 mL de água ultrapura e extrair por ultrassom (Potência: 200 W, frequência: 40 kHz) por 60 min. Em seguida, filtre-o com um filtro de 0,22 μm.
   2. Determinar o teor da solução de ensaio de acordo com a equação linear obtida na experiência seguinte.

2. Condição cromatográfica

1. Definir as condições cromatográficas indicadas no quadro 1 para a cromatografia líquida de alta eficiência. Para obter detalhes sobre o instrumento utilizado, consulte a Tabela de Materiais.

3. Teste de adaptabilidade do sistema

1. Investigue a relação linear.
   1. Diluir as soluções-mãe de referência de ácido gálico e galato de etilo em 5, 10, 25, 50 e 125 vezes e as soluções-mãe de referência de salidrósida em 2, 4, 8, 16 e 32 vezes para obter a solução de concentração de gradiente para desenhar uma curva padrão.
      NOTA: Ajustar a razão de diluição da curva padrão de acordo com o experimento preliminar do tratamento da amostra. No experimento preliminar, as soluções-estoque dos três padrões foram primeiro diluídas 5, 10, 25, 50 e 125 vezes e, em seguida, a primeira curva padrão foi plotada. No entanto, quando a concentração da amostra de teste foi detectada, verificou-se que as concentrações de salidrósido não se enquadravam na faixa linear dessa curva padrão e, portanto, as concentrações foram ajustadas para incluí-las na curva. Em resumo, os experimentos preliminares acima foram utilizados para determinar as concentrações finais de diluição das três amostras de teste para estudos experimentais subsequentes.
2. Ensaio de precisão: Injectar 10 μL da solução mista de referência no sistema de HPLC seis vezes por dia e utilizar as amostras com as mesmas condições de HPLC descritas na etapa 2.1. Registre a área de pico de cada componente do recurso.
3. Experimentos de teste de estabilidade: Injetar 10 μL da solução de amostra preparada e determinar as áreas de pico da HPLC de acordo com as condições cromatográficas após 0 h, 6 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h e 24 h, respectivamente.
   NOTA: As áreas de pico são registradas automaticamente pelo sistema HPLC.
4. Ensaio de reprodutibilidade: Colher seis amostras do mesmo lote de RG para preparar a solução da amostra de ensaio de acordo com o método da etapa 1.2. Injetar 10 μL de cada amostra no sistema de HPLC. Execute as amostras conforme descrito na etapa 2.1 e determine a reprodutibilidade.
   NOTA: A repetibilidade foi avaliada comparando-se as diferenças de concentração entre as seis amostras.
5. Experiência de recuperação
   1. Prepare seis porções do mesmo lote de RG para a solução de teste. Em seguida, adicionar cerca de 50% da substância de referência de cada componente do índice na solução de ensaio para calcular a taxa de recuperação. Execute esses exemplos no sistema HPLC com as mesmas condições descritas na etapa 2.1.
   2. Calcule a taxa de recuperação.
      NOTA: Taxa de recuperação = (C - A) / B x 100, em que A é a quantidade de componente a medir na solução de ensaio, B é a quantidade de substância de referência adicionada e C é o valor medido da solução que contém a substância de referência e a amostra RG. Consulte a etapa 2.1 para as condições cromatográficas para executar as etapas acima (ou seja, as etapas 3.1-3.5).

4. Ensaio de dissolução in vitro

1. Realizar o teste de dissolução utilizando o método de remo do segundo método da regra geral 0931 da Farmacopeia Chinesa (edição de 2020)¹².
   NOTA: Técnica de amostragem e equipamento: O aparelho de dissolução de drogas (Tabela de Materiais) possui um copo de dissolução, uma pá, um sistema de controle de temperatura e um sistema de ajuste de velocidade. Antes de iniciar o experimento de dissolução, a água é pré-aquecida a uma temperatura definida e, em seguida, a velocidade correspondente é definida. Comece a gravar a hora imediatamente após a adição do RG.
2. Adicionar 100 ml de água ultrapura ao copo de dissolução do aparelho de dissolução do fármaco e manter a temperatura a 37 °C ± 0,5 °C. Defina a velocidade de rotação para 100 rpm.
   NOTA: O aparelho de dissolução possui um dispositivo de aquecimento que permite que a temperatura seja ajustada dentro do sistema. Não houve diferença significativa na taxa de dissolução de salidrosídeo em água, suco gástrico artificial (16,4 mL de ácido clorídrico diluído [234 mL de ácido clorídrico concentrado diluído a 1000 mL com água] com cerca de 800 mL de água e 10 g de pepsina, bem agitado e diluído com água a 1.000 mL) e suco intestinal artificial (tampão fosfato [pH 6,8] contendo tripsina)¹³. A água mais prontamente disponível (ultrapura) foi selecionada como meio de dissolução.
3. Adicione 2,8 g de RG em um copo de dissolução e comece a registrar a duração da dissolução imediatamente. Recolher um total de 1 ml da amostra com um injector (ver Tabela de Materiais) a 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min e 60 min, e completar o volume no copo de dissolução com o meio de dissolução à mesma temperatura imediatamente.
   NOTA: O tubo de amostragem no copo de dissolução não pode coletar pequenos volumes de amostra, portanto, o injetor é usado para coletar a amostra. As amostras devem ser coletadas rapidamente para evitar a falta de pontos de coleta especificados.
4. Filtrar imediatamente as amostras recolhidas através de uma membrana microporosa de 0,22 μm e recolher o filtrado subsequente. Determine o conteúdo de cada componente em cada ponto de tempo por HPLC (de acordo com a etapa 2.1) e calcule a dissolução cumulativa.
   1. Para calcular a dissolução cumulativa, calcule a dissolução de cada ponto de tempo (X_n):
      X_n = A / B x 100, onde A é a quantidade de componentes medida em cada ponto de tempo e B é o conteúdo teórico de cada componente.
   2. Em seguida, calcule a dissolução cumulativa (Y):
      Y = X n + (X 1 + ... + X _n-1) x V 2 / V 1, onde V₁ é o volume total do meio de dissolução e V ₂ é o volume de soluto adicionado após cada amostragem.
      NOTA: Devido aos baixos valores de resposta de salidrosídeo e ácido gálico no cromatograma, a dissolução cumulativa de salidrosídeo e galato de etila no ponto de tempo de 1 min não foi plotada na curva de dissolução.

5. Montagem do modelo de dissolução

1. Importe os dados de dissolução cumulativa em cada ponto de tempo para o software de análise de dados.
2. Utilizar o plug-in de análise de dissolução de fármacos no software de análise de dados para ajustar a equação de GompertzMod, a equação de Gompertz, a equação Logística e a equação de Weibull¹⁴. Quanto maior o valor de R², melhor é o efeito de ajuste da curva.
   1. Inicie o software, selecione a janela Book1 para entrar na janela Origin Data Editing .
   2. Na primeira coluna A(X)-Long Name input Time, defina Time as time e insira cada tempo de determinação de dissolução. Dados de entrada na segunda coluna B(Y)-Long Name, defina Data como a dissolução cumulativa, insira a porcentagem de dissolução cumulativa de cada tempo de determinação de dissolução.
   3. Após a entrada dos dados, selecione a coluna A(X) e B(Y) e selecione o plug-in Análise de Dissolução de Medicamentos na barra de menus do software e clique em Dados de Dissolução de Ajuste > Ajuste Concatenado > OK. O software gera os resultados de ajuste de cada modelo.

Resultados

Neste estudo, a precisão, a estabilidade, a repetibilidade e a recuperação amostral do GP estavam dentro da faixa metodológica especificada na Farmacopeia Chinesa (Volume 4, 2020)¹², indicando que o método era viável. Após depuração repetida, determinou-se que o gradiente de eluição utilizado neste estudo apresentou boa resolução (Figura 1) para os três componentes do índice no GP. Os três componentes do índice no GP apresentaram boa relação linear ...

Discussão

O teste de dissolução é um método in vitro ideal para simular a desintegração e dissolução de preparações orais sólidas no trato gastrointestinal¹⁵. É um índice importante para avaliar e controlar a qualidade de preparações orais sólidas. Portanto, o teste de dissolução desempenha um papel essencial no desenvolvimento de preparações orais de drogas sólidas¹⁶. Em particular, com o desenvolvimento da tecnologia de controle de qualidade da medicin...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromatographic column	ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4.6 mm x 250 mm, 5 µm
Drug dissolution tester	Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd.	RCZ-6B3
Electronic analytical balance	Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd.	FA1004
Ethyl gallate (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM006301
Function drawing software	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2022
Gallic acid (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM000802
High performance liquid chromatography	Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd.	Agilent 1260 Infinity
HPLC grade methanol	Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.	216565
Injector	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd.	0.7 (22 G)
Millipore filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	φ13 0.22 Nylon66
Rhodiola granules	Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd.	210501
Salidroside (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DST200425-037
Ultra pure water systemic	Merck Millipore Ltd.	Milli-Q
Ultrasonic cleansing machine	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200 DTS