Un modèle de résection apicale dans le cœur adulte de Xenopus tropicalis

Résumé

Xenopus tropicalis est un modèle idéal pour la recherche régénérative car beaucoup de ses organes possèdent une capacité de régénération remarquable. Ici, nous présentons une méthode pour construire un modèle de lésion cardiaque chez X. tropicalis via la résection apex.

Résumé

On sait que chez les mammifères adultes, le cœur a perdu sa capacité de régénération, faisant de l’insuffisance cardiaque l’une des principales causes de décès dans le monde. Des recherches antérieures ont démontré la capacité de régénération du cœur de Xenopus tropicalis adulte, un amphibien anoure avec un génome diploïde et une relation évolutive étroite avec les mammifères. De plus, des études ont montré qu’après une résection de l’apex ventriculaire, le cœur peut se régénérer sans cicatrisation chez X. tropicalis. Par conséquent, ces résultats antérieurs suggèrent que X. tropicalis est un modèle de vertébrés alternatif approprié pour l’étude de la régénération cardiaque chez l’adulte. Un modèle chirurgical de régénération cardiaque chez l’adulte X. tropicalis est présenté ici. Brièvement, les grenouilles ont été anesthésiées et fixées; Ensuite, une petite incision a été faite avec des ciseaux d’iridectomie, pénétrant la peau et le péricarde. Une légère pression a été appliquée sur le ventricule et le sommet du ventricule a ensuite été découpé avec des ciseaux. Les lésions cardiaques et la régénération ont été confirmées par histologie 7 à 30 jours après la résection (dpr). Ce protocole a établi un modèle de résection apicale chez X. tropicalis adulte, qui peut être utilisé pour élucider les mécanismes de la régénération cardiaque chez l’adulte.

Introduction

L’insuffisance cardiaque a été l’une des principales causes de mortalité dans le monde ces dernières années. Depuis 2000, le nombre de décès dus à l’insuffisance cardiaque a augmenté au fil du temps. Plus de 9 millions de personnes sont mortes de cardiomyopathie en 2019, ce qui représentait 16% du nombre total de décès dans le monde¹. En raison de la perte de la capacité de régénération du cœur chez les mammifères adultes, dans certains cas, il n’y a pas assez de cardiomyocytes pour maintenir les fonctions de contraction dans le cœur, ce qui affecte la fonction cardiaque et contribue au remodelage ventriculaire anormal et à l’insuffisance cardiaque ^2,3,4. En effet, chez les mammifères, le cœur a la plus faible capacité de régénération par rapport aux autres organes, tels que le foie, les poumons, les intestins, la vessie, les os et la peau. Alors que le vieillissement de la population mondiale devient une mégatendance mondiale, les défis auxquels nous sommes confrontés avec les maladies cardiaques vont s’intensifier⁵.

L’élucidation des mécanismes de la régénération cardiaque peut avoir des implications importantes pour les thérapies des cardiopathies ischémiques. Des rapports ont révélé que le cœur des souris néonatales a une capacité de régénération après la résection de l’apex⁶. Néanmoins, cette capacité de régénération est perdue après^{l’âge de} 7 jours et 7 ans. Des études ont démontré que les cœurs de mammifères adultes sont incapables de se régénérer parce que leur capacité de prolifération des cardiomyocytes a diminué ^8,9. Cependant, le cœur des vertébrés inférieurs possède une puissante capacité de régénération après une blessure. Par exemple, le poisson-zèbre 10, X. tropicalis¹¹, Xenopus laevis¹², le triton 13 et l’axolotl¹⁴ sont capables d’une régénération complète après la résection de l’apex. De plus, les autres parties du corps de certains vertébrés inférieurs peuvent également subir une régénération complète, telles que les membres des tritons et les queues, les lentilles et les bras des grenouilles tropicales^à griffes 4,15,16.

L’établissement de modèles de lésions cardiaques est la première étape pour élucider les mécanismes sous-jacents à la régénération cardiaque et revêt une grande importance dans la recherche régénérative. Les chercheurs ont mis au point diverses méthodes pour construire des modèles de lésions cardiaques, y compris les coups de couteau, les contusions, l’ablation génétique, les cryolésions et l’infarctus ^5,6.

La cryolésion, l’infarctus du myocarde (IM) et la résection de l’apex sont largement utilisés pour induire une lésion cardiaque, et le type de lésion peut avoir des effets substantiels sur la régénération suivante des cardiomyocytes⁶. Selon la technique chirurgicale, la réponse du cœur à la régénération peut varier. La cryolésion provoque une mort cellulaire massive et produit des cicatrices fibrotiques dans le cœur du poisson zèbre¹⁷, créant ainsi un modèle qui ressemble à un infarctus de mammifère. La résection apicale est réalisée en coupant une partie des tissus ventriculaires, ce qui a été fait chez le poisson-zèbre¹⁰ et X. tropicalis¹¹, sans causer de cicatrices permanentes. Cette étude a effectué une résection apicale, qui est une opération plus simple et nécessite moins d’instruments chirurgicaux que la cryolésion. En utilisant l’analyse de traçage de la lignée, une étude antérieure a démontré que la régénération cardiaque est liée à la prolifération des cardiomyocytes qui préexistent dans le cœur de la souris⁶ et du poisson zèbre¹⁸, mais aucun rapport n’existe pour les amphibiens. Par conséquent, le modèle de résection de l’apex chez X. tropicalis joue un rôle important dans l’élucidation des mécanismes sous-jacents aux réponses régénératives.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux liés à X. tropicalis ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de l’Université de Jinan.

1. Chirurgie

1. Préparation préopératoire : Gardez prêts les ciseaux ophtalmiques, les pinces ophtalmiques, les pinces à aiguilles, les boules absorbantes, le papier filtre et les sutures/aiguilles chirurgicales pour la résection de l’apex dans le cœur de X. tropicalis. Consultez le tableau des matériaux pour obtenir des renseignements détaillés. Avant utilisation, stérilisez tous les instruments chirurgicaux à l’autoclave et préparez une quantité suffisante de glace pour une utilisation future.
2. Anesthésiez un X. tropicalis adulte avec de la tricaïne en la plaçant dans 500 mL de solution de tricaïne (1 mg/mL) à température ambiante pendant 4 min¹⁹, puis placez-la sur une surface de glace sur la table d’opération pour s’assurer que la grenouille ne se réveille pas pendant le processus opératoire.
   ATTENTION: L’ensemble de la procédure nécessite 5-10 min; le temps d’anesthésie ne doit pas être trop long, sinon le X. tropicalis pourrait ne pas être en mesure de se réveiller après l’opération.
3. Thoracotomie
   1. Placez l’abdomen de X. tropicalis anesthésié vers le haut et couvrez l’abdomen de la grenouille avec de la gaze prétrempée dans de l’eau distillée pour éviter le dessèchement de la peau de l’animal pendant l’opération.
   2. Appuyez doucement sur la poitrine avec une pince, trouvez le centre de la poitrine parallèle au membre antérieur inférieur, soulevez la peau avec des ciseaux ophtalmiques et faites doucement une petite incision de ~ 1 cm. À l’aide de ciseaux ophtalmiques, ramassez la couche musculaire sous la peau et créez une plaie dans le muscle central de la poitrine. Comme le cœur est situé dans la position supérieure du site de la plaie, appuyez doucement sur la poitrine avec la pince ophtalmique pour extraire le cœur de la plaie.
      ATTENTION: Comme la peau de X. tropicalis peut produire des peptides antimicrobiens, il n’est pas nécessaire d’utiliser des procédures de désinfection conventionnelles sur le site chirurgical de X. tropicalis. Tout désinfectant endommagera la peau du X. tropicalis.
4. Résection de l’apex ventriculaire
   1. Serrez doucement le péricarde avec une pince et brisez-le doucement à l’aide de ciseaux ophtalmiques près de l’apex du cœur. Attendez que le péricarde se détache en raison du pompage du sang systolique (Figure 1A, B).
   2. Tenez le bout du cœur avec une pince dans la main non dominante et soulevez légèrement le cœur en fonction du rythme de contraction cardiaque. Lorsque le cœur se contracte pour recirculer le sang dans les vaisseaux sanguins, coupez rapidement l’apex du cœur (~14% du ventricule) (Figure 1C).
   3. Pour vous assurer que la quantité de résection apex est d’environ 14% du cœur entier, analysez le poids cardiaque (HW) et la surface avec ou sans résection²⁰. Placez le cœur dans la poitrine à l’aide d’une pince et d’une boule absorbante.
      REMARQUE: N’appuyez pas directement sur le cœur avec la pince; Sinon, d’autres parties du cœur seront perforées.
5. Suturer la peau avec une suture au fil chirurgical non absorbant non absorbant 4-0 (Figure 1D). Veillez à éviter de suturer dans la couche musculaire pour éviter la mortalité postopératoire. Attendez que la plaie cutanée guérisse naturellement dans la semaine suivant la chirurgie.
6. Dans le groupe d’opération simulée, effectuer la thoracotomie, ouvrir le péricarde et la suture, sans effectuer la résection de l’apex.

2. Récupération chirurgicale

1. Placez le X. tropicalis postopératoire avec son abdomen vers le haut dans une boîte de Petri contenant une petite quantité d’eau désionisée (ne pas inonder complètement l’animal). Attendez que le X. tropicalis se réveille dans ~10 min.
2. Lors de la reprise de conscience, observez la mobilité et l’activité de l’animal, ainsi que la suture de la plaie pendant l’activité. Transférez les grenouilles qui ont retrouvé leur équilibre dans un récipient rempli d’eau pure pour la culture. Remplacez l’eau par de l’eau pure tous les jours pour éviter l’infection de la plaie.
   NOTE: Avec ces mesures, le taux de survie pourrait atteindre ~90%. Une période prolongée d’anesthésie et des saignements excessifs pendant la chirurgie entraînent tous deux la mort, qui survient généralement le jour de la chirurgie.

3. Détection de l’état de réparation après une lésion cardiaque

1. Recueillir le cœur de X. tropicalis à plusieurs moments après la chirurgie.
   1. Après avoir anesthésié le X. tropicalis avec de la tricaïne, ouvrez l’abdomen et utilisez une pince pour enlever les autres organes et tissus internes afin de trouver l’emplacement du cœur.
      REMARQUE: En raison de la résection de l’apex, le cœur est susceptible de se développer aux côtés d’autres tissus et organes pendant le processus de réparation. Parfois, il adhère à la paroi musculaire et n’est pas facile à séparer, il doit donc être manipulé avec précaution lors de la collecte.
   2. Après avoir trouvé le cœur, utilisez des forceps pour arracher doucement les autres organes du cœur. Décollez doucement les autres tissus entourant le cœur pour exposer le cœur. Utilisez une pince pour soulever doucement le cœur et découpez-le à l’aide de ciseaux. Placez immédiatement le cœur dans PBS pour prélever tout sang restant et photographiez-le avec un stéréoscope pour la documentation (Figure 2).
2. Déshydratation gradient
   1. Épongez les cœurs avec du papier filtre pour sécher les résidus de PBS en excès et placez-les dans une boîte de culture cellulaire à 24 puits. Utilisez 1-2 ml de paraformaldéhyde à 4% pour fixer les tissus cardiaques pendant la nuit. Le lendemain, effectuez une déshydratation à l’éthanol. Tout d’abord, utilisez 70% d’éthanol pendant la nuit, suivi de 80% d’éthanol, 90% d’éthanol et 100% d’éthanol pour la déshydratation gradient (1 h à chaque fois). Répétez l’utilisation d’éthanol à 100% trois fois.
3. Encastrement de paraffine
   1. Traiter le tissu cardiaque déshydraté avec du xylène pendant 6-8 min. Placer le tissu traité au xylène dans un récipient en verre rempli de cire de paraffine à 65 °C pendant 2-3 h.
      REMARQUE: Il est essentiel d’éviter les bulles d’air car elles affectent la section pendant le processus d’intégration.
4. Congeler le tissu incrusté à −20 °C pendant 1 h et le sectionner.
5. Après avoir sectionné le cœur, effectuer les techniques standard de coloration trichrome de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) et de Masson sur les sections¹¹.

Résultats

Les cœurs ont été recueillis à 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr et 30 dpr. L’analyse morphologique a révélé que le caillot sanguin causé par la lésion cardiaque a disparu à 30 dpr (Figure 2). Dans le même temps, l’apparence des cœurs à 30 dpr dans le groupe de résection était similaire à celle des cœurs dans le groupe d’opération simulée; il n’y avait pas de blessures évidentes (figure 2). Après la résection apicale, un caillot sanguin s’est ...

Discussion

La résection apicale, qui implique l’amputation chirurgicale de l’apex du cœur, a été décrite chez le poisson zèbre et la souris ^6,18; cependant, cela n’a pas été décrit chez X. tropicalis. Ce rapport décrit un modèle crédible de lésion cardiaque et démontre que le cœur de X. tropicalis adulte peut se régénérer complètement après une résection apicale sans laisser de cicatrices. Toutefois, certaines lacunes doivent êt...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	GHTECH	64-19-7-500ml
Acid Alcohol Fast Differentiation Solution	Beyotime	C0163M
Acid Fuchsin	aladdin	A104916
Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution	Servicebio	G1001-500ML
BioReagent	Beyotime	ST2600-100g
Ethanol absolute	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-0.5L
Hematoxylin Stain Solution	Servicebio	G1004-500ML
Neutral balsam	Solarbio	G8590
Operating Scissors	Prosperich	HC-JZ-YK-Z-10cm
Paraffins	Leica	39601095
Para-formaldehyde Fixative	Servicebio	G1101-500ML
Phosphate Buffered Saline (PBS) powder	Servicebio	G0002-2L
Phosphomolybdic acid hydrate	Macklin	P815551
Stereo microscope	Leica
surgical forceps	ChangZhou	zfq-11-btjw
Surgical Suture	HUAYON	18-5140
Tricaine	Macklin
Xylene	Guangzhou Chemical Reagent Factory	IC02-AR-0.5L