Модель апикальной резекции в сердце взрослого Xenopus tropicalis

Резюме

Xenopus tropicalis является идеальной моделью для регенеративных исследований, поскольку многие из его органов обладают замечательной регенеративной способностью. Здесь мы представляем метод построения модели повреждения сердца у X. tropicalis с помощью резекции вершины.

Аннотация

Известно, что у взрослых млекопитающих сердце утратило свою регенеративную способность, что делает сердечную недостаточность одной из основных причин смерти во всем мире. Предыдущие исследования продемонстрировали регенеративную способность сердца взрослого Xenopus tropicalis, беснулевой амфибии с диплоидным геномом и тесной эволюционной связью с млекопитающими. Кроме того, исследования показали, что после резекции верхушки желудочка сердце может регенерировать без рубцевания у X. tropicalis. Следовательно, эти предыдущие результаты свидетельствуют о том, что X. tropicalis является подходящей альтернативной моделью позвоночных для изучения регенерации сердца у взрослых. Здесь представлена хирургическая модель регенерации сердца у взрослой особи X. tropicalis. Вкратце, лягушки были обезболены и зафиксированы; Затем был сделан небольшой разрез ножницами для иридэктомии, проникающий в кожу и перикард. На желудочек оказывалось легкое давление, а затем ножницами вырезали верхушку желудочка. Повреждение сердца и регенерация были подтверждены гистологией через 7-30 дней после резекции (ДПР). Этот протокол установил модель апикальной резекции у взрослых X. tropicalis, которая может быть использована для выяснения механизмов регенерации сердца у взрослых.

Введение

Сердечная недостаточность является основной причиной смертности во всем мире в последние годы. С 2000 года число смертей от сердечной недостаточности со временем увеличивается. В 2019 году от кардиомиопатии умерло более 9 миллионов человек, что составило 16% от общего числа смертей во всем^мире1. Из-за потери регенеративной способности сердца у взрослых млекопитающих в некоторых случаях не хватает кардиомиоцитов для поддержания сократительных функций в сердце, что влияет на функцию сердца и способствует аномальному ремоделированию желудочков и сердечной недостаточности ^2,3,4. Действительно, у млекопитающих сердце имеет самую низкую регенеративную способность по сравнению с другими органами, такими как печень, легкие, кишечник, мочевой пузырь, кости и кожа. По мере того, как старение населения мира становится глобальной мегатенденцией, проблемы, с которыми мы сталкиваемся в связи с сердечно-сосудистыми заболеваниями, будут усиливаться⁵.

Выяснение механизмов регенерации сердца может иметь значительные последствия для терапии ишемической болезни сердца. Отчеты показали, что сердца новорожденных мышей обладают регенеративной способностью после резекции^{вершины 6}. Тем не менее, эта регенеративная способность теряется после 7 дней в возрасте⁷ лет. Исследования показали, что сердца взрослых млекопитающих не могут регенерировать, потому что их способность к пролиферации кардиомиоцитов уменьшилась ^8,9. Однако сердца низших позвоночных обладают мощной регенеративной способностью после травмы. Например, рыбки данио-рерио 10, X. tropicalis¹¹, Xenopus laevis¹², тритон¹³ и аксолотль¹⁴ способны к полной регенерации после резекции вершины. Кроме того, другие части тела некоторых низших позвоночных также могут подвергаться полной регенерации, такие как конечности тритонов и хвосты, хрусталики и руки тропических когтистых лягушек 4,15,16.

Создание моделей сердечных повреждений является первым шагом к выяснению механизмов, лежащих в основе регенерации сердца, и имеет большое значение в регенеративных исследованиях. Исследователи разработали различные методы построения моделей сердечных травм, включая колющие ранения, ушибы, генетическую абляцию, криотравму и инфаркт ^5,6.

Криотравма, инфаркт миокарда (ИМ) и резекция верхушки широко используются для индукции сердечной травмы, и тип травмы может оказывать существенное влияние на последующую регенерацию кардиомиоцитов⁶. В зависимости от хирургической техники реакция сердца на регенерацию может варьироваться. Криотравма вызывает массовую гибель клеток и вызывает фиброзные рубцы в сердцах рыбок^{данио-17}, создавая таким образом модель, напоминающую инфаркт млекопитающих. Апикальная резекция выполняется путем отсечения части тканей желудочков, что было сделано у рыбок данио-рерио¹⁰ и X. tropicalis¹¹, не вызывая постоянных рубцов. В этом исследовании была выполнена апикальная резекция, которая является более простой операцией и требует меньшего количества хирургических инструментов, чем криотравма. Используя анализ отслеживания происхождения, предыдущее исследование показало, что регенерация сердца связана с пролиферацией кардиомиоцитов, которые ранее существуют в сердцах мышей⁶ и рыбок данио-рерио¹⁸, но нет никаких сообщений о земноводных. Следовательно, модель резекции вершины у X. tropicalis играет важную роль в выяснении механизмов, лежащих в основе регенеративных реакций.

протокол

Все экспериментальные протоколы, связанные с X. tropicalis , были одобрены Комитетом по уходу за животными Цзинаньского университета.

1. Хирургия

1. Предоперационная подготовка: Держите наготове офтальмологические ножницы, офтальмологические щипцы, игольчатые щипцы, абсорбирующие шарики, фильтровальную бумагу и хирургические швы/иглы для резекции вершины сердца X. tropicalis. Подробную информацию см. в Таблице материалов . Перед использованием стерилизуйте все хирургические инструменты путем автоклавирования и подготовьте достаточное количество льда для будущего использования.
2. Обезболите взрослую X. tropicalis трикаином, поместив его в 500 мл раствора трикаина (1 мг / мл) при комнатной температуре на 4 мин¹⁹, а затем положите его на поверхность льда на операционном столе, чтобы лягушка не проснулась во время операционного процесса.
   ВНИМАНИЕ: Вся процедура занимает 5-10 минут; время анестезии не должно быть слишком большим, иначе X. tropicalis может не проснуться после операции.
3. Торакотомии
   1. Поместите анестезированную кожу X. tropicalis брюшком вверх и накройте брюшко лягушки марлей, предварительно смоченной в дистиллированной воде, чтобы избежать высыхания кожи животного во время операции.
   2. Аккуратно надавите щипцами на грудную клетку, найдите центр грудной клетки параллельно нижней передней конечности, поднимите кожу глазными ножницами и аккуратно сделайте небольшой разрез ~1 см. С помощью офтальмологических ножниц подцепите мышечный слой под кожей и создайте рану в центральной мышце грудной клетки. Поскольку сердце расположено в верхнем положении места раны, осторожно надавите на грудную клетку глазными щипцами, чтобы выдавить сердце из раны.
      ВНИМАНИЕ: Поскольку кожа X. tropicalis может продуцировать антимикробные пептиды, нет необходимости использовать обычные процедуры дезинфекции на месте хирургического вмешательства X. tropicalis. Любое дезинфицирующее средство повредит кожу X. tropicalis.
4. Резекция верхушки желудочка
   1. Аккуратно зажмите перикард щипцами, а аккуратно разломайте его с помощью офтальмологических ножниц возле верхушки сердца. Дождитесь отрыва перикарда из-за систолической перекачки крови (рис. 1А, Б).
   2. Держите кончик сердца щипцами в недоминантной руке и слегка приподнимите сердце в соответствии с ритмом сердечного сокращения. Когда сердце сокращается, чтобы рециркулировать кровь по кровеносным сосудам, быстро отрежьте верхушку сердца (~ 14% желудочка) (рис. 1C).
   3. Чтобы убедиться, что объем резекции вершины составляет примерно 14% от всего сердца, проанализируйте вес сердца (HW) и площадь поверхности с резекцией²⁰ или без нее. Поместите сердце в грудную клетку с помощью щипцов и абсорбирующего шарика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не нажимайте на сердце непосредственно щипцами; В противном случае будут проколоты другие части сердца.
5. Наложите на кожу невпитывающий хирургический шов из нешелковой нити 4-0 (рис. 1D). Будьте осторожны, чтобы избежать наложения швов на мышечный слой, чтобы предотвратить послеоперационную смертность. Подождите, пока кожная рана естественным образом заживет в течение 1 недели после операции.
6. В группе фиктивных операций выполняют торакотомию, вскрывают перикард и накладывают швы, не выполняя резекцию верхушки.

2. Хирургическое восстановление

1. Поместите послеоперационного X. tropicalis брюшком вверх в чашку Петри, содержащую небольшое количество деионизированной воды (не заливайте животное полностью). Подождите, пока X. tropicalis проснется в течение ~ 10 минут.
2. Придя в сознание, понаблюдайте за подвижностью и активностью животного, а также за раневым швом во время активности. Перенесите лягушек, которые восстановили равновесие, в емкость, наполненную чистой водой для выращивания. Заменяйте воду чистой водой каждый день, чтобы избежать раневой инфекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При таких мерах выживаемость может достигать ~ 90%. Длительное время анестезии и чрезмерное кровотечение во время операции приводят к смерти, которая обычно наступает в день операции.

3. Определение состояния восстановления после сердечной травмы

1. Собирайте сердца X. tropicalis в несколько моментов времени после операции.
   1. После обезболивания X. tropicalis трикаином вскройте брюшную полость и используйте щипцы, чтобы удалить другие внутренние органы и ткани, чтобы найти местоположение сердца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за резекции верхушки сердце, вероятно, будет развиваться вместе с другими тканями и органами в процессе восстановления. Иногда он прилипает к мышечной стенке и его нелегко отделить, поэтому с ним нужно обращаться осторожно во время сбора.
   2. Найдя сердце, используйте щипцы, чтобы аккуратно оторвать другие органы от сердца. Аккуратно очистите другие ткани, окружающие сердце, чтобы обнажить сердце. Используйте щипцы, чтобы аккуратно приподнять сердце, и вырежьте его ножницами. Немедленно поместите сердце в PBS, чтобы удалить оставшуюся кровь, и сфотографируйте его с помощью стереоскопа для документирования (рисунок 2).
2. Градиентное обезвоживание
   1. Промокните сердечки фильтровальной бумагой, чтобы высушить излишки остатков PBS, и поместите их в 24-луночную чашку для культивирования клеток. Используйте 1-2 мл 4% параформальдегида, чтобы закрепить ткани сердца на ночь. На следующий день выполните обезвоживание этанола. Сначала используйте 70% этанола на ночь, затем 80% этанола, 90% этанола и 100% этанола для градиентного обезвоживания (1 час каждый раз). Повторите использование 100% этанола три раза.
3. Заделка парафина
   1. Обработайте обезвоженную сердечную ткань ксилолом в течение 6-8 минут. Обработанную ксилолом ткань поместить в стеклянную емкость, наполненную парафином, при температуре 65 °C на 2-3 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать пузырьков воздуха, так как они влияют на секцию в процессе встраивания.
4. Заморозьте застрявшую ткань при температуре -20 °C в течение 1 часа и разделите ее.
5. После разреза сердца выполните стандартные методы окрашивания гематоксилином и эозином (H & E) и трихромного окрашивания Массона на срезах¹¹.

Результаты

Сердечки были собраны в 0 днр, 7 днр, 14 днр и 30 днр. Морфологический анализ показал, что сгусток крови, вызванный повреждением сердца, исчез через 30 дней (рис. 2). При этом появление сердец на 30 дпр в группе резекции было аналогично появлению сердец в бутафорской оперативной г...

Обсуждение

Апикальная резекция, которая включает хирургическую ампутацию верхушки сердца, была описана у рыбок данио-рерио и мышей ^6,18; однако это не было описано в X. tropicalis. В этом отчете описывается достоверная модель сердечной травмы и демонстрируется, что се?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	GHTECH	64-19-7-500ml
Acid Alcohol Fast Differentiation Solution	Beyotime	C0163M
Acid Fuchsin	aladdin	A104916
Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution	Servicebio	G1001-500ML
BioReagent	Beyotime	ST2600-100g
Ethanol absolute	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-0.5L
Hematoxylin Stain Solution	Servicebio	G1004-500ML
Neutral balsam	Solarbio	G8590
Operating Scissors	Prosperich	HC-JZ-YK-Z-10cm
Paraffins	Leica	39601095
Para-formaldehyde Fixative	Servicebio	G1101-500ML
Phosphate Buffered Saline (PBS) powder	Servicebio	G0002-2L
Phosphomolybdic acid hydrate	Macklin	P815551
Stereo microscope	Leica
surgical forceps	ChangZhou	zfq-11-btjw
Surgical Suture	HUAYON	18-5140
Tricaine	Macklin
Xylene	Guangzhou Chemical Reagent Factory	IC02-AR-0.5L