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Résumé

Cette étude a développé une méthode non invasive et en temps réel pour évaluer la distribution du ligand de mort programmée 1 dans l’ensemble du corps, basée sur l’imagerie tomographique par émission de positons de l’antagoniste du D-dodécapeptide [68Ga]. Cette technique présente des avantages par rapport à l’immunohistochimie conventionnelle et améliore l’efficacité de l’identification des patients appropriés qui bénéficieront d’un traitement par blocage des points de contrôle immunitaires.

Résumé

Le développement d’une thérapie par blocage des points de contrôle immunitaires basée sur la protéine de mort cellulaire programmée 1 (-1) et le ligand de mort programmée 1 (-L1) a révolutionné les thérapies contre le cancer au cours des dernières années. Cependant, seule une fraction des patients répond aux inhibiteurs de-1/-L1, en raison de l’expression hétérogène de-L1 dans les cellules tumorales. Cette hétérogénéité présente un défi dans la détection précise des cellules tumorales par l’approche couramment utilisée par l’immunohistochimie (IHC). Cette situation nécessite de meilleures méthodes pour stratifier les patients qui bénéficieront d’un traitement par blocage des points de contrôle immunitaires, afin d’améliorer l’efficacité du traitement. La tomographie par émission de positons (TEP) permet de visualiser en temps réel l’expression de-L1 dans l’ensemble du corps de manière non invasive. Par conséquent, il est nécessaire de développer des traceurs radiomarqués pour détecter la distribution de-L1 dans les tumeurs grâce à l’imagerie TEP.

Par rapport à leurs homologues L, les peptides dextrorotiques (D) ont des propriétés telles que la résistance protéolytique et des demi-vies métaboliques remarquablement prolongées. Cette étude a conçu une nouvelle méthode pour détecter l’expression de-L1 basée sur l’imagerie TEP de 68peptides D ciblés par-L1 marqués au Ga, un antagoniste du D-dodécapeptide (DPA), chez des souris porteuses de tumeurs. Les résultats ont montré que le [68Ga]DPA peut se lier spécifiquement aux tumeurs surexprimant-L1 in vivo, et ont montré une stabilité favorable ainsi qu’une excellente capacité d’imagerie, ce qui suggère que le [68Ga]DPA-PET est une approche prometteuse pour l’évaluation du statut-L1 dans les tumeurs.

Introduction

La découverte des protéines de point de contrôle immunitaire a été une percée dans le traitement des tumeurs et a conduit à des avancées majeures dans le développement de la thérapie de blocage des points de contrôle immunitaires1. La protéine de mort cellulaire programmée 1 (-1) et le ligand de mort programmée 1 (-L1) sont des cibles médicamenteuses potentielles avec plusieurs anticorps approuvés par la Food and Drug Administration (FDA). -1 est exprimé par les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs, telles que les lymphocytes T CD4+, CD8+ et les lymphocytes T régulateurs. -L1 est l’un des ligands-1, qui est surexprimé dans une variété de cellules tumorales 2,3. L’interaction entre-1 et-L1 inactive-1, supprimant ainsi la réponse immunitaire antitumorale4. Ces résultats suggèrent que l’inhibition de-L1 peut améliorer l’effet destructeur des cellules immunitaires et éliminer les cellules tumorales5. À l’heure actuelle, l’immunohistochimie chromogène (IHC) est l’approche la plus couramment utilisée pour identifier les patients les plus susceptibles de répondre à la thérapie par points de contrôle immunitaires 6,7. Cependant, en raison de l’expression hétérogène de-L1 dans les cellules tumorales, les résultats IHC des biopsies ne peuvent pas fournir d’informations précises sur l’expression de-L1 chez les patients8. Des études antérieures ont rapporté que seulement 20 à 40 % des patients bénéficient à long terme de la thérapie par blocage des points de contrôle immunitaires 1,9,10. Il est donc urgent de développer une nouvelle méthode pour contourner les résultats faussement négatifs causés par l’expression hétérogène de ces protéines de point de contrôle immunitaire.

La technologie d’imagerie moléculaire, telle que la tomographie par émission de positons (TEP), permet de visualiser en temps réel l’ensemble du corps de manière non invasive, et peut donc surpasser la méthode IHC conventionnelle 11,12,13. Les anticorps, les peptides et les petites molécules radiomarqués sont des traceurs prometteurs pour le suivi de l’expression de-L1 chez les patients atteints de cancer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. La FDA a approuvé trois anticorps monoclonaux thérapeutiques-L1 : l’avelumab, l’atezolizumab et le durvalumab26. Les traceurs immuno-TEP basés sur ces anticorps ont été bien documentés 27,28,29,30,31,32. Les essais cliniques de phase précoce ont révélé une valeur limitée pour l’application clinique, en raison de la pharmacocinétique défavorable30. Par rapport aux anticorps, les peptides présentent une élimination plus rapide du sang et des organes des organes sains, et peuvent être facilement modifiés chimiquement33. De multiples peptides ayant une forte affinité pour-1/-L1 ont été rapportés2 ; WL12 est un peptide signalé qui présente une liaison spécifique à-L134. Les traceurs radiomarqués, [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 et [18F]FPyWL12, ont montré une grande capacité de ciblage tumoral spécifique in vivo, ce qui permet de récolter des images de haute qualité de l’expression de-L1 dans les tumeurs 26,35,36,37. De plus, la première évaluation chez l’homme de WL12 radiomarqué a démontré que le [68Ga]WL12 (chélaté par NOTA) a un potentiel sûr et efficace pour l’imagerie tumorale clinique38. En raison de sa forte hydrophobicité et de sa forte absorption dans le foie sain, WL12 a une utilisation clinique limitée. D’autres peptides de radiomarquage, tels que TPP1 et SETSKSF, qui se lient spécifiquement à-L1, ont également montré une stabilité et une spécificité potentielles pour visualiser l’expression de-L1 dans le corps entier39,40. Cependant, les peptides non modifiés sont facilement dégradés par les protéases et sont rapidement métabolisés par le rein. Les peptides dextrogyres (D) ont été largement utilisés comme médiateurs efficaces, en raison de la faible stabilité des peptides (L) gauchers 41,42,43. Les D-peptides sont hyper-résistants à la dégradation protéolytique et ont des demi-vies métaboliques remarquablement prolongées. Par rapport à leurs homologues L, les peptides D présentent principalement des capacités de liaison spécifiques 44,45,46.

Cette étude a conçu une nouvelle méthode pour détecter l’expression de-L1, basée sur l’imagerie TEP d’un antagoniste du D-dodécapeptide (DPA) du peptide D ciblé par-L1 marqué au 68Ga, dans un modèle de souris porteur de tumeurs47. La stabilité du [68Ga]DPA a d’abord été étudiée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et dans du sérum de souris, après quoi l’affinité de liaison du [68Ga]DPA dans les tumeurs surexprimant-L1 a été testée. Par la suite, l’imagerie TEP a été réalisée dans des modèles de xénogreffe de glioblastome pour confirmer si le [68Ga]DPA était un traceur TEP idéal pour surveiller l’expression de-L1 dans les tumeurs. La combinaison de l’imagerie TEP et de la DPA fournit non seulement une nouvelle approche pour surmonter les défis associés à l’expression hétérogène de-L1, mais jette également les bases du développement de radiotraceurs à base de peptide D.

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Protocole

Les procédures expérimentales sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine de Nanjing ou par les Instituts nationaux des sciences et technologies quantiques. Les expériences sur les souris ont été strictement réalisées dans le strict respect des directives institutionnelles du Comité pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Synthèse peptidique

  1. Gonfler 100 mg de résine de 4-méthylbenzhydrylamine (MBHA) (capacité de charge de 0,37 mmol/g) dans 1 mL de N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP) pendant 30 min sous un léger bouillonnement de N2.
  2. Préparez un tampon de stock frais composé d’acides aminés protégés par Fmoc (équivalent 5,0), HCTU (équivalent 4,9) et DIPEA (équivalent 10,0) dans 1 mL de NMP et ajoutez-le à la résine (100 mg). Laisser la réaction d’accouplement se dérouler pendant 1,5 à 2 h.
  3. Préparer un tampon de déprotection composé de 50 % (vol/vol) de morpholine dans le NMP. Laver la résine (100 mg) 2 x 30 min avec 1 mL de tampon de déprotection à chaque lavage pour éliminer le groupe Fmoc sur le groupe amine. Lavez la résine avec du dichlorométhane (DCM ; 1 ml) pendant 1 min, retirez le DCM et lavez à nouveau la résine avec du NMP (1 ml) pendant encore 1 min. Ensuite, retirez le NMP et lavez à nouveau la résine avec du DCM pendant 1 min.
    REMARQUE : Toutes les procédures de lavage sont effectuées sous des bulles légères de N2 . Les procédures ci-dessus sont répétées jusqu’au dernier acide aminé.
  4. Pour ajouter de l’acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique (DOTA) au peptide, pré-activer le DOTA avec du chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N-éthylcarbodiimide (EDC· HCl) et le N-hydroxysuccinimide (NHS). Incuber le stock tampon de DOTA/EDC· HCl/NHS à un rapport molaire de 1 :1 :1 dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) pendant 3 h, avec une concentration finale de DOTA de 1 M. Ensuite, ajoutez le tampon de bouillon (1 mL) à la résine (100 mg) et laissez la réaction se poursuivre pendant 2 h avec un léger bouillonnement de N2.
    REMARQUE : L’acide 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacétique (NOTA) peut également être utilisé comme chélateur pour la complexation de 68Ga. Les mêmes procédures peuvent être utilisées pour le couplage NOTA.
  5. Rincez abondamment la résine par le haut à l’aide de DCM et appliquez un vide pour éliminer simultanément la solution de réaction résiduelle. Rincez la résine 3 fois avec du DCM (1,5 ml), puis rincez avec du MeOH (1,5 ml) pour rétrécir la résine. Mettez la résine sous azote pendant la nuit, ou sous vide poussé pendant au moins 4 h, jusqu’à ce que la résine devienne sèche.
  6. Placez la résine séchée contenant du peptide DPA dans un récipient en polypropylène de 2 mL muni d’un bouchon à vis. Ajouter le cocktail de clivage approprié (95/2,5/2,5 TFA/TIS/H2O en volume ; 1 mL/100 mg de résine) et fermer hermétiquement le récipient à l’aide d’un bouchon à vis. Agiter doucement la réaction sur un agitateur orbital dans une hotte à 20-25 °C pendant 2 h.
    ATTENTION : Préparez l’acide trifluoroacétique (TFA) dans une hotte en portant des vêtements de protection, en raison de sa nature hautement corrosive.
  7. Éliminez la majeure partie de l’AGT par évaporation sous azote dans la hotte. Précipiter les peptides en ajoutant de l’éther diéthylique (~1,5 mL/100 mg de résine).
  8. Vortex le mélange pour triturer les peptides et centrifuger à température ambiante (10 000 × g, 5 min). Versez délicatement le solvant hors du récipient. Répétez les étapes 1.7 à 1.8.
  9. Faites sécher le résidu à l’air libre dans le récipient ouvert pendant 10 min. Ajouter 50 % (vol/vol) d’acétonitrile aqueux et vortex pendant 1 à 2 s pour dissoudre les produits (1 mL/100 mg de résine).
  10. Retirez la résine en filtrant le mélange, puis lavez la résine 2 fois avec 0,2 mL d’acétonitrile aqueux à 50 % (vol/vol). Mélangez les filtrats pour une purification par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Utilisez les conditions HPLC suivantes. Colonne : YMC-Triat-C18 (4,6 mm de diamètre intérieur [i.d.], 150 mm, 5 mm) ; gradient de solvant : solvant A-eau déminéralisée ; solvant B-acétonitrile (0,1 % d’AGT) ; temps d’écoulement : 20 min, avec de l’acétonitrile de 10 % à 90 % ; débit : 1 mL/min.
  11. Congeler les éluants HPLC collectés pendant une nuit à -80 °C et lyophiliser (-50 °C et <1 pa). Pour le radiomarquage, dissoudre le peptide solide dans un tampon d’acétate de sodium (100 mM, pH 5,0) à une concentration finale de 1 mg/mL comme tampon stock.

2. Radiomarquage 68Ga

NOTE 68Ga a été produit à l’interne au Nanjing First Hospital (Nanjing, Chine) à l’aide d’un générateur de 68Ge/68Ga.

  1. Pipeter 5 μL de tampon de pâte dans un récipient en polypropylène de 1,5 mL muni d’un bouchon à vis. Ajouter 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL) dans le contenant.
  2. Faire vortex le mélange pendant 5 s. Mesurez le pH à l’aide de bandelettes de test de pH. Ajustez le pH à 4-4,5 avec du NaOH (0,1 M).
    REMARQUE : Un pH approprié est essentiel pour une complexation entre 68Ga et DOTA.
  3. Incuber la solution à température ambiante pendant 5 à 10 minutes. Soumettre le mélange réactionnel à la radio-HPLC pour l’analyse du rendement par radiomarquage dans les conditions suivantes : colonne : YMC-Triat-C18 (4,6 mm de diamètre intérieur, 150 mm, 5 mm) ; gradient de solvant : solvant A-eau déminéralisée ; solvant B-acétonitrile (0,1 % d’AGT) ; temps d’écoulement : 20 min, avec de l’acétonitrile de 10 % à 90 % ; débit : 1 mL/min.
    REMARQUE : La chromatographie sur couche mince (CCM) peut être utilisée comme autre approche pour examiner le rendement du radiomarquage. Le tampon d’élution CCM suggéré est de 0,1 M Na3C6H5O7, pH 4.

3. Test de stabilité du traceur

  1. Test de stabilité du traceur dans PBS
    1. Ajouter [68Ga]DPA (10 μL, 3,7 MBq, en NaOAc) au PBS (990 μL). Incuber à 37 °C pendant 1, 2 et 4 h en agitant légèrement.
    2. Prélever 200 μL de la solution à chaque point de temps. Injectez-le dans la radio-HPLC pour analyse.
  2. Stabilité du traceur dans le sérum de souris
    1. Ajouter [68Ga]DPA (10 μL, ~3,7 MBq, dans NaOAc) au sérum de souris (90 μL, fraîchement préparé). Incuber à 37 °C pendant 1, 2 et 4 h en agitant légèrement.
    2. Prélever 20 μL de la solution à chaque point de temps. Ajouter le MeCN et l’eau (100 μL, 1 :1, v/v).
    3. Centrifuger le mélange pendant 10 min (5 000 × g, 25 °C). Analyser le surnageant à l’aide d’une radio-HPLC.

4. Analyse de l’expression de-L1 par cytométrie en flux

  1. Préparer le milieu de culture en complétant le milieu RPMI-1640 avec 10 % (vol/vol) de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine (vol/vol). Remettre les cellules U87MG en suspension dans un milieu de culture et semer dans des plaques à 12 puits à une densité de 10à 5 cellules/puits. Placer les cellules dans un incubateur (5 % de CO2, 37 °C) et les mettre en culture pendant au moins 24 h sans les déranger.
  2. Laver les cellules avec 0,5 mL de PBS et ajouter 250 μL de trypsine-EDTA (0,25 %). Remettez les cellules dans l’incubateur (5% CO2, 37 °C) pendant 2 min.
  3. Ajouter 1 mL de milieu de culture pour arrêter la dissociation cellulaire. Ajouter du milieu dans les alvéoles pour les détacher de la boîte en pipetant de haut en bas et en les recueillant dans des tubes de 1,5 ml. Centrifuger les cellules pendant 5 min (100 × g).
  4. Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de PBS. Centrifuger les cellules pendant 5 min (100 × g). Répétez cette étape une fois de plus.
  5. Diluer l’anticorps-L1 conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % à 20 nmol/L. Ajouter aux cellules et incuber à 4 °C pendant 1 h.
  6. Centrifugez les cellules pendant 5 min (100 × g), puis lavez-les deux fois avec du PBS froid. Analysez les cellules-L1 positives à l’aide d’un cytomètre en flux et d’un logiciel d’analyse.

5. Immunocytochimie

  1. Ensemencer les cellules U87MG dans des boîtes de culture cellulaire à fond de verre (35 mm) à une densité de 2,5 × 105 cellules par puits. Lorsque la confluence est atteinte à 60 %, aspirer le milieu de culture et ajouter 1 mL de PBS. Agitez doucement plusieurs fois et aspirez. Effectuez l’étape de lavage 3x.
  2. Ajouter 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans la vaisselle. Placez les cellules à température ambiante et fixez-les pendant 30 min.
  3. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS. Ajouter 1 mL de BSA à 3 % (poids/vol, en PBS) et bloquer les cellules fixes pendant 2 h à température ambiante.
  4. Retirez les 3 % de BSA et incubez directement les cellules avec l’anticorps primaire anti--L1 (mAb, 1 :100, dilué dans 3 % de BSA) pendant une nuit à 4 °C.
    REMARQUE : Après avoir bloqué les cellules avec BSA, ne pas laver avec PBS.
  5. Lavez les cellules 3 fois avec un tampon BSA à 3 %. Incuber les cellules avec un anticorps secondaire anti-IgG Fc humain conjugué FITC (1 :500, dilué dans du PBS) pendant 1 h.
  6. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS. Ajouter 0,5 mL de DAPI (1 μg/mL) aux cellules et incuber à température ambiante pendant 1 h. Lavez les cellules colorées 3 fois avec du PBS et observez-les à l’aide d’un microscope à fluorescence confocale.

6. Expérience d’absorption et d’inhibition cellulaires

  1. Expérience d’absorption cellulaire
    1. Cultivez les cellules U87MG dans des plaques à 12 puits jusqu’à ce que la confluence soit atteinte à 80 %. Retirez le milieu et lavez les cellules avec 0,5 mL de PBS.
    2. Diluer le [68Ga]DPA dans un milieu frais jusqu’à une concentration de 74 KBq/mL. Ajouter 0,5 mL de tampon dilué [68Ga]DPA dans chaque puits.
    3. Incuber les cellules avec du [68Ga]DPA à 37 °C pendant différentes durées (10, 30, 40 et 120 min). Aspirez le milieu à l’aide d’une pipette. Lavez les cellules avec du PBS (0,5 ml) trois fois.
    4. Ajouter une solution de NaOH (0,5 M, 300 μL par puits) pour lyser les cellules. Après 30 s, recueillir les lysats cellulaires visqueux dans des tubes de 1,5 ml.
    5. Lavez l’assiette avec 0,4 mL de PBS deux fois. Recueillir la solution de lavage dans le tube de 1,5 ml ci-dessus.
    6. Démarrez l’ordinateur intégré du compteur gamma automatique ; Placez les tubes dans l’étagère intégrée. Après avoir chargé tous les échantillons sur le convoyeur, appuyez sur le bouton START. Les résultats sont calculés dans le logiciel interne. La lecture enregistre le nombre de décroissances corrélées par minute (CPM) de chaque tube.
  2. Essai de liaison compétitive
    1. Cultivez les cellules U87MG dans des plaques à 12 puits jusqu’à ce que la confluence soit atteinte à 80 %. Retirez le milieu et lavez les cellules avec 0,5 mL de PBS.
    2. Diluer le [68Ga]DPA dans un milieu frais jusqu’à une concentration de 74 KBq/mL. Dissoudre une quantité appropriée de composés BMS202 dans du DMSO à 10 % pour obtenir une concentration de 10 mM (400 μL).
    3. Diluer 4 μL de BMS202 de 10 mM dans 396 μL de PBS pour obtenir une concentration de 100 μM. Répétez cette étape pour obtenir différentes concentrations de BMS202 (1 μM, 10 nM, 100 pM et 1 pM).
    4. Ajouter 0,5 mL de tampon dilué [68Ga]DPA dans chaque puits (0,37 MBq par puits). Ajouter 5 μL de solutions BMS202 dans chaque puits (trois puits pour chaque concentration). Incuber les cellules dans un incubateur cellulaire à 37 °C pendant 120 min.
    5. Aspirez le milieu à l’aide d’une pipette. Lavez les cellules avec 3 x 0,5 mL de PBS.
    6. Ajouter la solution de NaOH (0,5 M, 300 μL par puits) pour lyser les cellules. Après 30 s, recueillir les lysats cellulaires visqueux dans des tubes de 1,5 ml. Lavez l’assiette avec 2 x 0,4 mL de PBS.
    7. Recueillir la solution de lavage dans le tube de 1,5 ml ci-dessus. Placez les tubes dans l’étagère intégrée du compteur gamma automatique.
    8. Suivez les mêmes procédures qu’à l’étape 6.1.6.

7. Imagerie TEP

REMARQUE : Effectuez une imagerie TEP des petits animaux à l’aide d’un micro-tomodensitomètre TEP qui fournit 159 sections axiales transversales espacées de 0,796 mm (centre à centre), avec un champ de vision horizontal de 10 cm et un champ de vision axial de 12,7 cm. Toutes les données collectées en mode liste sont organisées en sinogrammes tridimensionnels. Le Fourier est ensuite réassemblé en sinogrammes bidimensionnels (image × min : 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).

  1. Utilisez des souris nues BALB/C mâles âgées de 5 à 8 semaines dans cette étude. Prélever les cellules U87MG en suivant les étapes 4.1 à 4.4 et aspirer les cellules dans une seringue de 0,5 ml. Injecter les cellules par voie sous-cutanée chez les souris (1 × 106 cellules par tumeur, deux tumeurs par souris). Surveiller la croissance tumorale après l’injection jusqu’à ce que le volume de la tumeur soit de 100 à 300 mm3.
  2. Anesthésier les souris à l’aide de 1 % à 2 % (v/v) d’isoflurane (1 mL/min). Allumez l’appareil de chauffage et maintenez le lit de l’animal en PET à 37 °C.
  3. Placez les souris anesthésiées dans la bonne position sur le lit de l’appareil TEP. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse.
    ATTENTION : Gardez les souris en position couchée pour éviter la mort pendant l’analyse. Pendant tout le processus d’imagerie, administrer un débit d’isoflurane (1,0 mL/min) par le nez à l’aide d’un tube préinstallé.
  4. Ajustez la position du lit de l’animal via le panneau de commande. Injecter les traceurs (10-17 MBq/100-200 μL) par voie intraveineuse à l’aide d’un cathéter préinstallé.
  5. Création d’un flux de travail de numérisation sur un ordinateur hôte à l’aide du logiciel référencé (voir Table des matériaux) Créez un dossier d’étude et définissez le protocole d’acquisition selon le protocole du fabricant. Effectuez des scans dynamiques (60 min pour chaque souris) sur toutes les souris en mode liste 3D.
  6. Définir un protocole d’histogramme et un protocole de reconstruction suivant le protocole du fabricant. Utilisez le filtre de Hanning avec une coupure de Nyquist de 0,5 cycle/pixel pour reconstruire des images dynamiques TEP (25-30 min et 55-60 min) grâce à une rétroprojection filtrée. Générez des images de projection d’intensité maximale (MIP) pour toutes les souris.
  7. Combinez les protocoles dans un flux de travail et exécutez-le. Analysez les images tridimensionnelles résultantes à l’aide du logiciel, en suivant le protocole du fabricant.
    REMARQUE : Utilisez le logiciel de simulation pour sélectionner les volumes d’intérêt. La radioactivité est corrigée de la désintégration en fonction du temps d’injection et présentée comme le pourcentage de la dose totale d’injection/par gramme de tissu (% ID/g).

8. Biodistribution ex vivo

  1. Administrer [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 μL) aux souris nues BALB/C porteuses d’U87MG par injection dans la veine caudale. Anesthésier les souris avec 1 % à 2 % (v/v) d’isoflurane (1 mL/min), puis sacrifier trois souris par luxation cervicale après l’injection pendant 5, 30, 60 et 120 min.
    REMARQUE : Les personnes qui font la démonstration de cette procédure doivent être formées aux techniques de luxation cervicale pour s’assurer que la perte de conscience est rapidement induite. Cela garantira que les procédures d’euthanasie dans cette expérience sont toutes effectuées sans cruauté.
  2. Une fois la mort confirmée, ouvrez la paroi thoracique des souris. Ensuite, ouvrez le cœur. Utilisez une seringue de 1 ml pour prélever du sang ; presser le sang de la seringue dans un tube de dosage radioimmunologique (RIA) (13 mm de diamètre) pour le compteur gamma.
  3. Exciser les principaux organes et tumeurs et les placer dans des tubes RIA (13 mm de diamètre) pour le compteur gamma. Les principaux organes comprennent le sang total, le cœur, le thymus, le foie, la rate, les os, l’estomac, les reins, les muscles, les ganglions lymphatiques intestinaux, l’intestin grêle, le pancréas, les testicules, le cerveau et les poumons. Pesez tous les organes.
  4. Mesurer la radioactivité dans les organes prélevés à l’aide d’un compteur autogamma et corriger les valeurs par désintégration. Calculer le pourcentage de dose injectée par gramme de tissu humide (% ID/g).

9. Immunohistochimie

  1. Récupérez les mouchoirs en gliome et lavez-les 3 fois avec du PBS. Mettez les tissus frais dans du paraformaldéhyde à 4 % et fixez-les toute la nuit à 4 °C.
  2. Intégrez les tissus fixés dans de la paraffine et sectionnez-les sur une épaisseur de 10 μm. Placez les sections dans un incubateur (60 °C) et incubez pendant 2 h. Dépatisser et hydrater les sections en incubant pendant 10 min chacune dans les éléments suivants : xylène (deux fois), alcool absolu, 95 % d’alcool, 90 % d’alcool, 80 % d’alcool, 75 % d’alcool.
  3. Mettez les sections dans du citrate de sodium 0,01 M et chauffez-les à 92-95 °C. Maintenez la température pendant 40 min pour obtenir la récupération de l’antigène.
  4. Ajouter 200 μL de solutionH2O2 (3%) aux coupes et inactiver les endoperoxydases pendant 10 min à température ambiante. Bloquer les sites non spécifiques par un traitement à 3% de BSA pendant 2 h à température ambiante.
  5. Incuber les coupes dans l’anticorps anti--L1 primaire (mAb, 1 :100, dilué dans 3 % de BSA) pendant une nuit à 4 °C.
    REMARQUE : Après le blocage avec BSA, ne pas laver avec PBS.
  6. Lavez les sections 3 fois avec du PBS. Incuber les coupes avec l’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre marqué HRP (1 :500, dilué dans du PBS) à température ambiante pendant 1 h.
  7. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS. Ajouter 200 μL de solution de travail de 3,3-diaminobenzidine (DAB) (solution A : solution B : solution C = 1 :1 :18) aux coupes et incuber pendant 5 min dans l’obscurité.
  8. Lavez les sections 3 fois avec du PBS. Ajouter 500 μL de solution d’hématoxyline (100 %) et incuber pendant 5 min à température ambiante. Lavez les sections à l’eau pendant 30 s. Mettre les sections en solution de différenciation (alcool à 75% : HCL = 99 :1) pendant 30 s. Lavez les sections à l’eau pendant 1 min.
  9. Déshydrater les échantillons en incubant séquentiellement avec de l’alcool à 75 %, 80 % d’alcool, 90 % d’alcool, 95 % d’alcool, de l’alcool absolu et du xylène (deux fois) (10 min chacun). Montez toutes les sections à l’aide d’une résine neutre et observez-les au microscope optique.

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Résultats

[68Ga]Radiomarquage et stabilité de l’APD
Le peptide modèle, le DPA, est un antagoniste efficace de-L1. DOTA-DPA a été obtenu avec une pureté de >95% et un rendement de 68%. La masse de DOTA-DPA est observée expérimentalement à 1 073,3 ([M+2H]2+). 68 ansLe gallium est considéré comme un radionucléide approprié pour marquer les peptides pour l’imagerie TEP, et a donc été choisi pour cette étude. Pour radiomarquer le D...

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Discussion

Les étapes critiques décrites dans cette méthode comprennent le marquage efficace de 68Ga en DPA et le choix d’une fenêtre de temps appropriée pour l’imagerie TEP, qui doit correspondre parfaitement au schéma pharmacodynamique de DPA dans la tumeur.

Contrairement à l’IHC, l’imagerie TEP permet de détecter en temps réel l’expression de-L1 dans l’ensemble du corps de manière non invasive, ce qui permet de visualiser chaque zone positive d’une tumeur hétérogè...

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Déclarations de divulgation

Aucun intérêt concurrent n’est déclaré.

Remerciements

Cette étude a été financée par le Fonds de l’Institut central de recherche à but non lucratif de l’Académie chinoise des sciences médicales (n° 2022-RC350-04) et le Fonds d’innovation CAMS pour les sciences médicales (n° 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 et 2022-I2M-2-002).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA)Merck60239-18-168Ga  chelation
3,3-diaminobenzidine (DAB) KitSigma-AldrichD7304-1SETImmunohistochemistry
anti-PD-L1 monoclonal antibodyWuhan Proteintech17952-1-apImmunohistochemistry: primary antibody
BMS202Selleck1675203-84-5Competitive binding assay: inhibitor
BSAMerckV900933Immunofluorescent : blocking 
DAPIMerckD9542Immunofluorescent: staining of nucleus
Dichloromethane (DCM)Merck34856Solvent
DIPEAMerck3439Peptide coupling
EDC·HClMerckE6383Activation of DOTA
FBSGibco10099Cell culture: supplement
FITC-conjugated anti-human IgG Fc AntibodyBiolegend409310Immunofluorescent: secondary antibody
FITC-conjugated anti PD-L1 antibodyBiolegend393606Flow cytometry: direct antibody
HCTUEnergy ChemicalE070004-25gPeptide coupling
HRP labeled goat anti-rabbit antibodyServicebioGB23303Immunohistochemistry: secondary antibody
Hydroxysuccinimide (NHS)Merck130672Activation of DOTA
MeCNMerckPHR1551Solvent
MorpholineMerck8.06127Fmoc- deprotection
NMPMerck8.06072Solevent
ParaformaldehydeMerck30525-89-4Fixation of tissues
PBSGibco10010023Cell culture: buffer
Penicillin-streptomycin Gibco10378016Cell culture: supplement
RIA tubePolyLabP10301AAs tissue sample container
RPMI-1640 mediumGibco11875093Cell culture: basic medium
Sodium acetateMerck1.06264Salt for buffer
Trypsin-EDTAGibco25200056Cell culture: dissociation agent
U87MG cell lineProcell Life Science & Technology CoCL-0238Cell model
Equipment
68Ge/68Ga generatorIsotope Technologies Munich, ITMNot applicableGeneration of [68Ga]
Autogamma counterPerkin Elmer Wizard2Detection of radioactivity
Confocal fluorescent microscopyKeyenceObservation of immunofluorescent results
Flow cytometerBecton Dickinson, BDLSRIIMonitoring the PD-L1 positive cells
High-performance liquid chromatography (HPLC)SHIMAZULC-20AT Purification of DPA peptide
PET scannerSiemens Medical SolutionsInveon MultiModality SystemPET imaging
Optical microscopyNikon Eclipse E100Observation of immunohistochemistry results
Solid phase peptide synthesizerPromega Vac-Man Laboratory Vacuum ManifoldLOT#11101Synthesis of DPA-DOTA peptide
Software
ASIProSiemens Medical SolutionsNot applicableAnalysis of PET-CT results
FlowJoBecton Dickinson, BDFlowJo 7.6.1Analysis of the flow cytometer results
Inveon Acquisition Workplace (IAW)Siemens Medical SolutionsNot applicableManagement of PET mechine
PrismGraphpadPrism 8.0Analysis of the data 

Références

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