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Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Cet article démontre une méthode standardisée pour construire des sphéroïdes tumoraux tridimensionnels. Une stratégie d’observation des sphéroïdes et d’analyse d’apprentissage profond basée sur l’image à l’aide d’un système d’imagerie automatisé est également décrite.
Au cours des dernières décennies, en plus des cellules cultivées en monocouche, des sphéroïdes tumoraux tridimensionnels ont été développés comme un outil potentiellement puissant pour l’évaluation des médicaments anticancéreux. Cependant, les méthodes de culture conventionnelles n’ont pas la capacité de manipuler les sphéroïdes tumoraux de manière homogène au niveau tridimensionnel. Pour remédier à cette limitation, dans cet article, nous présentons une méthode pratique et efficace de construction de sphéroïdes tumoraux de taille moyenne. De plus, nous décrivons une méthode d’analyse basée sur l’image utilisant un logiciel d’analyse basé sur l’intelligence artificielle qui peut scanner la plaque entière et obtenir des données sur les sphéroïdes tridimensionnels. Plusieurs paramètres ont été étudiés. En utilisant une méthode standard de construction sphéroïde tumorale et un système d’imagerie et d’analyse à haut débit, l’efficacité et la précision des tests de médicaments effectués sur des sphéroïdes tridimensionnels peuvent être considérablement augmentées.
Le cancer est l’une des maladies les plus redoutées par les êtres humains, notamment en raison de son taux de mortalité élevé1. Au cours des dernières années, la possibilité de traiter le cancer a augmenté à mesure que de nouvelles thérapies ont été introduites 2,3,4,5. Des modèles in vitro bidimensionnels (2D) et tridimensionnels (3D) sont utilisés pour étudier le cancer en laboratoire. Cependant, les modèles 2D ne peuvent pas évaluer immédiatement et avec précision tous les paramètres importants qui indiquent une sensibilité antitumorale; Par conséquent, ils ne représentent pas pleinement les interactions in vivo dans les essais de pharmacothérapie6.
Depuis 2020, le marché mondial de la culture tridimensionnelle (3D) a été considérablement stimulé. Selon un rapport du NASDAQ OMX, la valeur mondiale du marché de la culture cellulaire 3D dépassera 2,7 milliards de dollars d’ici la fin de 2025. Par rapport aux méthodes de culture 2D, la culture cellulaire 3D présente des propriétés avantageuses, qui peuvent être optimisées non seulement pour la prolifération et la différenciation, mais aussi pour la survie à long terme 7,8. Par de tels moyens, les microenvironnements cellulaires in vivo peuvent être simulés pour obtenir une caractérisation plus précise de la tumeur, ainsi qu’un profilage métabolique, afin que les altérations génomiques et protéiques puissent être mieux comprises. Pour cette raison, les systèmes de test 3D devraient maintenant être inclus dans les opérations de développement de médicaments traditionnelles, en particulier celles axées sur le dépistage et l’évaluation de nouveaux médicaments antitumoraux. Les croissances tridimensionnelles de lignées cellulaires établies immortalisées ou de cultures cellulaires primaires dans des structures sphéroïdes possèdent des caractéristiques in vivo de tumeurs telles que l’hypoxie et la pénétration de médicaments, ainsi que l’interaction, la réponse et la résistance cellulaires, et peuvent être considérées comme un modèle rigoureux et représentatif pour effectuer un dépistage in vitro de médicaments 9,10,11.
Cependant, ces modèles de culture 3D souffrent également de plusieurs problèmes qui peuvent prendre un certain temps à résoudre. Les sphéroïdes cellulaires peuvent être formés à l’aide de ces protocoles, mais ils diffèrent par certains détails, tels que le temps de culture ou l’incorporation de gels12, de sorte que ces sphéroïdes cellulaires construits ne peuvent pas être bien contrôlés dans une plage de taille restreinte. La taille des sphéroïdes peut influencer la cohérence du test de viabilité et de l’analyse d’imagerie. Les microenvironnements de croissance et les facteurs de croissance varient également, ce qui peut conduire à des morphologies différentes en raison des différences de différenciation entre les cellules13. Il existe maintenant un besoin évident d’une méthode standard, simple et rentable pour construire tous les types de tumeurs avec des tailles contrôlées.
D’un autre point de vue, bien que des tests homogènes et des approches d’imagerie à haut contenu aient été développés pour évaluer la morphologie, la viabilité et le taux de croissance, le criblage à haut débit des modèles 3D reste un défi pour diverses raisons rapportées dans la littérature, telles que le manque d’uniformité dans la position, la taille et la morphologie des sphéroïdes tumoraux14,15,16.
Dans le protocole présenté ici, nous énumérons chaque étape de la construction de sphéroïdes tumoraux 3D et décrivons une méthode d’observation et d’analyse des sphéroïdes à l’aide d’un système d’imagerie à haut débit et à contenu élevé qui implique l’autofocus, l’auto-imagerie et l’analyse, entre autres caractéristiques avantageuses. Nous montrons comment cette méthode peut produire des sphéroïdes tumoraux 3D de taille uniforme qui conviennent à l’imagerie à haut débit. Ces sphéroïdes démontrent également une grande sensibilité au traitement médicamenteux du cancer, et les changements morphologiques dans les sphéroïdes peuvent être surveillés à l’aide d’une imagerie à haut contenu. En résumé, nous démontrons la robustesse de cette méthodologie comme moyen de générer des constructions tumorales 3D à des fins d’évaluation de médicaments.
1. Construction sphéroïde
2. Traitement de la toxicomanie
3. Viabilité des sphéroïdes
4. Observation des sphéroïdes et analyse de l’apprentissage profond à travers des images dans le test de dépistage de drogue
La figure 1A,B montre le processus utilisé pour construire des sphéroïdes tumoraux dans cette étude. Nous avons d’abord ensemencé les cellules dans une plaque de fond en U de 48 puits. Cette étape est presque la même que celle utilisée en culture cellulaire 2D. Nous avons conservé la plaque dans un incubateur commun avec de l’eau entourant les puits afin que les cellules déposées commencent à former des sphéroïdes dans un processus d’auto-assemblage. Dan...
Le microenvironnement joue un rôle important dans la croissance tumorale. Il peut affecter la fourniture de matrices extracellulaires, les gradients d’oxygène, la nutrition et l’interaction mécanique et, par conséquent, affecter l’expression des gènes, les voies de signalisation et de nombreuses fonctions des cellules tumorales 19,20,21. Dans de nombreux cas, les cellules 2D ne produisent pas de tels effets ou même p...
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Nous remercions tous les membres de nos laboratoires pour leurs commentaires critiques et leurs suggestions. Cette recherche a été soutenue par le projet clé de la Commission de la santé du Jiangsu (K2019030). La conceptualisation a été effectuée par C.W. et Z.C., la méthodologie a été effectuée par W.H. et M.L., l’enquête a été effectuée par W.H. et M.L., la conservation des données a été effectuée par W.H., Z.Z., S.X. et M.L., la préparation de l’ébauche originale a été effectuée par Z.Z., J.Z., S.X., W.H., et X.L., l’examen et la révision ont été effectués par Z.C., l’administration du projet a été effectuée par C.W. et Z.C., et l’acquisition du financement a été effectuée par C.W. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
3D gel | Avatarget | MA02 | |
48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
DMSO | sigma | D2650-100ML | |
Excel sofware | Microsoft office | ||
Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
Image J software | National Institutes of Health | ||
Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
PBS | Solarbio | P1020 | |
Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
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