Utilisation du clivage sous cibles et du test de marquage (CUT & Tag) dans la recherche sur le myoblaste chez la souris

Résumé

Les chercheurs novices dans le domaine de l’épigénétique trouveront que CUT&Tag est une alternative beaucoup plus facile aux tests ChIP. CUT&Tag a énormément bénéficié aux études épigénétiques sur des populations de cellules rares et primaires, générant des données de haute qualité à partir de très peu de cellules. Ce protocole décrit la réalisation de dosages H3K4me1 CUT&Tag sur des myoblastes de souris isolés des muscles des membres postérieurs de souris.

Résumé

Ce document de protocole vise à fournir aux nouveaux chercheurs tous les détails de l’utilisation de Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT & Tagmentation) pour profiler les emplacements génomiques des facteurs de liaison à la chromatine, des marques d’histones et des variantes d’histones. Les protocoles CUT&Tag fonctionnent très bien avec les myoblastes de souris et les cellules souches musculaires fraîchement isolées (MuSCs). Ils peuvent facilement être appliqués à de nombreux autres types de cellules tant que les cellules peuvent être immobilisées par des billes de Concanavalin-A. Par rapport à CUT&Tag, les tests d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) sont des expériences qui prennent beaucoup de temps. Les dosages ChIP nécessitent un prétraitement de la chromatine avant que le matériau chromatique puisse être utilisé pour l’immunoprécipitation. Dans la ChIP réticulée (X-ChIP), le prétraitement de la chromatine implique la réticulation et la sonication pour fragmenter la chromatine. Dans le cas de la ChIP native (N-ChIP), les chromatines fragmentées sont normalement obtenues par la digestion des nucléases micrococciques (MNase). La sonication et la digestion MNase introduisent toutes deux un certain biais dans les expériences ChIP. Les tests CUT&Tag peuvent être réalisés en moins d’étapes et nécessitent beaucoup moins de cellules que les ChIP, mais fournissent des informations plus impartiales sur les facteurs de transcription ou les marques d’histones à divers endroits génomiques. CUT&Tag peut fonctionner avec seulement 5 000 cellules. En raison de sa sensibilité plus élevée et de son signal de fond plus faible que les ChIP, les chercheurs peuvent s’attendre à obtenir des données de pointe fiables à partir de seulement quelques millions de lectures après le séquençage.

Introduction

Le test CUT&Tag a été inventé pour compenser certains défauts manifestes des ChIPs¹. Les deux principaux inconvénients des ChIPs sont 1) le biais introduit lors de la fragmentation de la chromatine et 2) l’incompétence à travailler avec un faible nombre de cellules. Les dosages X-ChIP reposent sur la sonication ou la digestion MNase pour obtenir des fragments de chromatine, tandis que la N-ChIP utilise principalement la digestion MNase pour obtenir des nucléosomes. La sonication montre un biais vers les emplacements de la chromatine détendus tels que les régions promotrinales², et apparemment, la digestion de la MNase fo....

Protocole

Les méthodes présentées dans ce manuscrit sont toutes approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du laboratoire de Guangzhou. Les souris utilisées pour générer les résultats représentatifs de ce manuscrit ont été hébergées et entretenues conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du laboratoire de Guangzhou.

1. Isolement du myoblaste des muscles des membres postérieurs de la souris (exemple d’utilisation d'1 souris)

1. Diluer l’acide acétique glacial avec du ddH₂O à 0,02 M et l’autoclaver.
2. Diluer le collagène (de la ....

Discussion

Le nombre spécifique de cellules requis dans une certaine réaction CUT&Tag dépend entièrement de l’enrichissement des marques/variantes d’histones ou des protéines de liaison à la chromatine qui doivent être testées. Normalement, pour des marques d’histones très enrichies telles que H3K4me1, H3K4me3 et H3K27ac, etc., 25 000 à 50 000 myoblastes sont tout à fait suffisants pour une réaction CUT&Tag. Cependant, certaines protéines rares de liaison à la chromatine peuvent nécessiter jusqu’à 250 000 ce.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	For library-making PCR reaction
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size