Étude des effets des polluants environnementaux inhalés sur la fonction olfactive chez la souris

Résumé

Cet article fournit une description détaillée de l’expérience de test d’aliments enterrés et de discrimination sociale des odeurs pour évaluer les effets de l’exposition aux polluants environnementaux inhalés sur la fonction olfactive chez la souris.

Résumé

L’altération olfactive est un problème de santé publique important et permet de prédire de manière indépendante le risque de maladies neurodégénératives. L’exposition aux polluants environnementaux inhalés peut altérer l’olfaction ; Il est donc urgent de disposer de méthodes permettant d’évaluer les effets de l’exposition aux polluants environnementaux inhalés sur l’olfaction. Les souris sont des modèles idéaux pour les expériences olfactives en raison de leur système olfactif et de leurs caractéristiques comportementales très développés. Pour évaluer les effets de l’exposition aux polluants environnementaux inhalés sur la fonction olfactive chez la souris, un test détaillé des aliments enfouis et une expérience de discrimination sociale des odeurs est fourni, y compris la préparation de l’expérience, la sélection et la construction des installations expérimentales, le processus de test et les indices de temps. Pendant ce temps, l’équipement de chronométrage, les détails opérationnels et l’environnement expérimental sont discutés pour assurer le succès du test. Le sulfate de zinc est utilisé comme traitement pour démontrer la faisabilité de l’approche expérimentale. Le protocole fournit un processus opérationnel simple et clair pour évaluer les effets des polluants environnementaux inhalés sur la fonction olfactive chez la souris.

Introduction

La déficience olfactive est devenue un problème de santé publique notable et est indépendamment associée à un risque accru de maladies neurodégénératives. Cette condition peut nuire au bien-être général, contribuer au développement de symptômes dépressifs et entraîner une diminution de la qualité de vie. Son impact est principalement observé dans l’altération de la perception de la nourriture, l’entrave à la communication sociale et l’augmentation des sentiments négatifs¹. Divers facteurs, notamment la maladie sinusale, l’infection des voies respiratoires supérieures et les lésions cérébrales traumatiques, ont été considérés comme des facteurs contribuant à la déficience olfactive chez l’homme². Notamment, les polluants environnementaux inhalables tels que les PM2,5, estimés entre 2% et 16%, pénètrent dans le corps par l’air inspiré, traversent la cavité nasale et atteignent des régions spécifiques dédiées à l’olfaction où ils se déposent 3,4,5,6,7. Des découvertes récentes indiquent que les polluants environnementaux inhalables, y compris les PM2,5 et l’ammoniac, peuvent en effet endommager les neurones sensoriels olfactifs ^8,9,10. Cependant, une validation supplémentaire est nécessaire pour déterminer si de tels dommages conduisent directement à un dysfonctionnement olfactif. Par conséquent, une évaluation méticuleuse des effets des polluants environnementaux inhalables sur la fonction olfactive est d’une importance particulière.

Actuellement, de nombreux laboratoires de recherche utilisent des souris comme modèle alternatif de vertébré pour des expériences comportementales visant à comprendre les changements dans la fonction olfactive 11,12,13,14. Les souris ont été choisies comme système modèle privilégié pour l’étude de la communication chimique des vertébrés, et elles présentent une sensibilité olfactive remarquable cruciale pour la recherche de nourriture et^{la communication sociale}. De plus, l’éventail en constante évolution d’outils permettant d’observer et d’influencer le comportement des souris a rendu cette espèce exceptionnellement attrayante pour la recherche sur la fonction olfactive¹⁶.

Dans cette étude, nous avons utilisé le test des aliments enterrés et l’expérience de discrimination sociale des odeurs pour évaluer l’altération olfactive dans un modèle murin exposé à des polluants environnementaux inhalables. Pour améliorer la précision de l’évaluation, nous avons opté pour la méthode la plus représentative pour évaluer la fonction olfactive. Nous avons systématiquement affiné cette méthode pour en assurer la simplicité et la clarté, ce qui nous a permis d’évaluer efficacement l’ampleur du dysfonctionnement olfactif induit par les polluants environnementaux inhalables.

Protocole

Nous avons utilisé des souris mâles C57BL/6J (âge : 6-8 semaines ; poids : 20-22 g) pour tous les tests comportementaux. Les souris ont été soumises à des conditions stables (c’est-à-dire une température de 23 ± 1 °C, une humidité de 55 % ± 5 % et un cycle lumière-obscurité de 12/12 h avec les lumières allumées à 7 h). Tous les tests comportementaux ont été effectués entre 10h00 et 17h00. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique du Comité professionnel des expériences sur les animaux de l’Université de Qingdao. Après une période d’acclimatation d’une semaine, toutes les souris ont été exposées à des polluants environnementaux inhalables.

1. Exposition aux polluants

1. Administration intranasale par instillation
   1. Dissoudre les polluants environnementaux inhalables dans une solution saline à 0,9 %. Utilisez une fois une solution de sulfate de zinc à 5 %, dont il a été démontré qu’elle provoque un dysfonctionnement olfactif¹⁷. Pour les souris témoins, administrer une solution saline normale à 0,9 %.
   2. Anesthésie la souris par injection intrapéritonéale de pentobarbital¹⁸ sodique et évalue la profondeur de l’anesthésie à l’aide du réflexe de pincement des orteils. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse. Placez la souris sur le dos sur une surface inclinée, la tête vers le bas.
   3. À l’aide d’un pistolet de pipetage, administrer 10 μL de la solution dans une narine de la souris, en laissant inhaler naturellement la solution dans la cavité nasale.
   4. Pour assurer le bien-être de la souris et prévenir toute gêne potentielle, répétez l’inhalation pour l’autre narine après un intervalle de 10 minutes.
   5. 3 jours après l’administration intranasale par instillation chez la souris, effectuez le test des aliments enterrés.

2. Test des aliments enterrés

1. Effectuez la privation de nourriture 18-24 h avant le test en retirant toutes les granulés de nourriture de la trémie alimentaire de la cage domestique. Changez les matériaux de litière pour les souris. Ne retirez pas la bouteille d’eau.
2. Disposez la table d’opération comme décrit ci-dessous.
   1. 1 h avant le début de l’essai, apportez la cage contenant les souris au bloc opératoire pour qu’elles se reposent.
   2. Aménagez la salle d’opération pendant cette période. Utilisez et marquez les cages de souris standard en PVC transparent comme A, car elles créent un environnement familier. Utilisez et marquez la cage d’essai comme B, qui est une cage d’écureuil standard en PVC transparent. Marquez la cage commune utilisée pour placer les souris après l’expérience comme cage C.
   3. Couvrez les cages A et B avec 3 cm de litière et mesurez-les à l’aide d’une règle. Disposez les cages côte à côte, avec une distance de 0,5 m entre chaque cage (figure 1).
   4. Définissez la zone d’expérimentation comme une zone d’un rayon de 2 m, le centre étant le centre des cages. Définissez la zone à l’extérieur de la portée de 2 m comme zone d’observation.
   5. Gardez la cage C et les cages contenant des souris non testées aussi loin que possible de la zone d’expérience.
3. Notez le temps nécessaire pour trouver de la nourriture comme décrit ci-dessous.
   1. Choisissez une position au hasard dans la cage B, enterrez la nourriture à 1 cm sous la surface de la litière et lissez la surface de la litière.
   2. Mettez la souris dans la cage A pendant 4 min. Transférez les souris dans la cage B à la fin du chronométrage, allumez l’appareil vidéo et retournez dans la zone d’observation.
   3. Lorsque la souris ramasse le bloc de nourriture avec sa patte avant, arrêtez l’enregistrement vidéo. Dans certains cas, on peut voir des souris manger la tête penchée sur la nourriture. Ce comportement indique également le succès de l’essai, même si la souris ne tient pas la nourriture avec sa patte avant.
   4. Enregistrez les données. Notez le temps écoulé entre le contact avec le tapis au fond de la cage B et la découverte de la nourriture pour chaque souris. Si les souris ne trouvent pas de nourriture après 4 minutes, enregistrez le temps de recherche comme un temps de retard de 240 s.
   5. Mettez la souris dans la cage C après le test.
   6. Retirez la nourriture de la cage B et mettez-la dans un sac scellé. Replacez la nourriture dans la cage B et testez la souris suivante après avoir changé le matériau de la litière, comme décrit ci-dessous.
      1. Pour les souris logées dans la même cage, testez avec le même ensemble de matériaux de litière dans la cage B. Pour les souris dans différentes cages, nettoyez la cage avec de l’alcool et remplacez les matériaux de litière.
   7. Ajoutez de la nourriture et de l’eau aux souris après l’expérience. Effectuez l’expérience de discrimination sociale des odeurs 1 jour plus tard.
      REMARQUE : Les masques doivent être portés tout au long du processus et les gants transparents doivent être changés une fois que chaque souris a terminé l’expérience pour éviter autant que possible les odeurs croisées. Gardez l’amplitude des mouvements aussi petite que possible pour éviter le stress de la souris.

3. Expérience de discrimination sociale des odeurs

1. Collecte d’urine
   1. Prélever séparément l’urine de souris mâles sexuellement matures et de souris femelles et aliquote dans des tubes en volumes égaux¹⁹. Emballez dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL avec 300 μL d’urine dans chaque tube.
   2. Conservez les échantillons à -80 ° C jusqu’à utilisation. Agitez les tubes pour répartir uniformément l’échantillon après décongélation. Ne décongelez pas et ne congelez pas l’échantillon à plusieurs reprises.
2. Disposez la table d’opération comme décrit ci-dessous.
   1. 1 h avant le début de l’essai, apportez la cage contenant les souris au bloc opératoire pour qu’elles se reposent.
   2. Disposez la salle d’opération pendant cette période comme décrit aux étapes 2.2.2 à 2.2.5.
3. Notez le temps nécessaire pour trouver de l’urine comme décrit ci-dessous.
   1. Faites une rainure avec du ruban adhésif autour de chacun des deux côtés larges de la cage B, suffisamment grande pour contenir le tube de la microcentrifugeuse contenant 300 μL d’urine mâle et femelle. Placez les tubes et gardez les deux couvercles de tube fermés pour l’instant.
   2. Mettez la souris dans la cage A et réglez un compte à rebours pendant 4 min. Ouvrez les deux tubes de la cage B à la fin du chronométrage.
   3. Transférez la souris en position médiane de la cage B, à la même distance des deux tubes, puis allumez l’équipement d’enregistrement vidéo et retirez-vous doucement et lentement vers la zone d’observation.
   4. Lorsque la souris renifle la paroi/la bouche du tube ou même à l’intérieur du tube, le tube est senti avec succès. À ce moment, appuyez sur le chronomètre et enregistrez le temps comme le temps de sentir le tube (M s), puis continuez à enregistrer le temps de séjour (X s) jusqu’à ce que la souris s’éloigne du tube.
   5. Continuez à chronométrer l’heure en reniflant l’autre tube. Lorsque la souris renifle la paroi/la bouche du tube ou même à l’intérieur du tube, le tube est senti avec succès. Appuyez sur le chronomètre et notez le temps qu’il a fallu pour sentir l’autre tube (N s), puis continuez à enregistrer le temps de séjour (Y s) jusqu’à ce que la souris s’éloigne du tube.
   6. Transférez la souris dans la cage C à la fin de l’expérience.
   7. Changez les tubes d’urine et le matériau de litière de la cage B après chaque test sur la souris. Mettez l’urine de rat utilisée dans un sac propre selon le sexe.
   8. Changez de gants et testez la souris suivante comme décrit ci-dessus.
4. Effectuez l’expérience dans un laboratoire sans odeur évidente. Évitez les produits personnels qui émettent de fortes odeurs. Portez des gants et des masques tout au long de la procédure pour éviter autant que possible la traversée des odeurs. Gardez l’amplitude des mouvements aussi petite que possible pour éviter le stress de la souris.

Résultats

Les polluants environnementaux inhalables altèrent la fonction olfactive chez la souris. Il a été démontré que le zinc atmosphérique émis par les incinérateurs et les véhicules à moteur est un polluant inhalé qui peut entraîner une inflammation allergique des poumons²⁰. Le sulfate de zinc est considéré comme l’un des composés typiques à l’origine d’un dysfonctionnement olfactif²¹. Par conséquent, nous utilisons du sulfate de zinc comme traitement pour...

Discussion

Cet article présente deux protocoles fondamentaux conçus pour l’évaluation rapide de l’altération olfactive chez la souris. Divers polluants environnementaux inhalables entraînent des niveaux distincts de dysfonctionnement olfactif chez la souris. Le test de la nourriture enterrée est utilisé pour évaluer la capacité à détecter les odeurs volatiles, tandis que l’expérience de discrimination des odeurs sociales évalue la capacité de l’animal à discerner et à différencier diverses odeurs sociales. ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-10 μL  adjustable micropipette	Eppendorf, Germany	3123000225	Intranasal instillation
0.9% saline solution	Solarbio	7647-14-5	Dissolve pollutants
Anhydrous zinc sulfate	Macklin	7733-02-0	Expose mice
Centrifuge tube (2 mL)	Biosharp Incorporated	BS-20-M	Place urine
Electronic balance	Changzhou Ohaus Co.	EX125DZH	Weight anesthetics and pollutants
GraphPad Prism	GraphPad Software	8.0.1	statistic analysis
Handheld Dust detector	TSI Incorporated	DuatTrak 8532	Inhalation-exposed mice
Video recording equipment	Apple Inc.	iPhone 6s Plus	The activity time of mice was recorded
Vortex mixer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.	Vortex-5	Mix solution