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Method Article
Dans cette étude, des hydrogels composites mimétiques nerveux ont été développés et caractérisés qui peuvent être utilisés pour étudier et capitaliser sur le comportement pro-régénératif des cellules souches dérivées du tissu adipeux pour la réparation des lésions de la moelle épinière.
Les lésions traumatiques de la moelle épinière (LME) induisent un déficit sensorimoteur permanent sous le site de la lésion. Il touche environ un quart de million de personnes aux États-Unis et représente un problème de santé publique incommensurable. Des recherches ont été menées pour fournir un traitement efficace ; cependant, la lésion médullaire est toujours considérée comme incurable en raison de la nature complexe du site de la blessure. Diverses stratégies, notamment l’administration de médicaments, la transplantation cellulaire et les biomatériaux injectables, sont étudiées, mais une seule stratégie limite leur efficacité pour la régénération. En tant que telles, les thérapies combinatoires ont récemment attiré l’attention et peuvent cibler les caractéristiques multidimensionnelles de la blessure. Il a été démontré que les matrices extracellulaires (MEC) peuvent augmenter l’efficacité de la transplantation cellulaire pour les lésions médullaires. À cette fin, des hydrogels 3D constitués de moelles épinières (dSC) et de nerfs sciatiques (dSN) décellularisés ont été développés à différents ratios et caractérisés. L’analyse histologique des dSC et des dSN a confirmé l’élimination des composants cellulaires et nucléaires, et les architectures tissulaires natives ont été conservées après la décellularisation. Par la suite, des hydrogels composites ont été créés à différents rapports volumétriques et soumis à des analyses de la turbidité, de la cinétique de gélification, des propriétés mécaniques et de la viabilité des cellules souches dérivées du tissu adipeux humain (hASC). Aucune différence significative dans les propriétés mécaniques n’a été observée entre les différents rapports d’hydrogels et de matrices de moelle épinière décellularisées. Les ASC humaines intégrées dans les gels sont restées viables tout au long de la culture de 14 jours. Cette étude fournit un moyen de générer des hydrogels combinatoires issus de l’ingénierie tissulaire qui présentent une ECM spécifique aux nerfs et des cellules souches mésenchymateuses pro-régénératives. Cette plateforme peut fournir de nouvelles informations sur les stratégies neuro-régénératives après une lésion médullaire avec des investigations futures.
Environ 296 000 personnes souffrent d’une lésion médullaire traumatique, et chaque année, environ 18 000 nouveaux cas de lésion médullaire surviennent aux États-Unis1. La lésion médullaire traumatique est généralement causée par des chutes, des blessures par balle, des accidents de voiture et des activités sportives et entraîne souvent une perte permanente de la fonction sensorimotrice sous le site de la blessure. Les dépenses estimées au cours de la vie pour le traitement des lésions médullaires varient entre un et cinq millions de dollars par individu, avec une espérance de vie nettement inférieure1. Pourtant, la lésion médullaire est encore mal comprise et largement incurable, principalement en raison de conséquences physiopathologiques complexes après la lésion2. Diverses stratégies ont été étudiées, notamment la transplantation cellulaire et les échafaudages à base de biomatériaux. Bien que la transplantation de cellules et de biomatériaux ait démontré son potentiel, la nature multidimensionnelle des lésions médullaires suggère que les approches combinatoires pourraient être plus bénéfiques3. En conséquence, de nombreuses stratégies combinatoires ont été étudiées et ont démontré une meilleure efficacité thérapeutique que les composants individuels. Cependant, d’autres études sont nécessaires pour fournir de nouveaux biomatériaux pour l’administration de cellules et de médicaments3.
Une approche prometteuse pour la fabrication d’hydrogels naturels est la décellularisation tissulaire. Le processus de décellularisation utilise des méthodes ioniques, non ioniques, physiques et combinatoires pour éliminer tout ou partie des matériaux cellulaires et nucléiques tout en préservant les composants ECM. En éliminant la totalité ou la plupart des composants cellulaires, les hydrogels dérivés de l’ECM sont moins immunoréactifs à l’hôte après l’implantation/l’injection4. Il y a plusieurs paramètres à mesurer afin d’évaluer la qualité des tissus décellularisés : l’élimination du contenu cellulaire/nucléique, les propriétés mécaniques et la préservation de l’ECM. Les critères suivants ont été établis pour éviter les réponses immunitaires indésirables : 1) moins de 50 ng d’ADN double brin (ADNdb) par mg de poids sec ECM, 2) moins de 200 pb de longueur de fragment d’ADN, et 3) presque ou pas de matériel nucléaire visible coloré au 4'6-diamidino-2-phénuylindole (DAPI)5. Les propriétés mécaniques peuvent être quantifiées par des essais de traction, de compression et/ou de rhéologie, et elles doivent être similaires au tissu d’origine6. De plus, la préservation des protéines peut être évaluée par protéomique ou par des tests quantitatifs axés sur les principaux composants des tissus décellularisés, par exemple, la laminine, le glycosaminoglycane (GAG) et le protéoglycane de sulfate de chondroïtine (CSPG) pour la moelleépinière7,8. Les hydrogels dérivés de l’ECM vérifiés peuvent être recellularisés avec différents types de cellules pour faciliter la thérapie cellulaire9.
Une variété de types de cellules, telles que les cellules de Schwann, les cellules engainantes olfactives, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) dérivées de la moelle osseuse et les cellules souches/progénitrices neurales, ont été étudiées pour la réparation des lésions médullaires 10,11,12. Cependant, l’utilisation clinique de ces cellules est limitée en raison de préoccupations éthiques, d’une intégration rare avec les cellules/tissus voisins, d’un manque de sources de tissus à haut rendement, d’une incapacité à s’auto-renouveler et/ou d’une capacité de prolifération limitée 13,14,15. Contrairement à ces types de cellules, les CSM humaines dérivées du tissu adipeux (hASC) sont un candidat intéressant car elles sont facilement isolées de manière peu invasive à l’aide de lipoaspirations, et un grand nombre de cellules peuvent être obtenues16. De plus, les hASC ont la capacité de sécréter des facteurs de croissance et des cytokines qui ont le potentiel de neuroprotecteur, d’angiogénétique, de cicatrisation des plaies, de régénération tissulaire et d’immunosuppression17,18,19,20,21.
Comme nous l’avons décrit, de nombreuses études ont été menées 22,23,24 et beaucoup d’enseignements en ont été tirés, mais des caractéristiques hétérogènes des lésions médullaires ont limité leur efficacité à promouvoir la récupération fonctionnelle. À ce titre, des approches combinatoires ont été proposées pour augmenter l’efficacité du traitement des lésions médullaires. Dans cette étude, des hydrogels composites ont été développés en combinant des moelles épinières décellularisées et des nerfs sciatiques pour une culture hASC tridimensionnelle (3D). La décellularisation réussie a été confirmée par des analyses histologiques et d’ADN, et différents ratios d’hydrogels composites nerveux ont été caractérisés par une cinétique de gélification et des tests de compression. La viabilité des hASC dans les hydrogels composites nerveux a été étudiée pour prouver que cet hydrogel peut être utilisé comme plate-forme de culture cellulaire 3D.
Les tissus porcins ont été obtenus commercialement, de sorte que l’approbation n’était pas requise par le comité d’éthique animale.
1. Décellularisation de la moelle épinière porcine (Temps estimé : 5 jours)
REMARQUE : Effectuez la décellularisation en utilisant les protocoles précédemment établis avec les modifications25,26. Toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité stérile à température ambiante, sauf indication contraire. Toutes les solutions doivent être filtrées stérilement à l’aide d’un filtre sur le dessus d’une bouteille (pores de 0,2 μm) dans des bouteilles autoclavées. Les procédures à effectuer à 37 °C peuvent être effectuées à l’intérieur d’un incubateur ou d’un four propre réglé à 37 °C.
2. Décellularisation du nerf sciatique porcin (Temps estimé : 5 jours)
REMARQUE : Effectuez la décellularisation en utilisant un protocole27 préalablement établi. Toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité stérile à température ambiante, sauf indication contraire. Toutes les solutions doivent être filtrées stérilement à l’aide d’un filtre sur le dessus d’une bouteille (pores de 0,2 μm) dans des bouteilles autoclavées. Les procédures à effectuer à 37 °C peuvent être effectuées à l’intérieur d’un incubateur ou d’un four propre réglé à 37 °C.
3. Digestion des tissus décellularisés et fabrication d’hydrogels composites (Temps estimé : 4 jours)
4. Vérification de la décellularisation
5. Caractérisation des hydrogels composites
6. Culture tridimensionnelle d’ASC humains dans des hydrogels de composites nerveux
Des tissus décellularisés ont été préparés selon des protocoles préalablement établis avec de légères modifications26,27. Après la décellularisation, la lyophilisation et la digestion, des hydrogels composés pour les nerfs à des rapports de SN :SC = 2:1, 1:1, 1:2 et des hydrogels de moelle épinière seulement ont été fabriqués (Figure 1). L’élimination des composants nucléaires...
Il est largement admis que la physiopathologie des lésions médullaires est complexe et multidimensionnelle. Même si des thérapies uniques telles que la transplantation cellulaire, l’administration de médicaments et les biomatériaux ont chacune fourni des informations précieuses sur les lésions médullaires, la nature complexe des lésions médullaires peut limiter leur efficacité individuelle 28,29,30,31.
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu par la Fondation PhRMA et les National Institutes of Health par le biais du numéro de prix P20GM139768 et R15NS121884 attribué à YS. Nous tenons à remercier le Dr Kartik Balachandran et le Dr Raj Rao du Département de génie biomédical de l’Université de l’Arkansas de nous avoir permis d’utiliser leur équipement. Nous tenons également à remercier le Dr Jin-Woo Kim et M. Patrick Kuczwara du Département de génie biologique et agricole de l’Université de l’Arkansas pour leur formation sur le rhéomètre.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonate inner salt | Sigma-Aldrich | D4266 | Used during sciatic nerve decellularization, SB-10 |
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propane sulfonate | Sigma-Aldrich | H6883 | Used during sciatic nerve decellularization, SB-16 |
AlamarBlue reagent | Fisher Scientific | DAL1100 | Used during AlamaBlue cell viabiiltiy test |
Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C3667 | Used during sciatic nerve decellularization |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Deoxyribonuclase | Sigma-Aldrich | D4263 | Used during sciatic nerve decellularization |
Disodium hydrogen phosphate heptahydrate | VWR | BDH9296 | Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer |
DNeasy Blood & Tissue kit | Qiagen | 69506 | Used during DNA analysis |
Dpx Mountant for histology,slide mounting medium | Sigma-Aldrich | 6522 | Used during H&E staining |
Eosin | Sigma-Aldrich | HT110216 | Used during H&E staining |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | Used during H&E staining |
Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich | G6257 | Used during PDMS surface functionalization |
hASC growth media | Lonza | PT-4505 | Used to culture hASCs, containing of fetal bovine serum and penicilin/streptomycin |
Hematoxylin | VWR | 26041-06 | Used during H&E staining |
human adipose-derived stem cell | Lonza | PT-5006 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | Used to digest decellularizied tissues and adjust pregels solutions |
M199 media | Sigma-Aldrich | M0650 | Used to dilute pregels to desired concentration |
Optimal cutting temperatue compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Pepsin | Sigma-Aldrich | P7000 | Used to digest decellularized tissues |
Peracetic acid | Lab Alley | PAA1001 | Used during spinal cord decellularization |
Phosphate buffered saline (PBS) | VWR | 97062-948 | |
Plate reader | BioTek Instruments | Synergy Mx | |
Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 181978 | Used during PDMS surface functionalization |
Porcine sciatic nerve | Tissue Source LLC | Live pigs, with no identifiable information and no traceability details | |
Porcine spinal cord | Tissue Source LLC | Live pigs, with no identifiable information and no traceability details | |
QuantiFluor dsDNA system | Promega | E2670 | Used to analyze DNA contents |
Rheometer | TA Instruments | DHR 2 | |
Rugged rotator | Glas-co | 099A RD4512 | Used during spinal cord decellularization |
Sodium chloride (NaCl) | VWR | BDH9286 | Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer |
sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | VWR | BDH9298 | Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer |
Sodium hydroxide solution (NaOH) | Sigma-Aldrich | 415443 | Used to adjust pregels solutions |
SU-8 | Kayaku advnaced materials | SU8-100 | Used to coat silicon wafer |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Used during spinal cord decellularization |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW | 1317318 | Polydimethylxiloxane (PDMS) base and curing agent |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Used during spinal cord decellularization |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | Used during hASC work and during spinal cord decellularization |
Tube revolver rotator | Thermo Fisher | 88881001 | Used during sciatic nerve decellularization |
Xylene | VWR | MK866816 | Used during H&E staining |
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