JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании были разработаны и охарактеризованы нервамиметические композитные гидрогели, которые могут быть использованы для изучения и извлечения выгоды из прорегенеративного поведения стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для восстановления травм спинного мозга.

Аннотация

Травматическое повреждение спинного мозга (ТСМ) вызывает постоянный сенсомоторный дефицит ниже места повреждения. Он затрагивает примерно четверть миллиона человек в США и представляет собой неизмеримую проблему общественного здравоохранения. Были проведены исследования для обеспечения эффективной терапии; тем не менее, ТСМ по-прежнему считается неизлечимой из-за сложного характера места повреждения. Исследуются различные стратегии, включая доставку лекарств, трансплантацию клеток и инъекционные биоматериалы, но только одна стратегия ограничивает их эффективность для регенерации. Таким образом, в последнее время внимание привлекли комбинаторные методы лечения, которые могут быть нацелены на многогранные особенности травмы. Было показано, что внеклеточные матрицы (ВКМ) могут повышать эффективность трансплантации клеток при ТСМ. С этой целью были разработаны и охарактеризованы 3D-гидрогели, состоящие из децеллюляризованных спинных мозгов (dSC) и седалищных нервов (dSNs) в различных соотношениях. Гистологический анализ dSCs и dSN подтвердил удаление клеточных и ядерных компонентов, а нативные тканевые архитектуры были сохранены после децеллюляризации. После этого были созданы композитные гидрогели в различных объемных соотношении и подвергнуты анализу кинетики мутного гелеобразования, механических свойств и жизнеспособности встроенных стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека (hASC). Не было обнаружено существенных различий в механических свойствах между различными соотношениями гидрогелей и децеллюляризованных матриц спинного мозга. ASC человека, встроенные в гели, оставались жизнеспособными в течение 14-дневной культуры. Это исследование предоставляет средства для создания тканеинженерных комбинаторных гидрогелей, которые представляют собой нервно-специфические ВКМ и прорегенеративные мезенхимальные стволовые клетки. Эта платформа может дать новое представление о нейрорегенеративных стратегиях после ТСМ с будущими исследованиями.

Введение

Около 296 000 человек страдают от травматической ТСМ, и каждый год в США происходит около 18 000 новых случаев ТСМ1. Травматическая ТСМ обычно вызывается падениями, огнестрельными ранениями, автомобильными авариями и занятиями спортом и часто приводит к необратимой потере сенсомоторной функции ниже места травмы. Предполагаемые пожизненные затраты на лечение ТСМ варьируются от одного до пяти миллионов долларов на одногочеловека, при этом ожидаемая продолжительность жизни значительно ниже. Тем не менее, ТСМ все еще плохо изучена и в значительной степени неизлечима, в основном из-за сложных патофизиологических последствий после травмы. Были исследованы различные стратегии, включая трансплантацию клеток и каркасы на основе биоматериалов. В то время как трансплантация клеток и биоматериалов продемонстрировала свой потенциал, многогранный характер ТСМ предполагает, что комбинаторные подходы могут бытьболее полезными. В результате было исследовано множество комбинаторных стратегий, которые продемонстрировали лучшую терапевтическую эффективность, чем отдельные компоненты. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы получить новые биоматериалы для доставки клеток и лекарств3.

Одним из перспективных подходов к производству натуральных гидрогелей является децеллюляризация тканей. В процессе децеллюляризации используются ионные, неионные, физические и комбинаторные методы для удаления всех или большинства клеточных и нуклеиновых материалов с сохранением компонентов ВКМ. Удаляя все или большую часть клеточных компонентов, гидрогели, полученные из ВКМ, менее иммунореактивны для хозяина после имплантации/инъекции. Для оценки качества децеллюляризованных тканей необходимо измерить несколько параметров: удаление клеточного/нуклеинового содержимого, механические свойства и сохранность ВКМ. Для предотвращения неблагоприятных иммунных реакций были установлены следующие критерии: 1) менее 50 нг двухцепочечной ДНК (дцДНК) на мг сухого веса ВКМ, 2) длина фрагмента ДНК менее 200.о. и 3) почти или без видимого ядерного материала, окрашенного 4'6-диамидино-2-фенуилиндолом (DAPI)5. Механические свойства могут быть количественно оценены с помощью испытаний на растяжение, сжатие и/или реологические испытания, и они должны быть аналогичны исходной ткани6. Кроме того, сохранение белка может быть оценено с помощью протеомики или количественных анализов, сосредоточенных на основных компонентах децеллюляризированных тканей, например, ламинине, гликозаминогликане (ГАГ) и хондроитина сульфатном протеогликане (CSPG) для спинного мозга 7,8. Проверенные гидрогели, полученные из ВКМ, могут быть рецеллюляризированы с различными типами клеток для помощи в клеточной терапии9.

Различные типы клеток, такие как шванновские клетки, обонятельные оболочечные клетки, мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из костного мозга, и нейральные стволовые/прогениторные клетки, были изучены для репарации ТСМ 10,11,12. Тем не менее, клиническое использование этих клеток ограничено из-за этических проблем, редкой интеграции с соседними клетками/тканями, отсутствия тканевых источников для высокой продуктивности, неспособности к самообновлению и/или ограниченной пролиферативной способности 13,14,15. В отличие от этих типов клеток, МСК, полученные из жировой ткани человека (hASCs), являются привлекательными кандидатами, поскольку они легко выделяются минимально инвазивным способом с использованием липоаспиратов, иможно получить большое количество клеток. Кроме того, hASC обладают способностью секретировать факторы роста и цитокины, которые обладают потенциалом нейропротекторного, ангиогенетического, заживления ран, регенерации тканей и иммуносупрессии 17,18,19,20,21.

Как было описано, было проведено множество исследований 22,23,24, и из них было многому научено, но гетерогенные характеристики ТСМ ограничили их эффективность в содействии функциональному восстановлению. Таким образом, были предложены комбинаторные подходы для повышения эффективности лечения ТСМ. В этом исследовании композитные гидрогели были разработаны путем объединения децеллюляризованных спинного мозга и седалищных нервов для трехмерной (3D) культуры hASC. Успешная децеллюляризация была подтверждена гистологическим и ДНК-анализами, а различные соотношения нервных композитных гидрогелей были охарактеризованы кинетикой гелеобразования и компрессионными тестами. Жизнеспособность hASC в нервных композитных гидрогелях была исследована, чтобы доказать, что этот гидрогель может быть использован в качестве платформы для 3D-культивирования клеток.

протокол

Свиные ткани были получены коммерческим путем, поэтому одобрение комитета по этике животных не требовалось.

1. Децеллюляризация спинного мозга свиней (Расчетное время: 5 дней)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте децеллюляризацию с использованием ранее установленных протоколов с модификациями25,26. Все процедуры должны проводиться в стерильном шкафу биобезопасности при комнатной температуре, если не указано иное. Все растворы должны быть стерильно отфильтрованы с помощью бутылочного фильтра (размер пор 0,2 мкм) в автоклавные флаконы. Процедуры, проводимые при температуре 37 °C, можно проводить в инкубаторе или в чистой духовке, настроенной на 37 °C.

  1. Приготовление растворов для децеллюляризации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы рассчитаны на 1 л. Пользователям может потребоваться отрегулировать конечный требуемый объем в соответствии с их экспериментальными потребностями.
    1. Разбавьте 500 мл 0,05% трипсина/этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с 500 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) до получения 0,025% трипсина/ЭДТА.
    2. Разбавьте 300 мл 10% Triton X-100 с 700 мл PBS, чтобы получить 3% Triton X-100. Смешайте 0,56 г NaCl, 1,31 г2PO4H2O и 10,85 г HNa2O4P·7H2O в 1 л деионизированной воды для получения 100 мМ Na/50 мМ фос-буфера.
    3. Смешайте 32,4 г сахарозы с 1 л деионизированной воды, чтобы получилась 1 М сахарозы. Смешайте 40 г дезоксихолата натрия (SD) с 1 л деионизированной воды до получения 4% раствора SD. Разведите 6,7 мл 15% надуксусной кислоты с 993,3 мл 4% этанола.
  2. Подготовка спинного мозга свиньи
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спинной мозг поставлялся в замороженном виде без какого-либо раствора и хранился при температуре -80 °C до использования.
    1. Разморозьте спинной мозг при 4 °C в холодильнике в течение 18-24 ч до децеллюляризации. С помощью стерильных ножниц аккуратно удалите твердую мозговую оболочку.
    2. Разрежьте спинной мозг на небольшие кусочки (длиной примерно 1 см). Поместите одну штуку в пробирку объемом 15 мл или максимум три штуки в пробирку объемом 50 мл.
  3. Децеллюляризация спинного мозга
    ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого этапа растворы децеллюляризации вручную наливаются в большую мензурку, которую нужно выбросить. Небольшое автоклавируемое ситечко из нержавеющей стали можно использовать для удаления растворов децеллюляризации без потери тканей, необходимых для каждого этапа. Спинной мозг возбуждался при 83 об/мин, если не указано иное.
    1. Промывайте спинной мозг деионизированной водой в течение 18-24 часов при температуре 4 °C и 60 об/мин.
    2. Промывайте спинной мозг 0,025% трипсином/ЭДТА в течение 1 ч при 37 °C и 40 об/мин. Затем промойте спинной мозг PBS в течение 15 минут, 2 раза.
    3. Промывайте спинной мозг 3% Triton X-100 в течение 2 часов. Промойте спинной мозг 100 мМ Na/50 мМ фос-буфером в течение 15 мин, 2 раза.
    4. Промывайте спинной мозг 1 М сахарозой в течение 1 ч. Затем промойте спинной мозг деионизированной водой в течение 1 часа.
    5. Промойте спинной мозг 4% SD в течение 2 часов. Затем промойте спинной мозг фосовым буфером 100 мМ Na/50 мМ в течение 15 мин, 2 раза.
    6. Промыть спинной мозг 0,1% надуксусной кислотой в 4% этаноле в течение 4 ч. Затем промывайте спинной мозг PBS в течение 1 часа.
    7. Промывайте спинной мозг деионизированной водой в течение 1 ч, 2х. Затем промывайте спинной мозг PBS в течение 1 часа.
    8. Лиофилизировать спинной мозг при температуре 0,01 мбар и -56 °C в течение 3 дней и хранить в сухом виде до использования.

2. Децеллюляризация седалищного нерва свиньи (Расчетное время: 5 дней)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните децеллюляризацию с использованием ранее установленного протокола27. Все процедуры должны проводиться в стерильном шкафу биобезопасности при комнатной температуре, если не указано иное. Все растворы должны быть стерильно отфильтрованы с помощью бутылочного фильтра (размер пор 0,2 мкм) в автоклавные флаконы. Процедуры, проводимые при температуре 37 °C, можно проводить в инкубаторе или в чистой духовке, настроенной на 37 °C.

  1. Приготовление растворов для децеллюляризации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы рассчитаны на 1 л. Пользователям может потребоваться отрегулировать конечный требуемый объем в соответствии с их экспериментальными потребностями.
    1. Приготовьте фос-буфер с концентрацией 50 мМ Na/10 мМ, смешав 1,86 г NaCl, 0,262 г d2PO4H2O и 2,17 г HNa2O4P·7H2O в 1 л деионизированной воды.
    2. Приготовьте 125 мМ раствор сульфобетаина-10 (SB-10), смешав 38,4 г SB-10 с 1 л 50 мМ Na/10 мМ фос-буфера.
    3. Приготовьте 3 % SD/0,6 мМ раствор сульфобетаина-16 (SB-16) путем смешивания 30 г SD и 0,24 г SB-16 в 1 л 50 мМ Na/10 мМ фос-буфера.
  2. Препарирование седалищного нерва свиньи
    ПРИМЕЧАНИЕ: Седалищные нервы поставлялись в замороженном виде с PBS и хранились при температуре -80 °C до использования.
    1. Разморозьте седалищный нерв при 4 °C в холодильнике за 18-24 часа до децеллюляризации.
    2. Разрежьте седалищный нерв на небольшие кусочки (длиной примерно 1 см). Поместите одну штуку в пробирку объемом 15 мл или максимум три штуки в пробирку объемом 50 мл.
  3. Децеллюляризация седалищного нерва
    ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого этапа растворы децеллюляризации вручную заливаются в большой стакан, который нужно выбросить, а небольшое автоклавируемое ситечко из нержавеющей стали может быть использовано для удаления растворов децеллюляризации без потери тканей, необходимых для каждого этапа. Седалищный нерв возбуждался при 15 об/мин, если не указано иное.
    1. Промывайте седалищный нерв деионизированной водой в течение 7 ч. Затем промойте седалищный нерв 125 мМ сульфобетаином-10 (SB-10) в 50 мМ Na/10 мМ фос-буфере в течение 18 ч.
    2. Промойте седалищный нерв 100 мМ Na/50 мМ фос-буфером в течение 15 минут. Затем промойте седалищный нерв 3% SD/0,6 мМ сульфобетаина-16 (SB-16) в 50 мМ Na/10 мМ фос-буфере в течение 2 ч.
    3. Промойте седалищный нерв 100 мМ Na/50 мМ фос-буфером в течение 15 мин, 3 раза. Затем промойте седалищный нерв 125 мМ SB-10 в 50 мМ Na/10 мМ фос-буфере в течение 7 ч.
    4. Промойте седалищный нерв 100 мМ Na/50 мМ фос-буфером в течение 15 минут. Затем промойте седалищный нерв 3% SD/0,6 мМ SB-16 в 50 мМ Na/10 мМ фос-буфере в течение 1,5 ч.
    5. Промойте седалищный нерв фос-буфером 50 мМ Na/10 мМ в течение 15 мин, 3 раза. Затем промойте седалищный нерв 75 Ед/мл дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) в течение 3 ч без взбалтывания.
    6. Промойте седалищный нерв фос-буфером 50 мМ Na/10 мМ в течение 1 ч, 3 раза. Затем промойте седалищный нерв 0,2 Ед/мл хондроитиназы ABC в течение 16 ч без перемешивания при 37 °C.
    7. Промывайте седалищный нерв PBS в течение 3 ч, 3х. Лиофилизируйте седалищный нерв при температуре 0,01 мбар и -56 °C в течение 3 дней и храните в сухом виде до использования.

3. Расщепление децеллюляризованных тканей и изготовление композитных гидрогелей (Расчетное время: 4 дня)

  1. Измельчите или измельчите децеллюляризированные ткани в порошок с помощью ножниц или гомогенизатора. Стерилизуйте инструменты для измельчения или измельчите салфетки с помощью автоклава при температуре 121 °C в течение 45 минут. Также применим метод окиси этилена.
  2. Расщепляют ткани отдельно в 0,01 Н растворе соляной кислоты (HCl), содержащем 1 мг/мл пепсина в концентрации 15 мг/мл. Расчетный вес децеллюляризованного спинного мозга и седалищного нерва составляет 50-100 мг и 100-150 мг за штуку соответственно.
  3. Поместите магнитный стержень и перемешивайте при 500 об/мин и 4 °C в течение не менее 4 дней, чтобы получить прегельные растворы.
  4. Смешайте прегель седалищного нерва и спинного мозга в следующих объемных соотношениях: 2:1, 1:1 и 1:2. Отрегулируйте pH 7,4 с помощью 1 N гидроксида натрия (NaOH) и HCl и разбавьте до желаемой концентрации с помощью среды M199 и 1x PBS. Выдерживать при 37 °C в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте NaOH по 1 мкл за один раз. Среду M199 можно использовать в качестве индикатора pH, так как она становится светло-розовой при pH 7,4, но для подтверждения уровня pH следует использовать полоски pH.

4. Верификация децеллюляризации

  1. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E; Расчетное время: 8 дней)
    ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого этапа полоскания растворы вручную выливаются в большую мензурку, которую нужно выбросить.
    1. Зафиксировать свежий и децеллюляризированный спинной мозг и седалищный нерв в 3,7% формальдегиде при 4 °C в течение 18 часов. Поместите одну деталь в пробирку объемом 15 мл.
    2. Удалите формальдегид и поместите салфетки в 10% сахарозу на 1 сутки. Удалите 10% сахарозу и поместите салфетки в 30% сахарозу на 6 дней.
    3. Заполните криомолд соответствующего размера с оптимальной температурой резки (OCT) наполовину. Поместите децеллюляризованные ткани, накройте их ОКТ и дайте им впитаться в течение 1 суток.
    4. Через 1 сутки заморозьте салфетки на ночь при температуре -80 °C. Криосекция тканей толщиной 10 мкм с помощью криостата.
    5. Смойте 1x PBS в течение 5 мин, 2x. Затем смойте водой из-под крана в течение 5 минут.
    6. Окрашивать раствором гематоксилина в течение 1 мин. Смыть водопроводной водой в течение 1 минуты, 3 раза.
    7. Окрашивать раствором эозина в течение 1 мин. Промыть 95% этанолом в течение 1 мин, 2x и 100% этанолом в течение 1 мин, 3x.
    8. Смыть ксилолом в течение 1 мин, 2 мин, а затем 1 мин. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение 5 минут.
    9. С помощью ватного тампона капните 3-4 капли раствора монтировочного полистирола дибутилфталата (DPX) на предметные стекла. Поместите покровные стекла поверх слайдов, покрытых DPX. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи.
  2. Анализ ДНК (Расчетное время: 1 час)
    1. Взвесьте децеллюляризованные и лиофилизированные ткани. Изолируйте и количественно оцените ДНК с помощью коммерчески доступных наборов в соответствии с инструкциями производителя.

5. Характеристика композитных гидрогелей

  1. Тест на мутность гелеобразования (расчетное время: 1 час)
    1. Поместите по 100 мкл растворов прегеля в каждую лунку 96-луночного планшета на льду. Считывание поглощения на длине волны 405 нм каждые 2 мин в течение 45 мин с помощью считывателя пластин.
    2. Рассчитайте нормализованное поглощение с помощью следующего уравнения:
      (Поглощение -Начальное поглощение) / (Максимум поглощения -Начальное поглощение)
    3. Рассчитайте наклон кривой и время достижения 50% и 95% гелеобразования, t1/2 и t95 соответственно.
  2. Испытание на сжатие (расчетное время: 1 минута на гидрогель)
    1. Изготавливают композитные гидрогели в концентрации 12 мг/мл диаметром 8 мм и высотой 2 мм.
    2. Используйте реометр для сжатия образцов с нагрузкой 250 Н между параллельными пластинами из нержавеющей стали со скоростью деформации 10% от высоты образца/мин. Программное обеспечение, которое предоставляет показания реометра, предоставит кривую напряжения-деформации, прикладывая силу и измеряя деформацию до тех пор, пока гидрогели не сломаются.
    3. Вычислите модуль Юнга по наклону линейной области кривых зависимости напряжения-деформации.

6. Трехмерная культура ИСС человека в нервных композитных гидрогелях

  1. Подготовка трехмерной (3D) платформы (Расчетное время: 3 часа)
    1. Травить кремниевую пластину с помощью фоторезиста SU-8 для получения круглых узоров глубиной 200 мкм и диаметром 4 мм.
    2. Смешайте основу полидиметилсилоксана (PDMS) и отвердитель в соотношении 10:1. Вылейте смесь на силиконовую пластину и оставьте на 20 минут, чтобы удалить все пузырьки, образующиеся при смешивании основы PDMS и отвердителя.
    3. Поставьте в духовку и выдерживайте в течение 2 часов при температуре 70 °C. Дефолдируйте отвержденный лист PDMS и выдавите его с помощью биопсийного пуансона диаметром 8 мм, чтобы сделать микролунки PDMS.
    4. Поместите микролунки в 96-луночный планшет и поместите луночный планшет в воздушно-плазменный очиститель для стерилизации микролунок PDMS.
    5. Функционализируйте микролунки PDMS 1% полиэтиленимином (PEI) и 0,1% глутаральдегидом (GA) в течение 10 мин и 20 мин соответственно. Промойте микролунки дистиллированной водой, 2х.
  2. Подготовка к ЧАСК (Расчетное время: 7 дней)
    1. Культивирование клеток пассажа на 2-5 пассажей в питательных средах hASC (базальные среды hASCs с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллином/стрептомицином (Pen-strep)) до слияния. Пройдите и подсчитайте количество клеток с помощью гемацитометра или счетчика клеток.
  3. Композитные гидрогели для нервов, насыщенные ASC (Расчетное время: 2 часа)
    1. Смешайте прегель для седалищного нерва и спинного мозга в объемном соотношении 2:1, 1:1, 1:2 и приготовьте гидрогель только для спинного мозга, не смешивая его с прегелем седалищного нерва.
    2. Добавьте среду M199 и отрегулируйте pH 7,4 с помощью 1 N NaOH и HCl. Ресуспендируйте hASC с питательной средой в прегеле с плотностью 1 x 106 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество М199 и клеточной суспензии должно составлять 10% от прегеля.
    3. Разбавьте прегель до 12 мг/мл с помощью 1x PBS. Поместите прегель на микролунки и выдерживайте в течение 30 минут. Культивирование гидрогелей, насыщенных ASC, в питательных средах hASC.
  4. Тест на жизнеспособность клеток (расчетное время: 4 часа в день)
    1. Готовьте растворы для испытаний на жизнеспособность с использованием имеющихся в продаже реагентов в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Аспирация среды в дни 1, 4, 7 и 14. Добавьте реагент в лунки и инкубируйте при 37 °C в течение 3 ч, следуя инструкциям производителя.
    3. Считывание флуоресценции при возбуждении/излучении 560/590 нм с помощью считывателя пластин. Рассчитайте процентную разницу по следующей формуле:
      [(образец флуоресценции- флуоресцентныйбланк) / флуоресцентныйбланк] x 100

Результаты

Децеллюляризированные ткани препарировали по ранее разработанным протоколам с незначительными изменениями26,27. После децеллюляризации, лиофилизации и пищеварения были изготовлены нервные композитные гидрогели в соотношении SN:SC = 2:1, 1...

Обсуждение

Широко распространено мнение, что патофизиология ТСМ сложна и многогранна. Несмотря на то, что отдельные методы лечения, такие как трансплантация клеток, доставка лекарств и биоматериалы, предоставили ценную информацию о ТСМ, сложный характер ТСМ может ограничить их ...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом PhRMA и Национальными институтами здравоохранения в виде награды No P20GM139768 и R15NS121884, присужденной YS. Мы хотим поблагодарить доктора Картика Балачандрана и доктора Раджа Рао с факультета биомедицинской инженерии Университета Арканзаса за предоставленную нам возможность использовать их оборудование. Кроме того, мы хотим поблагодарить доктора Джин-Ву Кима и г-на Патрика Кучвару из Департамента биологической и сельскохозяйственной инженерии Университета Арканзаса за проведение обучения по реометру.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonate inner saltSigma-AldrichD4266Used during sciatic nerve decellularization, SB-10
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propane sulfonateSigma-AldrichH6883Used during sciatic nerve decellularization, SB-16
AlamarBlue reagentFisher ScientificDAL1100Used during AlamaBlue cell viabiiltiy test
Chondroitinase ABCSigma-AldrichC3667Used during sciatic nerve decellularization
CryostatLeicaCM1860
DeoxyribonuclaseSigma-AldrichD4263Used during sciatic nerve decellularization
Disodium hydrogen phosphate heptahydrateVWRBDH9296Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Tissue kitQiagen69506Used during DNA analysis
Dpx Mountant for histology,slide mounting mediumSigma-Aldrich6522Used during H&E staining
EosinSigma-AldrichHT110216Used during H&E staining
EthanolVWR89125-172
FormaldehydeSigma-Aldrich252549Used during H&E staining
Glutaraldehyde (GA)Sigma-AldrichG6257Used during PDMS surface functionalization
hASC growth mediaLonzaPT-4505Used to culture hASCs, containing of fetal bovine serum and penicilin/streptomycin
HematoxylinVWR26041-06Used during H&E staining
human adipose-derived stem cellLonzaPT-5006
Hydrochloric acid (HCl)Sigma-Aldrich320331Used to digest decellularizied tissues and adjust pregels solutions
M199 mediaSigma-AldrichM0650Used to dilute pregels to desired concentration
Optimal cutting temperatue compoundTissue-Tek4583
PepsinSigma-AldrichP7000Used to digest decellularized tissues
Peracetic acidLab AlleyPAA1001Used during spinal cord decellularization
Phosphate buffered saline (PBS)VWR97062-948
Plate readerBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polyethyleneimine (PEI)Sigma-Aldrich181978Used during PDMS surface functionalization
Porcine sciatic nerveTissue Source LLCLive pigs, with no identifiable information and no traceability details
Porcine spinal cordTissue Source LLCLive pigs, with no identifiable information and no traceability details
QuantiFluor dsDNA systemPromegaE2670Used to analyze DNA contents
RheometerTA InstrumentsDHR 2
Rugged rotatorGlas-co099A RD4512Used during spinal cord decellularization
Sodium chloride (NaCl)VWRBDH9286Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateVWRBDH9298Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
Sodium hydroxide solution (NaOH)Sigma-Aldrich415443Used to adjust pregels solutions
SU-8Kayaku advnaced materialsSU8-100Used to coat silicon wafer
SucroseSigma-AldrichS8501Used during spinal cord decellularization
Sylgard 184 silicone elastomer kitDOW1317318Polydimethylxiloxane (PDMS) base and curing agent
Triton X-100Sigma-AldrichX100Used during spinal cord decellularization
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher25300062Used during hASC work and during spinal cord decellularization
Tube revolver rotatorThermo Fisher88881001Used during sciatic nerve decellularization
XyleneVWRMK866816Used during H&E staining

Ссылки

  1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. National Spinal Cord Injury Statistical Center. , (2017).
  2. Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 1-35 (2020).
  3. Führmann, T., Anandakumaran, P. N., Shoichet, M. S. Combinatorial therapies after spinal cord injury: How can biomaterials help. Adv Healthcare Mater. 6 (10), 1-21 (2017).
  4. Xu, Y., et al. Understanding the role of tissue-specific decellularized spinal cord matrix hydrogel for neural stem/progenitor cell microenvironment reconstruction and spinal cord injury. Biomaterials. 268, 120596 (2021).
  5. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  6. Franko, R., et al. Mechanical properties of native and decellularized reproductive tissues: insights for tissue engineering strategies. Sci Rep. 14 (1), 1-14 (2024).
  7. Rowlands, D., Sugahara, K., Kwok, J. C. F. Glycosaminoglycans and glycomimetics in the central nervous system. Molecules. 20 (3), 3527-3548 (2015).
  8. Silver, D. J., Silver, J. Contributions of chondroitin sulfate proteoglycans to neurodevelopment, injury, and cancer. Curr Opinion Neurobiol. 27, 171-178 (2014).
  9. Porzionato, A., et al. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: A systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 19 (12), 4117 (2018).
  10. Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNFoverexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  11. Tabakow, P., et al. Transplantation of autologous olfactory ensheathing cells in complete human spinal cord injury. Cell Transpl. 22 (9), 1591-1612 (2013).
  12. Hawryluk, G. W. J., et al. An in vivo characterization of trophic factor production following neural precursor cell or bone marrow stromal cell transplantation for spinal cord injury. Stem Cells Dev. 21 (12), 2222-2238 (2012).
  13. Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
  14. Mackay-Sim, A., et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: A 3-year clinical trial. Brain. 131 (9), 2376-2386 (2008).
  15. Suzuki, H., et al. Current concepts of neural stem/progenitor cell therapy for chronic spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 15, 794692 (2022).
  16. Kokai, L. E., Marra, K., Rubin, J. P. Adipose stem cells: Biology and clinical applications for tissue repair and regeneration. Trans Res. 163 (4), 399-408 (2014).
  17. Kingham, P. J., Kolar, M. K., Novikova, L. N., Novikov, L. N., Wiberg, M. Stimulating the neurotrophic and angiogenic properties of human adipose-derived stem cells enhances nerve repair. Stem Cells Dev. 23 (7), 741-754 (2014).
  18. Song, Y. H., Shon, S. H., Shan, M., Stroock, A. D., Fischbach, C. Adipose-derived stem cells increase angiogenesis through matrix metalloproteinase-dependent collagen remodeling. Integr Biol (United Kingdom). 8 (2), 205-215 (2016).
  19. Ribeiro, C. A., et al. The secretome of stem cells isolated from the adipose tissue and Wharton jelly acts differently on central nervous system derived cell populations. Stem Cell Res Ther. 3 (3), 18 (2012).
  20. Salgado, J. B. O. G., et al. Adipose tissue derived stem cells secretome: Soluble factors and their roles in regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 5 (2), 103-110 (2010).
  21. Kapur, S. K., Katz, A. J. Review of the adipose derived stem cell secretome. Biochimie. 95 (12), 2222-2228 (2013).
  22. Xu, X. M., Chen, A., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  23. Guest, J. D., et al. Influence of IN-1 antibody and acidic FGF-fibrin glue on the response of injured corticospinal tract axons to human Schwann cell grafts. J Neurosci Res. 50 (5), 888-905 (1997).
  24. Cornelison, R. C., et al. Injectable hydrogels of optimized acellular nerve for injection in the injured spinal cord. Biomed. Mater. 13 (3), 034110 (2018).
  25. Crapo, P. M., et al. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 33 (13), 3539-3547 (2012).
  26. Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
  27. McCrary, M. W., et al. Novel sodium deoxycholate-based chemical decellularization method for peripheral nerve. Tissue Eng Part C. 26 (1), 23-36 (2020).
  28. Shahemi, N. H., et al. Application of conductive hydrogels on spinal cord injury repair: A Review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (7), 4045-4085 (2023).
  29. Huang, L. Y., et al. Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on bone marrow mesenchymal stem cells: Advances and challenges. World J Stem Cells. 15 (5), 385-399 (2023).
  30. Chakraborty, A., Ciciriello, A. J., Dumont, C. M., Pearson, R. M. Nanoparticle-based delivery to treat spinal cord injury - a mini- review. AAPS PharmSciTech. 22 (3), 101 (2022).
  31. Upadhyay, R. K. Drug delivery systems, CNS protection, and the blood brain barrier. BioMed Res Int. , d869269 (2014).
  32. Liu, G., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells for peripheral nerve repair. Int J Mol Med. 28 (4), 565-572 (2011).
  33. Sun, T., et al. Adipose-derived stem cells in immune-related skin disease: a review of current research and underlying mechanisms. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 1-14 (2024).
  34. Lewis, M., et al. Materials today bio neuro-regenerative behavior of adipose-derived stem cells in aligned collagen I hydrogels. Mater Today Bio. 22, 100762 (2023).
  35. Thuret, S., Moon, L. D. F., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 628-643 (2006).
  36. Ohta, Y., et al. Intravenous infusion of adipose-derived stem/stromal cells improves functional recovery of rats with spinal cord injury. Cytotherapy. 19 (7), 839-848 (2017).
  37. Hur, J. W., et al. Intrathecal transplantation of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells for treating spinal cord injury: A human trial. J Spinal Cord Med. 39 (6), 655-664 (2016).
  38. Muehlberg, F. L., et al. Tissue-resident stem cells promote breast cancer growth and metastasis. Carcinogenesis. 30 (4), 589-597 (2009).
  39. Ji, S. Q., et al. Adipose tissue-derived stem cells promote pancreatic cancer cell proliferation and invasion. Brazilian J Med Biol Res. 46 (9), 758-764 (2013).
  40. Zhu, Y., et al. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia. 23 (5), 925-933 (2009).
  41. Cousin, B., et al. Adult stromal cells derived from human adipose tissue provoke pancreatic cancer cell death both in vitro and in vivo. PLoS ONE. 4 (7), 31-34 (2009).
  42. Tukmachev, D., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. 22 (3-4), 306-317 (2016).
  43. Bousalis, D., et al. Decellularized peripheral nerve as an injectable delivery vehicle for neural applications. Biomed Mater Res Part A. 110, 595-611 (2022).
  44. Sharma, A., Liao, J., Williams, L. N. Structure and mechanics of native and decellularized porcine cranial dura mater. Eng. 4 (2), 205-213 (2023).
  45. Ozudogru, E., et al. Decellularized spinal cord meninges extracellular matrix hydrogel that supports neurogenic differentiation and vascular structure formation. J Tissue Eng Regen Med. 15 (11), 948-963 (2021).
  46. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  47. Saha, K., et al. Substrate modulus directs neural stem cell behavior. Biophys J. 95 (9), 4426-4438 (2008).
  48. Jiang, T., et al. Preparation and characterization of genipin-crosslinked rat acellular spinal cord scaffolds. Mater Sci Eng C. 33 (6), 3514-3521 (2013).
  49. Gao, S., et al. Comparison of glutaraldehyde and carbodiimides to crosslink tissue engineering scaffolds fabricated by decellularized porcine menisci. Mater Sci Eng C. 71, 891-900 (2017).
  50. Zhou, J., et al. Tissue engineering of heart valves: PEGylation of decellularized porcine aortic valve as a scaffold for in vitro recellularization. BioMe Eng Onl. 12 (1), 1-12 (2013).
  51. Sun, D., et al. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells. Int J Biol Macromol. 109, 1154-1163 (2018).
  52. Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization orotocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tiss Engi C. 24 (12), 697-708 (2018).
  53. Mendicino, M., Fan, Y., Griffin, D., Gunter, K. C., Nichols, K. Current state of U.S. Food and Drug Administration regulation for cellular and gene therapy products: potential cures on the horizon. Cytotherapy. 21 (7), 699-724 (2019).
  54. Lim, H. C., et al. Allogeneic umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell implantation versus microfracture for large, full-thickness cartilage defects in older patients: A multicenter randomized clinical trial and extended 5-year clinical follow-up. Ortho J Sports Med. 9 (1), 1-15 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены