Génération de sphéroïdes/organoïdes tridimensionnels à partir de cultures cellulaires bidimensionnelles à l’aide d’un nouveau dispositif de tamponnage

Résumé

Cette étude présente une méthodologie rentable et efficace pour générer des structures cellulaires 3D à l’aide d’un système basé sur des tampons pour créer des micropuits dans des moules d’agarose. Le système favorise la formation de sphéroïdes/organoïdes uniformes, améliorant ainsi les interactions cellulaires. Cette approche réduit la variabilité expérimentale et soutient les applications dans les tests de médicaments et l’ingénierie tissulaire.

Résumé

Les cultures cellulaires tridimensionnelles (3D) fournissent une représentation plus précise du microenvironnement in vivo que les cultures bidimensionnelles (2D) conventionnelles, car elles favorisent des interactions améliorées entre les cellules et la matrice extracellulaire. Cette étude visait à développer une méthodologie efficace, rentable et reproductible pour générer des structures cellulaires 3D (sphéroïdes/organoïdes) à l’aide d’un système innovant basé sur des tampons pour créer des micropuits dans des moules d’agarose. Un nouveau tampon a été utilisé pour produire 663 micropuits par puits d’une plaque à 6 puits, fournissant un environnement idéal pour l’agrégation cellulaire. Des cellules primaires d’îlots pancréatiques porcins ont été ensemencées dans ces micropuits, où elles se sont agrégées pour former des sphéroïdes/organoïdes. Les cultures ont été incubées à 37 °C sous 5 % de CO₂, et le milieu a été remplacé tous les 3 jours. La formation des sphéroïdes a été surveillée périodiquement et des échantillons ont été prélevés à des fins de caractérisation. La méthode a réussi à générer des sphéroïdes uniformes et de haute qualité, réduisant la variabilité expérimentale, minimisant la manipulation et améliorant les interactions cellulaires. L’utilisation de moules à micromotifs à base d’agarose a fourni un environnement simplifié et contrôlé pour les cultures 3D, offrant une solution standardisée et rentable. Cette méthodologie prend en charge les applications de tests de médicaments et d’ingénierie tissulaire, offrant une plate-forme pratique et évolutive pour les modèles de culture cellulaire 3D qui peuvent être facilement mis en œuvre dans divers environnements de laboratoire.

Introduction

Au cours des 50 dernières années, de nombreuses études en biologie cellulaire ont démontré que les cultures bidimensionnelles (2D) ne parviennent pas à reproduire avec précision les conditions in vivo observées dans les modèles animaux¹. Structurellement, les cultures cellulaires 2D ne permettent pas aux cellules de s’organiser en trois dimensions et de reproduire la situation observée dans les systèmes in vivo . De plus, les voies de signalisation cellulaire sont modifiées dans les cultures 2D par rapport aux cultures tridimensionnelles (3D), ce qui pourrait probablement expliquer pourquoi certains types de criblage de drogues utilisant des cultures 2D sont si divergents². Une avancée significative dans les techniques de culture cellulaire a émergé avec l’introduction des systèmes de culture 3D. La complexité des systèmes 3D varie considérablement en fonction de la composition cellulaire et de la cytoarchitecture. Généralement, deux types de structures sont générés, à savoir : les sphéroïdes et les organoïdes. Les sphéroïdes sont décrits comme de simples amas de cellules obtenues à partir de tissus normaux ou tumoraux, de corps embryoïdes et de lignées cellulaires. La formation de structures 3D est influencée par divers facteurs, notamment les interactions cellule-cellule et les voies de signalisation médiées par les composants de la matrice extracellulaire (MEC), qui fournissent un soutien structurel et des indices biochimiques. Ces éléments régulent les interactions qui contribuent à l’organisation et à la fonction des tissus³. Le système de culture de sphéroïdes a été décrit pour la première fois au début des années 1970, en utilisant des lignées cellulaires pulmonaires de hamster chinois V79 comme modèle de carcinomes nodulaires, se développant dans des conditions non adhérentes et formant des sphères parfaites⁴. Les organoïdes sont décrits comme des amas de types de cellules spécifiques à des organes dérivés de cellules souches ou de cellules progénitrices, qui s’auto-organisent par des processus, tels que le tri cellulaire et la spécification de lignée, de manière spatialement confinée, reflétant le développement in vivo ⁵.

Plusieurs méthodes et matériaux disponibles sont disponibles pour cultiver des cellules dans des conditions 3D. Les principales méthodes actuellement utilisées pour générer des cultures 3D sont : 1) les gouttes suspendues ; 2) culture cellulaire rotative et plastiques à faible attache ; 3) plaques pyramidales contenant des puits coniques ; 4) échafaudages macroporeux ; 5) perles magnétiques ; et 6) hydrogels sans échafaudage.

Les gouttes suspendues sont la méthode utilisée pour obtenir des cultures 3D sans échafaudage. Cette méthode présente certaines limites, notamment la nécessité d’une manipulation intensive, une faible efficacité de production, une géométrie sphérique et une exposition à des forces de cisaillement élevées. De plus, des procédures spécifiques, telles que le remplacement d’un support ou l’ajout de composé, peuvent être difficiles et entraîner une perte de matière. De plus, les rapports de la littérature indiquent que certaines lignées cellulaires ne parviennent pas à produire des sphéroïdes serrés lorsqu’elles utilisent cette approche⁶.

La culture cellulaire rotative et les plastiques à faible adhérence sont utilisés pour empêcher les cellules de se fixer au substrat, ce qui les amène à s’agréger et à former des sphéroïdes. Ce processus nécessite des flacons spécifiques et/ou de l’agitation/rotation. Bien qu’il s’agisse de l’une des approches les plus simples pour la production de sphéroïdes ou d’organoïdes à grande échelle, elle n’est pas sans inconvénients, tels que la nécessité d’un équipement spécifique, la faible longévité de la culture, la variation de taille des sphéroïdes, les dommages mécaniques aux cellules et la faible efficacité⁶.

Les plaques pyramidales contenant des puits coniques sont des plaques disponibles dans le commerce qui impactent les coûts, en plus du fait que certaines manipulations peuvent entraver la formation de sphéroïdes/organoïdes⁷.

Des échafaudages macroporeux sont également utilisés pour la culture 3D ; Cependant, un obstacle majeur réside dans l’obtention d’un ensemencement cellulaire efficace et d’une distribution uniforme. Ce problème se pose parce que la taille des pores peut être soit trop petite pour la pénétration des cellules, soit trop grande pour retenir les cellules en toute sécurité. Pour répondre à ce problème, plusieurs stratégies ont été explorées⁸, qui impactent directement la complexité et le coût de cette technique.

La méthodologie des billes magnétiques génère un petit nombre de sphéroïdes/organoïdes, a un coût élevé et peut laisser des résidus de nanoparticules à l’intérieur des cellules⁹.

Parmi les systèmes de culture de sphéroïdes, il existe des hydrogels d’agarose non adhésifs, représentant un hydrogel sans échafaudage. Cette approche offre des avantages notables, tels qu’un contrôle précis de la taille des structures 3D et la capacité de générer un nombre substantiel de ces structures par plaque. Dans cette méthode, les cellules sont introduites dans un hydrogel avec des puits préformés, dans lequel elles coulent et s’auto-assemblent en sphéroïdes 3D¹⁰.

Dans cette étude, nous présentons un dispositif et une méthodologie permettant de générer des micropuits d’agarose à l’aide d’un moule à micromotifs de manière simple, efficace, reproductible et peu coûteuse.

L’utilisation de ce tampon comme moule pour générer des micropuits dans l’agarose, aidée par la gravité, vise à améliorer l’interaction cellulaire au sein du micropuits et de l’organisation cellulaire, en générant des structures 3D (sphéroïdes/organoïdes) in vitro de manière simple, efficace, reproductible et peu coûteuse, économisant ainsi du temps de recherche et des ressources de laboratoire.

Protocole

Ce protocole suit les lignes directrices du Comité d’éthique de la recherche humaine de notre Institution CEUA-FMUSP : 1699/2021, approuvé le 8 septembre 2021 -« Isolement et encapsulation des îlots pancréatiques porcins » et fait partie du Projet Thématique de notre Groupe NUCEL de Thérapie Cellulaire et Moléculaire (www.usp.br/nucel), Subvention FAPESP n° 2016/05311-2, intitulé : « Médecine régénérative visant la thérapie des maladies chroniques dégénératives (cancer et diabète) ».

1. Fabrication du dispositif de tamponnage

REMARQUE : Ce tampon est fabriqué sur mesure par le groupe NUCEL (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). Le dispositif de tamponnage a été développé à l’aide du logiciel référencé, largement reconnu pour sa précision et ses capacités avancées de modélisation tridimensionnelle.

1. S’assurer que les prototypes conçus comportent 663 microbroches disposées de manière à permettre la génération d’un nombre équivalent de cultures tridimensionnelles, telles que des sphéroïdes ou des organoïdes. Pour assurer la stabilité du tampon sur les surfaces des plateaux T6, positionnez cinq points d’appui stratégiquement le long de la circonférence de l’appareil.
2. Assurez-vous que les microbroches ont un design conique avec des dimensions réglables, allant de 1 à 3 mm de longueur. Le diamètre de la base du cône varie entre 0,7 et 1,5 mm, tandis que l’angle de conicité varie de 5° à 10°.
3. Assurez-vous que la structure « stop » de l’appareil, qui définit la profondeur des microbroches, a une longueur réglable de 10 à 19 mm et un diamètre de 20 à 40 mm, avec des microbroches uniformément réparties sur sa surface.
4. De plus, concevez l’appareil pour qu’il soit doté d’une poignée ergonomique, adaptée à une utilisation d’une seule main, afin d’améliorer la praticité et la précision lors de l’utilisation.
   REMARQUE : Pour faciliter la production à grande échelle de l’appareil, le fichier numérique au format .stl est fourni, étant essentiel pour le processus d’impression 3D.
5. Il suffit de le découper à l’aide d’un logiciel approprié et de l’imprimer avec une imprimante 3D compatible. Utilisez les dimensions d’impression suivantes : X - 68 mm ; Y - 120 mm ; Z - 150 mm, assurant un équilibre idéal entre fonctionnalité et qualité structurelle.
6. Pour la fabrication de l’appareil, utilisez une imprimante 3D photodurcissable, compatible avec la résine polymère durcissable aux UV qui doit avoir une haute résolution et une finition de surface uniforme, caractéristiques essentielles pour des performances optimales de l’appareil.
7. Découper le modèle numérique pour l’impression à l’aide d’un logiciel compatible avec l’imprimante 3D sélectionnée.

2. Préparation des micropuits d’agarose

1. Préparez la solution d’agarose.
   1. Pesez la poudre d’agarose pure et dissolvez-la dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir une concentration finale de 1 à 2 % (p/v).
   2. Chauffez la solution au micro-ondes ou au bain-marie jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute, en veillant à ce qu’elle soit homogène et transparente.
      REMARQUE : Évitez de surchauffer ou de réchauffer excessivement, car cela peut dégrader l’agarose. Ne préparez pas de grands volumes de solution mère.
   3. Laisser refroidir la solution à ~40 °C, la température idéale pour le pipetage.
2. Préparez le tampon sur mesure.
   1. Lavez le tampon avec une éponge à poils doux et de l’eau distillée pour éliminer les résidus.
   2. Exposez le tampon nettoyé à la lumière UV pendant 5 à 10 minutes pour assurer la stérilité.
3. Formez les micropuits.
   1. Verser/pipeter ~3 mL de la solution d’agarose à 40 °C dans chaque puits d’une plaque à 6 puits, en assurant une profondeur uniforme de 2-3 mm.
   2. Positionnez le tampon sur mesure au centre du puits pendant que l’agarose est encore chaud.
      REMARQUE : Le tampon a des supports latéraux qui assurent l’alignement et la stabilité, éliminant ainsi le besoin de support manuel. Chaque timbre crée ~663 micropuits (~2 mm de hauteur) par puits. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sur les microbroches ; Si des bulles se forment, déplacez doucement le tampon pour les éliminer.
   3. Laissez l’agarose se solidifier pendant 5 à 10 minutes à température ambiante sans déplacer la plaque.
      REMARQUE : Ne pas déranger l’agarose pendant la solidification pour éviter les variations de la structure du micropuits.
   4. Retirez le tampon avec de légers mouvements de va-et-vient pour libérer l’aspirateur sans endommager les micro-puits.
      REMARQUE : Ce mouvement facilite l’entrée d’air, permettant un retrait en douceur du tampon sans déformer le gel. Les micropuits doivent rester intacts.
   5. Lavez les micropuits 3 fois avec une solution PBS pour éliminer les résidus.
   6. Exposez la plaque à la lumière UV pendant 10 min pour éliminer la contamination microbienne.
   7. Ajouter 3 mL de milieu de culture et incuber la plaque dans un incubateur de CO₂ à 37 °C pendant la nuit.
      REMARQUE : Cette incubation permet de vérifier l’absence de contamination avant l’ensemencement cellulaire.

3. Ensemencement cellulaire dans les micropuits

1. Préparez la suspension cellulaire.
   1. Collecter les cellules par trypsinisation ou une autre méthode de dissociation pour obtenir une suspension homogène.
   2. Comptez les cellules et ajustez la concentration en fonction du nombre souhaité par micropuits.
      REMARQUE : Pour ensemencer 5 000 cellules par micropuits dans 663 micropuits, préparer une suspension contenant au moins 3,315 × 10⁶ cellules au total. Optimiser la concentration cellulaire pour prévenir la nécrose centrale et assurer une diffusion adéquate des nutriments et de l’oxygène.
2. Ensemencez les cellules.
   1. Pipeter ~3 mL de la suspension cellulaire préparée sur les micropuits, en assurant une distribution uniforme en faisant tourner doucement la plaque.
   2. Laisser les cellules se décanter par gravité (~10-15 min) ou effectuer une centrifugation douce à 100 × g pendant 5 min.
      REMARQUE : La centrifugation peut être utilisée pour s’assurer que les cellules se concentrent dans les micropuits.
   3. Transférez la plaque dans un incubateur de CO₂ à 37 °C avec une atmosphère humidifiée.

4. Maintenance des cultures cellulaires 3D

1. Remplacez le milieu de culture.
   1. Changez le milieu tous les 2-3 jours, en enlevant 50 % de l’ancien milieu et en ajoutant du milieu frais.
      REMARQUE : Assurez-vous que les micropuits restent immergés tout au long de la période de culture pour éviter la déshydratation.
2. Surveiller la formation des cultures 3D.
   1. Poursuivre l’élevage jusqu’à ce que les structures 3D soient complètement formées et compactes (p. ex., 2 à 3 jours pour les cultures primaires d’îlots pancréatiques).
      REMARQUE : Pour les cultures nécessitant un temps de formation plus long, effectuez des changements partiels de milieu tous les 2-3 jours.

5. Collecte et caractérisation de structures 3D

1. Récupérez les sphéroïdes/organoïdes.
   1. Retirez l’ancien milieu et collectez les structures 3D par un pipetage vigoureux à l’aide d’une pointe de pipette de grand diamètre ou coupée pour éviter la compression ou la désagrégation.
      REMARQUE : Un pipetage vigoureux doit être contrôlé pour déloger les agrégats sans les déformer.
2. Préparez-vous à l’analyse.
   1. Utilisez immédiatement les sphéroïdes/organoïdes collectés ou fixez-les pour une analyse future.
      REMARQUE : L’association et la stabilité des sphéroïdes dépendent du type de cellule, du temps de formation et des conditions de culture. Faire attention est essentiel pour éviter la dissociation.

Résultats

La culture cellulaire utilisée dans cette étude a été dérivée d’îlots pancréatiques porcins. La préparation d’îlots de Langerhans utilisée dans cette étude avait une pureté de 80 ± 5 % basée sur la coloration à la dithizone, et une viabilité des cellules d’îlots de Langerhans de >80 % basée sur la détection de diacétate de fluorescéine dans les cellules vivantes ou d’iodure de propidium dans les cellules mortes (méthode fluorescente Live/Dead). Assurez-vous...

Discussion

Bien qu’il existe divers protocoles de culture 3D dans la littérature, une étude menée par Wassmer et ^al.13 a testé plusieurs méthodologies pour générer des structures 3D à l’aide d’îlots pancréatiques. Les auteurs ont observé que les îlots indigènes et les sphéroïdes auto-agrégés présentaient une hétérogénéité considérable en ce qui concerne la taille et la forme et étaient plus grands que ceux obtenus à l’aide d’autres méthod...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
31L Microwave	Electrolux	78965840 6699 9	Equipment used to heat the agarose solution, facilitating its dissolution and ensuring greater homogeneity. It allows the solution to reach the ideal liquid state for the formation of the wells.
3DFila Gray Opaque Photosensitive 3D Resin			UV-curable polymer resin
3D Printer - Creality Halot One	Creality	N/A	3D printer used for printing the stamp device
Agarose	UNISCIENCE	UNI-R10111	To form the gel, dissolve 1 to 2% in Saline Phosphate Buffer (PBS) or appropriate medium.
Autodesk Fusion 360			3D modeling
BB15 CO2 Incubator	Thermo Fisher	51023121	Equipment used to incubate cultured cells in a suitable and controlled environment.
Chitubox	Chitubox	N/A	Software used for slicing the part for printing
Class II Biological Safety Cabinet	Grupo VECO	N/A	Ensures a sterile environment for performing cell culture within established parameters and protocols.
Culture medium	USBiological/Life Sciences	C5900-03A	Contains additives for proper cell cultivation.
Culture plates (P6)	SARSTEDT	1023221	Used to shape the agarose and culture the cells.
Erlenmeyer Flask (25 mL)	Laborglas	91 216 14	A container used for dissolving 1–2% agarose in Phosphate Buffered Saline (PBS) or another suitable medium, typically heated in a microwave.
Falcon 15 mL Polystyrene Centrifuge Tube	Corning	352099	Used to keep cells in suspension and perform possible dilutions.
Fetal bovine serum (FBS)	Vitrocell Embriolife	005/19	Additive for culture medium.
PBS solution (Saline Phosphate Buffer)	Lab made	N/A	Diluted 1x with MiliQ ultrapure water. Used to dissolve agarose 1 to 2% and to wash wells already produced.
Reagent bottle with blue cap - Schott	Laborglas	21801545	Used for preparing and storing culture medium.
Stamp device	NUCEL Group	N/A	Link- This link provides access to the .stl file of the stamp device. Simply slice it using appropriate software and print it with a compatible 3D printer. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK EChKS3Qns0rOA?usp=sharing
Treated culture flask with filter 25 cm²	Corning	430639	Used for the cultivation and maintenance of adherent cells.
Trypsin	Merck	07-07-9002	For dissociation of cells before seeding.
Ultra violet light (UV)	N/A	N/A	Used to sterilize the stamp and plates.