Le financement de ce projet a été fournie par un Award Cancer Society American Scholar Recherche, (06-024-01-CSM à Charles J. Dimitroff), un National Institutes of Health / National Cancer Institute subventions (RO1CA118124 à Charles J. Dimitroff) et une National Institutes of Health / National Institute of Arthritis and Maladies musculo-squelettiques et la peau de subvention (P30 AR042689 au Dr Thomas Kupper S.; Hôpital Brigham and Women, Boston, MA).

1. Préparation de HBMEC (HBMEC-60 Cell) monocouche sur boîtes de Pétri pour la Chambre de débit <ol><li> Manteau 35 x 10mm de culture de tissus plats avec 2ml de la fibronectine 20μg/ml (dans du PBS) pendant la nuit à 4 ° C ou pendant 3 heures à 37 ° C. </li><li> Aspirer solution de fibronectine de plats et ajoutez 1,5 x10 5 cellules HBMEC-60 [Moyenne 199 avec HEPES &amp; glutamine, 10% de FBS, 10% de sérum humain, 5 unités / ml d&#39;héparine, 1ng/ml facteur humain recombinant de croissance des fibroblastes, 1% de pénicilline- La streptomycine] pour le plat et leur permettre de croître jusqu&#39;à la confluence&gt; 90%. (Cela prend 2 jours) </li><li> Aspirer les milieux de croissance et, pour mettre à réguler l&#39;expression de sélectine E, ajouter milieu frais avec de l&#39;IL-1β 50ng/mL pour 4-6 heures. Monocouches de cellules sont maintenant prêts à rouler dosage. Pour bloquer la fonction E-sélectine, neutralisants anti-humain E-sélectine Moab (clone BBiG-E4 (5D11)) peuvent être ajoutés à 20μg/ml pour ~ 1h à 37 ° C. </li></ol> 2. Préparation des cellules hématopoïétiques humaines KG1a progénitrices des Chambre de circulation <ol><li> Homme cellules hématopoïétiques progénitrices KG1a sont cultivés jusqu&#39;à la confluence (1x10 6 cellules / ml) dans du RPMI-1640 avec la glutamine et 10% de FBS / 1% de pénicilline-streptomycine et sont pipetés directement à partir du flacon pour une utilisation dans le dosage chambre d&#39;écoulement. </li><li> Le nombre de cellules est calculé en utilisant un hématimètre puis les cellules sont remises en suspension à 1 x 10 6 cellules / ml dans du HBSS avec 10mm HEPES (H / H Tampon) et 2mm CaCl 2 </li><li> Les cellules sont stockées sur la glace jusqu&#39;à utilisation dans le dosage. </li></ol> 3. Préparation du microscope, Chambre de circulation à plaques parallèles et pompe seringue (Figure 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_7/1009_figure1.png" alt="Figure 1" width="600" height="409" /> Figure 1. Illustration de plaques parallèles Analyse Chambre de circulation. Microscope inversé, Harvard seringue pompe, ordinateur / caméra et chambre d&#39;écoulement à plaques parallèles sont placés dans un arrangement optimal pour l&#39;analyse cellulaire efficace et reproductible. <ol><li> Tournez sur la puissance et la source de lumière pour microscope inversé et le pouvoir de la pompe seringue et sélectionnez l&#39;objectif 10x sur le microscope. </li><li> Placer 50 ml tube conique dans le support et la remplir de H / H et 2mm CaCl 2. </li><li> Placer les tubes à essai en plastique de 5 ml dans le porte-tube à essai en dessous du tube de 50 ml coniques </li><li> Placer 60 ml seringue dans la seringue électrique (Soyez sûr que les deux sur le piston et le corps de seringue sont à la fois sécurisé). </li><li> Fixez 3-way robinet d&#39;extrémité de la seringue de 60 ml et joindre une seringue de 5 ml à 3 voies robinet. </li><li> Placer un appareil parallèle Chambre de circulation (GlycoTech, Inc) sur scène microscope avec tube d&#39;entrée vers la droite, le tube de sortie à gauche et à tubes sous vide à l&#39;arrière. </li><li> Fixez tube à vide au vide et valve d&#39;air ouverte pour permettre à un appareil à plaques parallèles d&#39;adhérer à la scène. (Ce teste si la jupe de vide sur la chambre d&#39;écoulement est étanche à l&#39;air.) Tournez le robinet d&#39;air. </li><li> Attacher la ligne de sortie tube (à gauche du microscope) à 3 voies robinet. Appareil est maintenant prêt pour la mise sur plaque monocouche HBMEC-60. </li><li> Plaque monocouche Placez HBMEC-60 et le placer sur le centre du microscope. </li><li> Allumez le vide et la position de l&#39;appareil de chambre de circulation au-dessus du plateau de telle sorte que la plaque monocouche est au centre. </li><li> Abaissez doucement l&#39;appareil chambre d&#39;écoulement sur la plaque monocouche HBMEC-60 et un appareil permettant de chambre d&#39;écoulement d&#39;aspiration vers le bas. (Il ne faut pas les sons de l&#39;air qui s&#39;échappe et à ce stade, vous pourriez avoir besoin pour appliquer une pression à la chambre pour comprimer le joint en caoutchouc.) </li><li> Une fois vide a été créé, le tube d&#39;entrée place (à droite) dans le tube conique contenant 50 ml H / H avec 2 mM CaCl 2. </li><li> Ouvrez 3-way robinet pour permettre l&#39;écoulement dans la seringue de 60 ml et d&#39;une pompe dans &quot;mode pompe.&quot; </li><li> Pour éliminer l&#39;air d&#39;entrée / sortie sans soulever les cellules sur la plaque, utiliser la pompe seringue fixé à 2mL/minute pour remplir le tube d&#39;admission, puis rapidement réglé à 0,5 ml / minute, juste avant le fluide atteint l&#39;appareil. Il est impératif d&#39;amorcer cette mise en place avec soin et éviter les bulles d&#39;air qui va soulever la monocouche de la plaque. </li><li> Une fois que le fluide est vu passer dans la seringue de 60 ml, la chambre de circulation et pompe seringue ont été amorcées et la chambre de flux est prêt à l&#39;emploi. Cette mise en place sera répétée pour chaque exécution d&#39;entrée de cellule et pour chaque nouvelle plaque nécessaire. </li></ol> 4. Capturer des leucocytes roulant événements en utilisant les éléments de NIS <ol><li> Ouvrez Elements NIS sur le bureau. </li><li> Appuyez sur &quot;play&quot; icône de l&#39;image en direct. L&#39;exposition automatique vous permettra de voir la plaque plus facile pour l&#39;instant et il est important de se concentrer. </li><li> Soyez sûr que microscope est correctement mis sur la monocouche cellulaire. </li><li> Une fois concentré, re-mis en exposition à la lumière une image / seconde et d&#39;ajuster sur le microscope. L&#39;image doit apparaître sur l&#39;ordinateur et ne sera plus visible dans le viseur de microscope en raison de la faible clarté. Histogramme lumière peut alors être adjusted pour enlever l&#39;exposition de fond ou d&#39;améliorer la clarté des cellules. </li><li> Cliquez sur bin 2X2 ou Bin Live pour obtenir une image qui est idéal pour la capture de film </li><li> Cliquez sur &quot;Macro&quot; sur la barre de menu et sélectionner &quot;écrire sur le port&quot;, sélectionnez le port &quot;com3&quot;, et &quot;ouverte&quot;. (Ceci ouvre le port afin de coordonner avec le pousse-seringue. </li><li> Pipeter 1 ml de suspension cellulaire KG1a dans l&#39;éprouvette 5ml près de la ligne tube d&#39;entrée et ensuite placer la ligne d&#39;entrée tuyau au fond de l&#39;éprouvette. </li><li> Aller à la barre de menu, cliquez sur &quot;Capture&quot;, &quot;time-lapse d&#39;acquisition.&quot; </li><li> Un nouveau menu apparaîtra. Sélectionnez le protocole durables 210 secondes, c&#39;est la longueur du programme pour rouler sur HBMEC-60 cellules. (Chaque phase est programmée pour prendre une photo à chaque seconde pour la durée du protocole de la pompe. Il est également mis en place pour envoyer une commande par le port COM3 pour démarrer la pompe.) Si time-lapse est interrompue, la pompe ne s&#39;arrêtera pas sur ses propres et doit être réinitialisé. Appuyez sur Annuler pour retourner vivre l&#39;image. </li><li> Régler la pompe seringue de &quot;mode Programme&quot;, selon le manuel d&#39;instructions. (Mode Programme permet de programmation manuelle des débits spécifiques (à savoir des niveaux de stress de cisaillement) pour être transmises dans la chambre et de dicter les interactions cellulaires au cours de la monocouche KG1a HBMEC-60 cellules). Réglages pour la cellule KG1a roulant sur les cellules HBMEC ont été les suivants 4,2 dynes / cm 2 pendant 45 s, 0,3 dynes / cm 2 pendant 60 s, et une augmentation progressive toutes les 15 s à un maximum de 4,2 dynes / cm 2 </li><li> Mur contraintes de cisaillement (W st) dans la chambre a été calculé selon l&#39;équation suivante: W = st 6μQ / a, b 2, où μ est la viscosité estimé des médias (0,0076 P), Q est le débit volumique en ml / s, un canal est la hauteur (épaisseur du joint) en cm (0,03 cm), et b est la largeur du canal en cm (0,5 cm). Les débits ont été réglementées en utilisant le mode programme de la pompe à seringue. </li><li> Microscope et l&#39;ordinateur sont maintenant prêts à capturer une séquence en accéléré. Appuyez sur &quot;Start Run&quot; sur l&#39;ordinateur pour commencer à acquérir des données. Lors de l&#39;exécution du programme, n&#39;oubliez pas d&#39;ajouter des médias à l&#39;éprouvette contenant des cellules KG1a afin de maintenir le tuyau d&#39;entrée / sortie complète de support (Assurez-vous qu&#39;il n&#39;ya pas de bulles d&#39;air). </li></ol> 5. Dépendance de sialylation Terminal et glycoprotéine de surface pour la E-sélectine-médiation cellulaire KG1a 5. Roulant (figure 2; Clips Vidéos du 05/01 au 05/05) <ol><li> Dosage de la cellule KG1a roulant sur ​​non-stimulés HBMEC-60 cellules. (Contrôle négatif), les cellules ont été préparées et KG1a infusé dans la chambre d&#39;écoulement plus vivant non-IL-1β stimulée HBMEC-60 comme décrit ci-dessus. </li><li> Dosage de la cellule KG1a roulant sur ​​HBMEC-60 cellules pré-traitées avec de l&#39;IL-1β. (E-sélectine-dépendance de contrôle) cellules KG1a ont été préparés et infusés dans la chambre de circulation au cours de l&#39;IL-1β direct stimulée HBMEC-60 comme décrit ci-dessus. </li><li> Dosage de la cellule KG1a roulant sur ​​HBMEC-60 cellules pré-traitées avec de l&#39;IL-1β, puis en neutralisant anti-humain E-sélectine Moab. (E-sélectine-dépendance de contrôle) cellules KG1a ont été préparés et infusés dans la chambre d&#39;écoulement plus vivent IL- 1β stimulée HBMEC-60 prétraitées avec neutralisants anti-humain E-sélectine AcMo comme décrit plus haut. </li><li> Dosage de la sialidase digérée cellules KG1a roulant sur l&#39;IL-1β stimulée HBMEC-60. Cellules prétraitées avec KG1a 0.1U/ml Vibrio cholerae neuraminidase pendant 1 heure à 37 ° C ont été préparés et infusés dans la chambre de circulation au cours de l&#39;IL-1β direct stimulée HBMEC-60 comme décrit ci-dessus. </li><li> Dosage de la protéase cellulaire digérée KG1a roulant sur l&#39;IL-1β stimulée HBMEC-60. Cellules prétraitées avec KG1a protéase, bromélaïne 0.2U/ml pendant 1 heure à 37 ° C, ont été préparés et infusés dans la chambre de circulation au cours de l&#39;IL-1β direct stimulée HBMEC-60 comme décrit ci-dessus. </li></ol> 6. Analyse de la NIS-Elements-Capturé Cellules KG1a et représentation graphique des données cellulaire KG1a roulant <ol><li> Après la séquence de temps est acquise, sauvegarder les données. </li><li> Allez à «mesurer» l&#39;onglet sur la barre de menu et sélectionner &quot;définir le seuil.&quot; Déplacer les barres afin que les cellules désirées sont colorés en rouge. Sélectionnez &quot;toutes les images&quot; puis &quot;Ok&quot;. L&#39;ensemble du time-lapse séquence doit maintenant être modifié avec des globules rouges visibles roulant. </li><li> Aller à la &quot;mesure&quot; et sélectionnez &quot;restrictions&quot;. (Restrictions permettent à l&#39;utilisateur d&#39;exclure des objets seuillée qui ne représentent pas les cellules roulant. Ceci est principalement contexte créé par la monocouche HBMEC-60.) Sélectionnez «zone» et min d&#39;entrée et les valeurs max de la zone de cellules roulant. Répétez cette étape pour &quot;allongement&quot; et &quot;la circularité.&quot; </li><li> Sélectionnez &quot;mesure&quot; et sélectionnez &quot;créer binaire utilisant des restrictions&quot;, et définir les valeurs de restriction pour optimiser le logiciel de reconnaissance NIS-Elements de cellules roulant sur monocouche de cellules HBMEC-60. </li><li> Retour à «mesurer», sélectionnez «données sur le terrain&quot;, puis sélectionnez «données reset&quot;. Fermer ce menu. </li><li> Retour à la &quot;mesure&quot; et soisélectionnez «champ de lecture&quot;. </li><li> Ouvrez &quot;mesure&quot;; &quot;Les données de terrain», sélectionnez «numéro ou les objets&quot; puis sélectionnez &quot;tous les domaines» et exporter des données vers Microsoft Excel. </li><li> Sélectionnez &quot;Effacer les données» pour préparer l&#39;acquisition de cellules NIS-Elements de collecte de données suivant. </li></ol> Résultats: <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_8/1009_figure3.png" alt="Figure 3" width="600" height="382" /> Figure 3. Plaques parallèles Analyse Chambre de circulation de E-sélectine activité de liaison sur les cellules KG1a. Cellules traitées avec KG1a sialidase ou de la protéase ont été analysés pour l&#39;efficacité de roulement sur des monocouches de cellules HBMEC-60 pré-traitées avec de l&#39;IL-1β. Contrôle négatif rouler expériences ont également été menées par l&#39;analyse de cellules KG1a rouler sur la non-IL-1β stimulée HBMEC -60 cellules ou sur l&#39;IL-1β stimulée HBMEC-60 cellules traitées avec neutralisants anti-humain E-sélectine Moab (5D11). Fréquences de laminage de cellules ont été réalisés en triple et analysées avec le logiciel NIS-Elements. (Signification statistique *, p &lt;0,001) Dans ce rapport, basé sur la vidéo, nous avons fourni une représentation visuelle de la façon d&#39;analyser des leucocytes - les interactions des cellules endothéliales dans des conditions physiologiques des conditions de stress de cisaillement. En particulier, nous avons analysé le rôle de la E-sélectine - E-sélectine ligands dans la médiation de tethering leucocytes et de roulement, un comportement adhésif nécessaire à l&#39;engagement de l&#39;enseignement secondaire plus stable des activités contraignantes par le biais des récepteurs tels que les intégrines et des récepteurs de l&#39;acide hyaluronique. Utilisation de la chambre d&#39;écoulement à plaques parallèles adaptées pour une utilisation avec un microscope inversé, Harvard seringue pompe, caméra vidéo et du matériel d&#39;acquisition d&#39;ordinateur / portable, nous avons mené des expériences dans laquelle E-sélectine ligand + cellules KG1a ont été utilisés comme notre modèle de leucocytes et de cellules HBMEC (HBMEC- 60) stimulées par des cytokines pro-inflammatoires, l&#39;IL-1β, ont été utilisés comme notre E-sélectine + modèle de cellules humaines endothéliales (1-6). Comme indiqué précédemment, nous avons observé des cellules robustes KG1a roulant sur ​​l&#39;IL-1β stimulée HBMEC-60 cellules sur une gamme de niveaux de contrainte de cisaillement dans une manière E-sélectine-dépendant (Figure 3) (différence statistiquement significative par rapport aux cellules KG1a roulant sur non-IL-1β HBMEC-60 cellules stimulées). Des contrôles négatifs, qui se composait de cellules KG1a rouler sur la non-IL-1β stimulée HBMEC-60 cellules ou sur l&#39;IL-1β stimulée HBEMC-60 cellules prétraitées avec anti-humain E-sélectine mAb, ont été réalisées en parallèle afin de démontrer la dépendance de stimulation des cytokines et E-sélectine expression pour l&#39;activité de laminage (figure 3). Par ailleurs, l&#39;analyse de laminage de cellules prétraitées avec KG1a Vibrio cholerae neuraminidase (sialidase) ou avec la bromélaïne, une protéase non spécifique connu pour digérer la E-sélectine surface de la glycoprotéine ligand, a souligné l&#39;importance des résidus terminaux d&#39;acide sialique et de la glycoprotéine de surface pour la E-sélectine ligand l&#39;activité (2,3).

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukocytic+migration+to+inflamed+skin+with+a+novel+fluorosugar+modifier+of+cutaneous+lymphocyte-associated+antigen.">Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen.</a> J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 .</li><li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leukocyte+E-selectin+ligands,+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+and+E-selectin+ligand-1,+on+human+metastatic+prostate+tumor+cells.">Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells.</a> Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).</li><li>Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ameliorating+Skin-Homing+Receptors+on+Malignant+T+cells+with+a+Fluorosugar+Analog+of+N-acetylglucosamine:+P-selectin+Ligand+is+a+More+Sensitive+Target+than+E-selectin+Ligand.">Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand.</a> J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).</li><li>Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-homing+receptors+on+effector+leukocytes+are+differentially+sensitive+to+glyco-metabolic+antagonism+in+allergic+contact+dermatitis.">Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis.</a> J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).</li><li>Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+human+bone+marrow+endothelial+cells:+characterisation+of+new+cell+lines.">Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines.</a> Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt ou les divulgations.

Plaques parallèles d&#39;analyse chambre d&#39;écoulement est une société spécialisée dans le système de dosage in vitro utilisé pour l&#39;étude des leucocytes - interactions adhésives endothéliales dans des conditions de cisaillement semblables à celles transmises à la surface d&#39;une veinule post-capillaire. Comme le montre ici, dans notre présentation visuelle, nous démontrons la valeur de ce système d&#39;enquête sur le rôle de la E-sélectine - E-sélectine ligands dans la médiation de tethering leucocytes et roulant sur la surface de l&#39;endothélium microvasculaire activé. Nous aussi révéler l&#39;application de la protéase, glycosidases et les traitements anticorps bloquant pour élucider le rôle de la E-sélectine et ses ligands dans ce système. Ces analyses sont hautement reproductibles et de contribuer à former une base expérimentale pour l&#39;étude de la E-sélectine - Fonction ligand E-sélectine in vivo. En plus d&#39;étudier l&#39;adhésion cellulaire avec des monocouches de cytokines activés cellules endothéliales microvasculaires (veine ombilicale HBMEC ou humain ou cellules endothéliales microvasculaires dermiques), des dosages peuvent être effectués en utilisant purifiée recombinante humaine ou de la E-sélectine E-sélectine-Ig molécules chimériques comme substrat de l&#39;adhésion cellulaire. Autres interactions adhésives médiée par des leucocytes (L-)-sélectine et des plaquettes (P)-sélectine peuvent aussi être analysés en utilisant la technologie à plaques parallèles chambre d&#39;écoulement. En faisant varier le type de cellule monocouche / protéine substrat ou des leucocytes entrée / modèles cellulaires sélectine-transfectant, les enquêteurs peuvent étudier le rôle de ces interactions dans des conditions physiologiques des conditions de stress de cisaillement.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15575-038</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parallel-Plate Flow Chamber Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GlycoTech</td>
<td>31-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHD2000 Programmable Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35x10mm Tissue Culture Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD FALCON</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibronectin , from human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>86088-83-7 F2006-2MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Interleukin-1_, Human; Recombinant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>I9401-5UG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS (Hank s Buffered Saline Solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medium 199 w/ HEPES & Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12320-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Innovative Research, Inc.</td>
<td>IPLA-SER1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abraxis Pharmaceutical Products</td>
<td>504011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant human fibroblast growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>233-FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Test tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems	</td>
<td>BBA16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromelain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>B-4882</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
				 	
	

		</div>

analysis of physiologic e-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium

E-sélectine est une protéine de type-1 membrane sur les cellules endothéliales microvasculaires qui aide procéder au recrutement des leucocytes circulants vers les tissus cutanés, des os et enflammées. E-sélectine expression est constitutive le microvaisseaux cutanée et osseuse et est inductible par les cytokines pro-inflammatoires comme l&#39;IL-1α / et le TNF-α, sur microvaisseaux dans les tissus enflammés. Ce récepteur lectine médie les interactions faibles en glucides contraignant avec des contre-récepteurs ligands sur leucocytes circulants, ce qui entraîne un comportement caractéristique de roulement. Parce que ces interactions adhésives des événements précèdent plus stable et l&#39;activité diapédèse, la caractérisation de l&#39;activité de laminage des leucocytes et l&#39;identification des leucocytes E-sélectine ligands ont été les principaux objectifs dans les études de trafic des leucocytes et l&#39;inflammation et dans le développement de thérapies anti-inflammatoires (1-5) . Le but de ce rapport est de fournir un visuel, la description complète de la technologie la plus largement utilisée pour étudier la E-sélectine interactions ligand E-sélectine dans des conditions physiologiques des conditions d&#39;écoulement du sang. Notre laboratoire en collaboration avec le Centre de recherche sur les maladies cutanées Harvard utilise un état de l&#39;art à plaques parallèles appareil de chambre de circulation accompagnée de visualisation numérique et un logiciel d&#39;enregistrement de nouvelles, NIS-Elements. Cette technologie nous permet d&#39;analyser les événements d&#39;adhérence en temps réel pour la visualisation à l&#39;écran ainsi que l&#39;activité d&#39;enregistrement de roulement dans un format vidéo. Paramètres d&#39;adhérence cellulaire, tels que le laminage de fréquence, résistance au cisaillement et contraignant / tethering efficacité, sont calculées avec le logiciel NIS-Elements, exportés vers un tableur Excel et soumis à une analyse statistique. Dans la démonstration présentée ici, nous avons utilisé la chambre de circulation à plaques parallèles pour enquêter sur la E-sélectine-dépendante l&#39;activité des leucocytes roulant sur direct des cellules endothéliales de moelle osseuse (HBMEC). Homme cellules hématopoïétiques progénitrices KG1a, qui expriment un haut niveau de la E-sélectine ligand, ont été utilisés comme notre modèle leucocytes, tandis que d&#39;une ligne HBMEC immortalisée de cellules, cellules HBMEC-60, a été utilisé comme modèle de cellules endothéliales (6). Pour inciter et de simuler natif E-sélectine expression dans la chambre d&#39;écoulement, HBMEC-60 cellules ont d&#39;abord été activés par l&#39;IL-1. Notre vidéo de présentation a montré que l&#39;analyse des flux à plaques parallèles est une méthode appropriée pour l&#39;étude de la E-sélectine-médiée physiologique des leucocytes activités de laminage et que la caractérisation fonctionnelle des leucocytes E-sélectine ligand (s) dans la chambre d&#39;écoulement peut être constatée par la mise en œuvre de la protéase ou de glycosidases digestions.

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Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

Ce rapport fournit une représentation visuelle des plaques parallèles d&#39;analyse chambre d&#39;écoulement pour l&#39;étude des interactions des leucocytes endothéliales sous la contrainte de cisaillement physiologique. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier le rôle de l&#39;endothélium (E)-sélectine et la E-sélectine leucocytaire ligands qui déclenchent des leucocytes roulant sur la surface des cellules endothéliales.

Analyse des leucocytes roulant physiologique E-sélectine-Mediated sur l&#39;endothélium microvasculaire

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.0K vues.  Brigham and Women's Hospital. Ce rapport fournit une représentation visuelle des plaques parallèles d'analyse chambre d'écoulement pour l'étude des interactions des leucocytes endothéliales sous la contrainte de cisaillement physiologique. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier le rôle de l'endothélium (E)-sélectine et la E-sélectine leucocytaire ligands qui déclenchent des leucocytes roulant sur la surface des cellules endothéliales.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Recherche

Biologie

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Bioingénierie de l&#39;homme Réseaux microvasculaires chez des souris immunodéficientes

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Isolation de microvasculaire endothéliale des artères de résistance Tubes souris

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Mesure et analyse de la production extracellulaire acide pour Déterminer glycolytique Taux

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Quantification des protéines spécifiques au site Lysine acétylation et stoechiométrie Succinylation spectrométrie de masse indépendante des données Acquisition

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

Expression des protéines de Fusion Fluorescent en Murine dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques et Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.