Financiamento para esse projeto foi fornecida por um prêmio da Sociedade Americana de Câncer Research Scholar, (06-024-01-CSM para Charles J. Dimitroff), um dos Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional do Câncer de subvenção (RO1CA118124 para Charles J. Dimitroff) e um dos Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional de Artrite e Doenças músculo-esqueléticas e da pele de subvenção (P30 AR042689 o Dr. Thomas S. Kupper; Hospital Brigham and Women de Boston, MA).

1. Preparação de hBMEC (HBMEC-60 Cell) monocamada em placas de Petri para a Câmara de Fluxo <ol><li> Revestimento 35 x 10mm cultura de tecidos de pratos com 2ml de fibronectina 20μg/ml (em PBS) durante a noite a 4 ° C ou por 3 horas a 37 ° C. </li><li> Aspirar solução fibronectina dos pratos e acrescente 1,5 x10 5 células HBMEC-60 [Meio 199 com HEPES e Glutamina, 10% FBS, 10% de soro humano, 5 unidades / ml de heparina, 1ng/ml fator de crescimento humano recombinante de fibroblastos, 1% Penicilina- estreptomicina] para o prato e permitir-lhes crescer a&gt; confluência de 90%. (Isso leva 2 dias) </li><li> Aspirar meios de crescimento e, para se regular-E-selectina expressão, adicione meio fresco com IL-1β 50ng/mL para 4-6 hrs. Monocamadas de células agora está pronto para rolar ensaio. Para bloquear E-selectina função, neutralizando anti-humano E-selectina Moab (clone BBIG-E4 (5D11)) podem ser adicionados a 20μg/ml para ~ 1h a 37 ° C. </li></ol> 2. Preparação de células progenitoras hematopoéticas KG1a para Câmara de Fluxo <ol><li> Células progenitoras hematopoéticas KG1a são cultivadas a confluência (1x10 6 células / ml) em RPMI-1640 com glutamina e 10% FBS / 1% de penicilina-estreptomicina e são pipetados diretamente do frasco para utilização em ensaio de câmara de fluxo. </li><li> Número de células é calculada usando um hemocitômetro e depois as células são re-suspenso em 1 x 10 6 células / mL em HBSS com 10 mM HEPES (H / H buffer) e CaCl 2 2mM </li><li> Células são armazenadas no gelo até a sua utilização no ensaio. </li></ol> 3. Preparação de Microscópio Câmara de Fluxo, de placas paralelas e bomba de seringa (Figura 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_7/1009_figure1.png" alt="Figura 1" width="600" height="409" /> Figura 1. Ilustração de placas paralelas Análise Câmara de Fluxo. Microscópio invertido, Harvard bomba de seringa, computador de câmera / e de placas paralelas câmara de fluxo são colocados em um arranjo ideal para análise de células eficientes e reprodutíveis. <ol><li> Ligue a alimentação e fonte de luz para microscópio invertido e poder de bomba de seringa e selecione a objetiva de 10x no microscópio. </li><li> Coloque 50 mL em tubo cônico titular e encher com H / H e 2mM CaCl 2. </li><li> Lugar de tubos de plástico de 5 ml de teste em tubo de ensaio titular abaixo do tubo de 50 ml cônico </li><li> Coloque 60ml seringa na bomba de seringa (Certifique-se que tanto o êmbolo da seringa e do corpo são ambos garantidos). </li><li> Anexar 3 vias-stop pau-de-final da seringa 60ml e anexar seringa de 5 ml para 3 vias-stop-galo. </li><li> Coloque aparelho Câmara paralela de fluxo (GlycoTech, Inc.) no palco microscópio com tubo de entrada para a direita, tubo de saída para a esquerda e tubo de vácuo para trás. </li><li> Anexar tubos de vácuo para vácuo e válvula de ar livre para que os aparelhos de placas paralelas para aderir ao palco. (Isso testa se a saia de vácuo na câmara de fluxo é hermético.) Desligue a válvula de ar. </li><li> Ligar a linha de saída de tubos (à esquerda de microscópio) para 3-way-stop-galo. Aparelho está agora preparado para a colocação no HBMEC-60 placa monocamada. </li><li> Coloque placa de monocamada HBMEC-60 e colocar no centro do microscópio. </li><li> Ligue vácuo e posição do aparelho câmara de fluxo acima da placa de tal forma que a placa monocamada está no centro. </li><li> Delicadamente mais baixo do aparelho câmara de fluxo na placa monocamada HBMEC-60 e que os aparelhos câmara de fluxo de sucção para baixo. (Não deve haver nenhum som de ar escapando e, neste ponto você pode precisar de aplicar pressão sobre a câmara para comprimir a junta de borracha). </li><li> Uma vez vácuo foi estabelecido, tubo de entrada local (à direita) para dentro do tubo cônico contendo 50mL H / H com 2mM CaCl 2. </li><li> Abrir 3 vias-stop-galo para permitir o fluxo para a seringa 60ml e bomba lugar no &quot;modo de bomba.&quot; </li><li> Para retirar o ar de entrada / saída de linhas sem levantar as células na placa, use a bomba de seringa fixada em 2mL/minute para encher o tubo de entrada, em seguida, definir rapidamente a 0,5 mL / minuto apenas antes de o líquido atinge o aparelho. É imperativo para preparar este jogo com cuidado e evitar bolhas de ar que vai levantar a monocamada da placa. </li><li> Uma vez que o fluido é visto para entrar na seringa 60ml, a câmara de fluxo e bomba de seringa foram preparadas e da câmara de fluxo está pronto para uso. Esta configuração será repetido para cada execução de entrada de célula e para cada novo prato necessário. </li></ol> 4. Captura dos leucócitos Eventos do Rolling usando NIS Elements <ol><li> Elementos aberta NIS no desktop. </li><li> Pressione o botão &quot;play&quot; ícone para imagem ao vivo. Exposição automática permitirá que você ver a placa mais fácil para agora e é importante para focagem. </li><li> Certifique-se que microscópio está focado corretamente na monocamada de células. </li><li> Uma vez focada, a exposição re-set a 1 luz de quadros / segundo e ajustar no microscópio. A imagem deve aparecer no computador e não estar mais visível no visor do microscópio, devido ao nível de pouca luz. Histograma de luz pode então ser adajustada para eliminar a exposição de fundo ou melhorar a clareza da célula. </li><li> Clique em bin 2X2 ou Bin Live para obter imagem que é ideal para captura de filme </li><li> Clique em &quot;Macro&quot; na barra de menu e selecione &quot;gravar na porta&quot;; selecione a porta &quot;COM3&quot; e &quot;aberto&quot;. (Isso abre a porta para coordenar com a bomba de seringa. </li><li> Pipetar 1 ml de suspensão de células KG1a no tubo de ensaio 5ml perto da linha de tubulação de entrada e em seguida, coloque linha de tubulação de entrada para o fundo do tubo de ensaio. </li><li> Ir para barra de menus, clique em &quot;Capture&quot;, &quot;aquisição de lapso de tempo.&quot; </li><li> Um novo menu irá aparecer. Selecione o protocolo com duração 210 segundos, esta é a duração do programa para rolar em HBMEC-60 Cells. (Cada fase é programado para tirar uma foto a cada segundo para a duração do protocolo de bomba. Também é configurado para enviar um comando através da porta COM3 para ligar a bomba.) Se lapso de tempo é interrompida, a bomba não vai parar por conta própria e deve ser reposto. Pressione Cancelar para voltar a viver da imagem. </li><li> Definir a bomba de seringa para &quot;Modo de Programação&quot; de acordo com manual de instruções. (Modo Programa permite a programação manual de taxas de fluxo específico (ou seja, níveis de estresse de cisalhamento), a ser transmitido dentro da câmara e ditar as interações célula KG1a sobre a monocamada de células HBMEC-60.) Configurações para KG1a célula rolando em Células hBMEC foram os seguintes 4,2 dinas / cm 2 por 45 s, 0,3 dinas / cm 2 por 60 s, e aumenta gradualmente a cada 15 s até um máximo de 4,2 dinas / cm 2 </li><li> Parede de tensão de cisalhamento (W st) na câmara foi calculada de acordo com a seguinte equação: W st = 6μQ / a b 2, onde μ é a viscosidade estimada dos meios de comunicação (0,0076 P), Q é a vazão volumétrica em ml / s, a é a altura do canal (espessura da junta) em cm (0,03 cm), e b é a largura do canal em cm (0,5 cm). Vazões foram regulamentados usando o modo de programação da bomba de seringa. </li><li> Microscópio e computador agora está pronto para capturar lapso de tempo fotografia. Pressione &quot;start run&quot; no computador para começar a aquisição de dados. Durante a execução do programa, não se esqueça de adicionar mídia para o tubo de ensaio contendo células KG1a a fim de manter a tubulação de entrada / saída completa do meio (Certifique-se que não há bolhas de ar). </li></ol> 5. Dependência de sialilação Terminal e glicoproteína de superfície de E-selectina-mediada por células KG1a 5. Rolamento (Figura 2; Vídeos Clipes de 5,1-5,5) <ol><li> Dosagem de KG1a célula rolando sobre a não-estimulada HBMEC-60 células. (Controle negativo), células KG1a foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver não-IL-1β estimulada HBMEC-60 conforme descrito acima. </li><li> Dosagem de célula KG1a rolando no HBMEC-60 células pré-tratadas com IL-1β. (E-selectina-dependência controle) KG1a células foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver IL-1β estimulada HBMEC-60 conforme descrito acima. </li><li> Dosagem de célula KG1a rolando no HBMEC-60 células pré-tratadas com IL-1β e neutralizantes anti-humano E-selectina Moabe. (E-selectina-dependência controle) KG1a células foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver IL- 1β estimulada HBMEC-60 pré-tratados com anti-humano neutralizando Moabe E-selectina como descrito acima. </li><li> Dosagem de células-sialidase digerida KG1a rolando no IL-1β estimulada HBMEC-60. KG1a células pré-tratadas com 0.1U/ml Vibrio cholerae neuraminidase de 1hr a 37 ° C foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver IL-1β estimulada HBMEC-60 conforme descrito acima. </li><li> Dosagem de célula protease-digerida KG1a rolando no IL-1β estimulada HBMEC-60. KG1a células pré-tratadas com protease, 0.2U/ml Bromelain de 1h a 37 ° C, foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver IL-1β estimulada HBMEC-60 conforme descrito acima. </li></ol> 6. Análise do NIS Elements-Cells KG1a Capturado e gráficos de Cell KG1a Dados do Rolling <ol><li> Após seqüência de tempo é adquirido, salvar os dados. </li><li> Ir para &quot;medir&quot; a guia na barra de menu e selecione &quot;definir limite.&quot; Mover barras de modo que as células desejadas são coloridos em vermelho. Selecione &quot;todas as imagens&quot; e depois &quot;Ok&quot;. A seqüência de lapso de tempo inteiro deve agora ser modificado com vermelho visível células de rolamento. </li><li> Vá para &quot;Medir&quot; e selecione &quot;restrições&quot;. (Restrições permitem ao usuário excluir objetos thresholded que não representam as células de rolamento. Isto é principalmente de fundo criado pela monocamada HBMEC-60.) Selecione &quot;área&quot; e min de entrada e os valores máximo para a área de células de rolamento. Repita este passo para &quot;alongamento&quot; e &quot;circularidade&quot;. </li><li> Selecione &quot;medida&quot; e selecione &quot;criar binários usando restrições&quot;, e definir os valores de restrição para otimizar NIS Elements software de reconhecimento de células rolando em monocamada de células HBMEC-60. </li><li> Voltar para &quot;medir&quot;, selecione &quot;Os dados de campo&quot; e selecione &quot;dados reset&quot;. Fechar este menu. </li><li> Retorno à &quot;Medida&quot; e SEselecione &quot;campo scan&quot;. </li><li> &quot;Medida&quot; aberto &quot;; Os dados de campo&quot;, selecione &quot;número ou Objects&quot; e selecione &quot;todos os campos&quot; e exportar dados para o Microsoft Excel. </li><li> Selecione &quot;dados claros&quot; para preparar-NIS Elements aquisição de células para a coleta de dados seguinte. </li></ol> Resultados: <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_8/1009_figure3.png" alt="Figura 3" width="600" height="382" /> Figura 3. Parallel Plate-Análise Câmara Fluxo de E-selectina-Binding Atividade em Células KG1a. KG1a células tratadas com sialidase ou protease foram analisados ​​para rolar a eficiência em monocamadas de HBMEC-60 células pré-tratadas com IL-1β. Controle negativo rolando experimentos também foram realizados por meio da análise de células KG1a rolando sobre a não-IL-1β estimulada HBMEC -60 células ou IL-1β estimulada HBMEC-60 células tratadas com anti-humano neutralizando E-selectina Moab (5D11). Freqüências de rolamento de células foram realizadas em triplicata e analisados ​​com NIS Elements software. (Significância estatística *, p &lt;0,001) Neste relatório, baseado em vídeo, nós fornecemos uma representação visual de como analisar leucócitos - células endoteliais interações fisiológicas sob condições de estresse de cisalhamento. Em particular, analisamos o papel da E-selectina - E-selectina ligantes na mediação tethering leucócitos e rolando, um comportamento adesivo necessário para o compromisso do ensino secundário mais estável atividades de ligação através de receptores, como integrinas e receptores de ácido hialurônico. Usando a câmara de fluxo de placas paralelas adaptada para uso com um microscópio invertido, bomba de Harvard Seringa, câmera de vídeo e computador / celular de aquisição de hardware, realizamos experimentos em que E-selectina ligante + células KG1a foram usados ​​como nosso modelo de leucócitos e células hBMEC (HBMEC- 60) estimuladas com citocinas pró-inflamatórias, IL-1β, foram usados ​​como o nosso E-selectina modelo de células endoteliais humanas + (1-6). Como relatado anteriormente, observamos células KG1a robusta rolando no IL-1β estimulada HBMEC-60 células em um intervalo de níveis de tensão de cisalhamento de uma maneira E-selectina-dependente (Figura 3) (diferença estatisticamente significativa quando comparada com células KG1a rolando no não-IL-1β HBMEC-60 estimulou as células). Controles negativos, que consistia em KG1a célula rolando sobre a não-IL-1β estimulada HBMEC-60 em células ou IL-1β estimulada HBEMC-60 células pré-tratadas com mAb anti-humano E-selectina, foram realizados em paralelo para demonstrar a dependência de estimulação de citocinas e E-selectina expressão para a atividade de rolamento (Figura 3). Além disso, análise de rolamento de células pré-tratadas com KG1a Vibrio cholerae neuraminidase (sialidase) ou com bromelina, uma protease não específica conhecida para digerir superfície E-selectina glicoproteína ligante, destacou a importância dos resíduos de ácido siálico terminais e glicoproteína de superfície de E-selectina ligante atividade (2,3).

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukocytic+migration+to+inflamed+skin+with+a+novel+fluorosugar+modifier+of+cutaneous+lymphocyte-associated+antigen.">Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen.</a> J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 .</li><li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leukocyte+E-selectin+ligands,+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+and+E-selectin+ligand-1,+on+human+metastatic+prostate+tumor+cells.">Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells.</a> Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).</li><li>Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ameliorating+Skin-Homing+Receptors+on+Malignant+T+cells+with+a+Fluorosugar+Analog+of+N-acetylglucosamine:+P-selectin+Ligand+is+a+More+Sensitive+Target+than+E-selectin+Ligand.">Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand.</a> J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).</li><li>Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-homing+receptors+on+effector+leukocytes+are+differentially+sensitive+to+glyco-metabolic+antagonism+in+allergic+contact+dermatitis.">Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis.</a> J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).</li><li>Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+human+bone+marrow+endothelial+cells:+characterisation+of+new+cell+lines.">Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines.</a> Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse ou divulgações.

De placas paralelas análise câmara de fluxo é uma empresa especializada sistema in vitro utilizado para estudar leucócitos - interações adesivas endoteliais sob condições de estresse de cisalhamento semelhantes aos transmitidos na superfície de uma vênula pós-capilar. Tal como é descrito aqui, em nossa apresentação visual, que demonstram o valor deste sistema para investigar o papel da E-selectina - E-selectina ligantes na mediação tethering leucócitos e rolando sobre a superfície do endotélio microvascular ativado. Nós também revelam a aplicação de glicosidase protease, e os tratamentos de anticorpos bloqueadores para elucidar o papel da E-selectina e seus ligantes neste sistema. Estas análises são altamente reprodutíveis e ajudar a formar uma base experimental para o estudo de E-selectina - E-selectina função de ligante in vivo. Além de estudar a adesão celular com monocamadas de citocinas ativadas células endoteliais microvasculares (veia umbilical hBMEC ou humanos ou células endoteliais microvasculares dérmicas), os ensaios podem ser realizados utilizando humana recombinante purificada E-selectina ou E-selectina-Ig moléculas quiméricas como substrato de adesão celular. Interações outro adesivo mediada por leucócitos (L)-selectina e de plaquetas (P)-selectina também podem ser analisadas utilizando-placa paralela tecnologia de câmara de fluxo. Variando o tipo de substrato celular monocamada / proteína ou de leucócitos de entrada / modelos-selectina transfectant célula, os pesquisadores podem estudar o papel dessas interações sob condições de estresse fisiológico de cisalhamento.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15575-038</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parallel-Plate Flow Chamber Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GlycoTech</td>
<td>31-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHD2000 Programmable Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35x10mm Tissue Culture Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD FALCON</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibronectin , from human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>86088-83-7 F2006-2MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Interleukin-1_, Human; Recombinant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>I9401-5UG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS (Hank s Buffered Saline Solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medium 199 w/ HEPES & Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12320-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Innovative Research, Inc.</td>
<td>IPLA-SER1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abraxis Pharmaceutical Products</td>
<td>504011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant human fibroblast growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>233-FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Test tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems	</td>
<td>BBA16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromelain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>B-4882</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
				 	
	

		</div>

analysis of physiologic e-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium

E-selectina é uma proteína de membrana tipo-1 em células endoteliais microvasculares que ajuda a iniciar o recrutamento de leucócitos circulantes para os tecidos ósseos cutânea, e inflamado. E-selectina expressão é constitutiva de microvasos dérmica e óssea e é induzível por citocinas pró-inflamatórias, como IL-1α / TNF-α e, em microvasos em tecidos inflamados. Este receptor medeia a lectina fracas interações de ligação com carboidratos contra receptor-ligantes em leucócitos circulantes, o que resulta em um comportamento característico de rolamento. Porque essas interações precedem eventos adesivo mais estável e atividade diapedese, caracterização da atividade rolling de leucócitos e identificação de leucócitos E-selectina ligantes foram objetivos principais em estudos de tráfico de leucócitos e inflamação e no desenvolvimento de terapêuticas anti-inflamatórios (1-5) . A intenção deste relatório é fornecer uma descrição, visual abrangente da tecnologia mais amplamente utilizada para estudar a E-selectina E-selectina interações ligante sob condições de fluxo fisiológico de sangue. Nosso laboratório em conjunto com o Centro de Pesquisas de Doenças da Pele Harvard usa um state-of-the-art de placas paralelas aparelhos de câmara de fluxo acompanhada através da visualização digital e software de gravação de novo, NIS Elements. Esta tecnologia permite-nos analisar os eventos de adesão em tempo real para visualização na tela assim como a atividade registro rolando em um formato de vídeo. Parâmetros de adesão celular, tais como a resistência ao rolamento, frequência de corte e ligação / tethering eficiência, são calculados com NIS Elements software, exportados para uma planilha do Excel e submetidos à análise estatística. Na demonstração apresentada aqui, foi empregado o câmara de fluxo de placas paralelas para investigar E-selectina-dependente a atividade de leucócitos rolando ao vivo medula óssea humana endotelial (hBMEC). Células progenitoras hematopoéticas KG1a, que expressam um alto nível de E-selectina ligante, foram utilizados como nosso modelo de leucócitos, enquanto que uma linha celular imortalizada hBMEC, HBMEC-60 celas, foi usado como nosso modelo de células endoteliais (6). Para induzir e simular expressão E-selectina nativa na câmara de fluxo, HBMEC-60 células foram ativado pela primeira vez com a IL-1. Nossa apresentação de vídeo mostrou que placas paralelas análise de fluxo é um método adequado para estudar a E-selectina mediada fisiológico de leucócitos atividades rolamento e que a caracterização funcional de ligante E-selectina leucócitos (s) na câmara de fluxo pode ser verificada através da implementação de protease ou glicosidase digestões.

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Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

Este relatório fornece uma representação visual de placas paralelas análise câmara de fluxo para o estudo de interações leucócitos endoteliais sob tensão de cisalhamento fisiológico. Este método é particularmente útil para investigar o papel do endotélio (E)-selectina e E-selectina leucócitos ligantes que leucócitos gatilho rolando na superfície das células endoteliais.

Análise da Rolling Leucócitos Fisiológica E-Selectina-Mediated no endotélio microvascular

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

analysis-physiologic-e-selectin-mediated-leukocyte-rolling-on

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K visualizações.  Brigham and Women's Hospital. Este relatório fornece uma representação visual de placas paralelas análise câmara de fluxo para o estudo de interações leucócitos endoteliais sob tensão de cisalhamento fisiológico. Este método é particularmente útil para investigar o papel do endotélio (E)-selectina e E-selectina leucócitos ligantes que leucócitos gatilho rolando na superfície das células endoteliais.