Nous remercions le Dr Pina Colarusso et le Fonds pour Live Cell Imaging pour leur aide avec l&#39;imagerie et l&#39;analyse d&#39;image, Mme Lailey pour son assistance technique et l&#39;unité 51 à l&#39;Hôpital Foothills de Calgary, AB pour la fourniture de cordons ombilicaux humains. Le Dr Patel KD est un Innovates Alberta: Health Solutions scientifique. Ce travail a été soutenu par une subvention de fonctionnement de l&#39;Institut canadien de recherche en santé et subventions d&#39;équipement et d&#39;infrastructure de la Fondation canadienne pour l&#39;innovation et l&#39;Alberta Science and Research Authority.

1. L&#39;isolement et la maintenance des cellules endothéliales vasculaires humaines <ol><li> Niveau 2 procédures de biosécurité doit être utilisé lorsque l&#39;on travaille avec du sang et de tissus humains. L&#39;aide de ciseaux couper le cordon du placenta, puis d&#39;examiner de près le cordon de caillots sanguins et les dommages causés par le clampage du cordon pendant l&#39;accouchement. Couper et jeter ces parties de la moelle. </li><li> Préparer la solution de collagénase fraîche à 1 mg / ml en versant 50 ml de tampon cordon chaud dans un tube qui contient 50 mg de la collagénase. </li><li> Changement dans les gants stériles et d&#39;ouvrir un plateau à instruments stérilisés autoclavé contenant canules mousses, pinces, ciseaux, de la moelle à trois voies robinets d&#39;arrêt et de la gaze dans une hotte à flux laminaire. </li><li> Identifier les deux artères et du présent seule veine dans la moelle. Les artères sont plus petits et ont tendance à être étroitement resserré, tandis que la veine est grand et facile à cathétériser. Pour vider le sang de la veine, insérer doucement une canule d&#39;un robinet à deux voies qui s&#39;y rattachent into une extrémité de la veine et le lieu d&#39;une pince autour de la canule pour le maintenir fermement en place. Perfuser tampon cordon à travers la veine. Répétez jusqu&#39;à ce que l&#39;écoulement à travers est clair, puis serrer l&#39;extrémité de la corde. </li><li> Collagénase perfuser dans la veine, fermer le robinet, placez le cordon dans un bécher contenant un tampon cordon chaud et incuber pendant 10 minutes. Après 10 minutes, retirez le cordon et masser doucement le cordon pour desserrer les cellules endothéliales de la lumière de la veine. Videz la solution dans le tube contenant des cellules endothéliales des médias (ECM). Rincer avec un tampon de cordon à deux reprises pour éliminer les cellules restantes. Videz la solution dans le même tube. </li><li> Centrifuger les cellules à 350 xg pendant 10 minutes à granulés les cellules endothéliales. </li><li> Eliminer le surnageant et ajouter 10 ml d&#39;ECM au culot. Resuspendre doucement les cellules de l&#39;ECM, puis de transférer les cellules à un flacon T75 pré-enduit avec 0,2% de gélatine. Pré-revêtement avec de la gélatine a été fait pour au moins 1 heure à 37 ° C. Cultiver les cellules à 37 ° C et 5% De CO 2. </li><li> Le lendemain, secouez doucement le flacon pour déloger les globules rouges, puis enlever le surnageant et laver avec une solution chaude saline équilibrée de Hank (HBSS). Retirer HBSS et nourrir les cellules avec 10 ml d&#39;ECM chaud. Examiner les cellules sous le microscope pour s&#39;assurer que les globules rouges ont été retirés. Évaluer le degré de confluence et de la morphologie des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales à ce stade doit être allongée sans aucun signe de vacuoles. </li><li> Continuer à changer les médias tous les trois jours jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent confluence, les cellules, puis répartis en utilisant une solution de 0,08% de trypsine contenant 1 mM d&#39;EDTA. Cellules endothéliales dans des boîtes de plaques désirées pré-enduit avec 0,2% de gélatine. Les cellules doivent atteindre la confluence en 3-6 jours. </li><li> Lorsque vous utilisez ibidi chambres, pré-couche chaque chambre avec 0,2% de gélatine. Enlever l&#39;excès de gélatine et de la fibronectine, puis ajoutez 1,5 X 10 6 / mL de cellules endothéliales en suspension dans l&#39;ECM dans la chambre. Changer les médias tous les jours jusqu&#39;à ce que confluent. Les cellules doivent être confluentes en 2-3 jours en fonction de la moelle. </li></ol> 2. Préparation de neutrophiles <ol><li> Les neutrophiles ont été isolés à partir du sang périphérique de volontaires sains en utilisant la centrifugation de densité. Un protocole détaillé avec une démonstration visuelle pour l&#39;isolement des neutrophiles peut être trouvée dans le numéro précédent de cette revue 6. Une fois isolés, des cellules neutrophiles Resuspendre à une concentration de 1x10 6 / ml dans du HBSS contenant 0,5% d&#39;albumine humaine. </li></ol> 3. Mise en place de la Chambre ibidi <ol><li> Cultiver les cellules endothéliales dans une chambre de la gélatine enduit ibidi. Examinez tous les jours en utilisant la microscopie à contraste de phase jusqu&#39;à ce qu&#39;ils deviennent bien confluentes. </li><li> Stimuler les cellules endothéliales pour augmenter l&#39;expression des molécules d&#39;adhésion et d&#39;activation. Pour les fins du présent protocole, les cellules endothéliales sont stimulées avec 10 ng / ml de TNF recombinant-α pendant quatre heures à 37 ° C et 5% de CO <sub&gt; 2 avant la mise en place de la chambre ibidi pour l&#39;imagerie dans des conditions d&#39;écoulement. </li><li> Préparer le microscope, et la pompe seringue comme décrit visuellement par Wiese et ses collègues 11 en utilisant une chambre vide ibidi. </li><li> Principales différences entre ce protocole et la procédure Wiese inclure le pré-remplissage du tube pour prévenir l&#39;exposition des cellules endothéliales dans l&#39;air, le maintien de la mémoire tampon à 37 ° C en utilisant un bain d&#39;eau, en utilisant des tubes PharMed de garder la mémoire tampon de perdre la température et l&#39;utilisation de différents objectifs sur le microscope selon que l&#39;imagerie à contraste de phase ou de fluorescence. </li><li> Une fois que le microscope est mis en place et le tube est rempli avec du HBSS, fermez toutes les robinets et de supprimer la chambre vide ibidi. </li><li> Connectez la chambre ibidi contenant du TNF-α stimulé les cellules endothéliales à la tubulure. </li></ol> 4. Le recrutement des neutrophiles et de la Transmigration <ol><li> Visualisez la monocouche de cellules endothéliales dans le Microscope l&#39;aide d&#39;un objectif de phase 10x contraste. </li><li> Définir la pompe à seringue de retirer et de commencer l&#39;écoulement de HBSS à la contrainte de cisaillement de consigne (typiquement entre 0,5 à 2 dynes / cm 2). </li><li> Sur le côté de l&#39;entrée, commutateur de HBSS à neutrophiles isolés (1x10 6 / ml) en tournant la façon dont trois robinet. </li><li> Commencer l&#39;enregistrement à l&#39;aide d&#39;une caméra CCD reliée soit à un enregistreur de DVD ou relié directement à l&#39;ordinateur. Démarrer la minuterie lorsque les neutrophiles pénètrent dans la chambre. Perfuser neutrophiles pendant quatre minutes. Un total de 3 mL de la suspension de neutrophiles est suffisante pour une expérience unique. </li><li> Après quatre minutes, revenir à HBSS pour empêcher la fixation de nouveaux neutrophiles. Si les données concernant les interactions au total, le produit laminé et d&#39;adhérence ferme sont souhaitées, image 6 champs aléatoires pendant 10 secondes chacune avec un objectif de phase 10x contraste entre 4 et 5 minutes. </li><li> Basculer vers un objectif 40x et d&#39;enregistrer un seul champ de vue entre 5 et 10 minutes. A 10 minutes, recueillir desentre 5 et 10 champs de vue aléatoires. </li><li> Arrêter l&#39;écoulement et de passer à la chambre suivante. </li></ol> 5. L&#39;imagerie de fluorescence dans des conditions de débit utilisant une chambre d&#39;ibidi <ol><li> Cellules endothéliales ou l&#39;étiquette soit neutrophiles avec une sonde fluorescente d&#39;intérêt. Par exemple, un anticorps anti-VE-cadhérine conjugué à Alexa-[547] peut être utilisé pour visualiser jonctions des cellules endothéliales. </li><li> Assemblez chambre ibidi sur un microscope à contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) et des capacités fluorescentes. Nous utilisons un FluoView 1000 confocale (Olympus) avec une chambre de l&#39;environnement. Concentrez-en utilisant un objectif conçu pour le travail DIC et fluorescente. </li><li> Acquérir des images simultanées DIC et les lampes fluorescentes à l&#39;aide du logiciel fourni par le vendeur, tout en suivant le cours du temps décrit à la section 4. </li></ol> 6. Analyse du recrutement des neutrophiles <ol><li> Analyse du matériel et d&#39;interagir des cellules est décrite par Wiese et al 11. </li&gt; <li> Pour mesurer le pourcentage de neutrophiles qui roulent sur la monocouche endothéliale compter le nombre de neutrophiles qui ont ému plus d&#39;un diamètre de cellule dans une période de 5 secondes. Divisez ce chiffre par le nombre total de leucocytes dans le domaine afin de déterminer le pourcentage de cellules de roulement. Par extension, les cellules restantes sont considérées comme très adhérente. </li><li> Mesurer la vitesse de roulement de neutrophiles en calculant la distance parcourue dans le neutrophile une période donnée, puis en le divisant par ce temps en secondes. </li><li> Transmigration est déterminé en comptant le nombre de neutrophiles qui ont changé de forme et a migré au-dessous de la monocouche 10. Ces neutrophiles sont identifiés par le fait qu&#39;ils changent la phase d&#39;être claire lorsqu&#39;il est sur ​​le dessus de la monocouche d&#39;être foncée de phase lorsque dessous de la monocouche 10. Le nombre de cellules transmigré peut être exprimée en pourcentage des cellules totales dans le champ de vision ou en tant que première insensibleer des cellules transmigré par unité de surface. Dans ce système modèle, typiquement 50% de neutrophiles transmigrent après 10 minutes. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Les cellules endothéliales non stimulées ne prend pas en charge le recrutement des neutrophiles. En revanche, la stimulation des cellules endothéliales avec le TNF-alpha dans les résultats des neutrophiles de roulement, l&#39;adhérence ferme et la transmigration. Un exemple de ces données est montré dans les figures 1 et 2. La figure 1A montre les neutrophiles qui interagissent avec le TNF-α-cellules endothéliales stimulées. Ces interactions peuvent être quantifiés, révélant le nombre total de neutrophiles qui interagissent avec les cellules endothéliales ainsi que le nombre de neutrophiles roulants, adhérente ou transmigré (Figure 2). La transmigration des neutrophiles peut se produire au niveau des jonctions cellulaires ou par l&#39;intermédiaire des cellules endothéliales elles-mêmes. Pour différencier ces deux conditions, les cellules endothéliales sont marquées avec un anti-VE-c<html> anticorps adherin et la transmigration est marqué comme se produisant paracellularly ou transcellularly (figure 1B et C). Dans ce modèle, la quasi-totalité transmigration est paracellulaire 7. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> Figure 1. DIC simultanée et l&#39;imagerie de fluorescence dans des conditions d&#39;écoulement à l&#39;aide d&#39;une chambre ibidi. (A) image DIC fraîchement isolés neutrophiles humains qui migrent à travers les cellules endothéliales de veines ombilicales. Le jaune flèche montre un neutrophiles adhérente; la flèche blanche indique un neutrophile transmigrant. (B) jonctions des cellules endothéliales ont été colorées avec un anticorps anti-VE-cadhérine conjugué à Alexa-[547] et imagé. (C) montre superposition de canaux A et B révèle que la quasi-totalité transmigrant dans ce modèle est paracellulaire. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . _content &quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> Figure 2. Les cellules endothéliales ont été laissés non stimulées ou ont été stimulées avec 10 ng / ml de TNF-α. Après 4 heures, une chambre à plaques parallèles de débit a été assemblé et neutrophiles ont été perfusés à travers au 1 dyn / cm 2. (A) les interactions neutrophiles ont été examinés et mesurés à l&#39;aide du logiciel ImageJ du NIH. Les cellules en interaction totales ont été caractérisés comme (B) de roulement, adhérente ou (C) transmigrant. Les données représentent la moyenne + SEM comprise entre 3 et 5 expériences. La différence entre le contrôle et le TNF dans les panneaux A et C était significative (p &lt;0,001).

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	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li><li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells.">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li><li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials.">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

<html> Les chercheurs ont systématiquement utilisé des cellules endothéliales à partir de différents lits vasculaires pour étudier le recrutement des neutrophiles et la transmigration. Les exemples incluent, mais ne sont pas limités à, des cellules endothéliales microvasculaires dermiques 12, le foie les cellules endothéliales sinusoïdales 13 et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine 10. Parmi eux HUVEC acquis une grande popularité en raison de leur relative f...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif et le matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> La collagénase de type 1 </td><td> Worthington </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon cordon </td><td></td><td></td><td> Composition: NaCl 140 mM 4 mM de KCl 10 mM de D-glucose dans 1mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 à pH 7,4 </td></tr><tr><td> Médias cellules endothéliales (ECM) </td><td></td><td></td><td> M199 avec des sels d&#39;aigle supplémentés avec du sérum humain 16% contenant 100 unités de pénicilline 100 ug de streptomycine et de 0,3 mg de L-glutamine/ml </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> Le glutamate streptomycine pénicilline (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi chambres </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro Tech </td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td> Solution d&#39;albumine humaine 20% </td><td> Bioproduits Gemini </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS sans Ca 2 + et Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> HBSS avec Ca 2 + et Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

Les neutrophiles sont le type le plus abondant de globules blancs. Ils constituent une partie essentielle du système immunitaire inné 1. Au cours de l&#39;inflammation aiguë, les neutrophiles sont des cellules inflammatoires premiers à migrer vers le site de la lésion. Le recrutement des neutrophiles à un site de la lésion est un processus par étapes qui comprend d&#39;abord, la dilatation des vaisseaux sanguins pour augmenter le flux sanguin, en deuxième lieu, les changements structurels microvasculaires et d&#39;échapper à des protéines plasmatiques de la circulation sanguine, en troisième lieu, le laminage, l&#39;adhérence et la transmigration des neutrophiles dans l&#39;ensemble du accumulation et quatrième neutrophiles au site de la lésion 2,3; endothélium. Un large éventail de in vivo et in vitro a évolué pour permettre l&#39;étude de ces 4 processus. Cette méthode met l&#39;accent sur la transmigration des neutrophiles à travers les cellules endothéliales humaines. Une méthode populaire pour l&#39;examen des processus moléculaires impliqués dans la transmigration des neutrophiles utilise humaine neutrophils interagissant avec les cellules humaines primaires endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) 5. L&#39;isolement des neutrophiles a été décrit visuellement ailleurs 6; donc cet article vous montrera la méthode pour l&#39;isolement de cellules HUVEC. Une fois isolées et cultivées à confluence, les cellules endothéliales sont activées aboutissant à la régulation à la hausse des molécules d&#39;adhésion et l&#39;activation. Par exemple, l&#39;activation des cellules endothéliales avec des cytokines telles que le TNF-alpha entraîne la E-sélectine augmenté et IL-8 expression 7. E-sélectine médie de capture et le laminage de neutrophiles et d&#39;IL-8 et d&#39;activation de médiateur d&#39;adhérence ferme de neutrophiles. Après neutrophiles adhérence transmigrer. Transmigration peut se produire paracellularly (à travers les jonctions des cellules endothéliales) ou transcellularly (à travers la cellule endothéliale elle-même). Dans la plupart des cas, ces interactions se produisent dans des conditions d&#39;écoulement trouvés dans le système vasculaire 7,8. La chambre de plaques parallèles de débit est un système largement utilisé que mile cisaillement hydrodynamique micros contraintes trouvé in vivo et permet l&#39;étude du recrutement des neutrophiles dans des conditions d&#39;écoulement in vitro 9,10. Plusieurs entreprises produisent parallèles chambres d&#39;écoulement de la plaque et ont chacune leurs avantages et leurs inconvénients. Si fluorescente imagerie est nécessaire, en verre ou en une optiquement similaire polymère doit être utilisé. Les cellules endothéliales ne poussent pas bien sur le verre. Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour l&#39;imagerie à contraste de phase, DIC et de la transmigration des neutrophiles fluorescente utilisant une lame de faible volume canal ibidi constitué d&#39;un polymère qui prend en charge l&#39;adhérence et la croissance rapides des cellules endothéliales humaines et a des qualités optiques qui sont comparables à verre. Dans cette méthode, les cellules endothéliales ont été cultivées et stimulées dans une μslide ibidi. Les neutrophiles ont été introduits dans des conditions d&#39;écoulement et de la transmigration a été évaluée. L&#39;imagerie de fluorescence des jonctions activé en temps réel de détermination de l&#39;étendue de paracellulaire par rapporttransmigration transcellulaire.

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Cet article décrit tout d&#39;abord une procédure pour isoler les cellules endothéliales humaines de veines ombilicales puis montre comment utiliser ces cellules pour examiner la transmigration des neutrophiles dans des conditions d&#39;écoulement. En utilisant une chambre d&#39;écoulement à faible volume faite d&#39;un polymère avec des caractéristiques optiques de verre, des cellules vivantes d&#39;imagerie de fluorescence de populations de cellules rares est également possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K vues.  University of Calgary. Cet article décrit tout d'abord une procédure pour isoler les cellules endothéliales humaines de veines ombilicales puis montre comment utiliser ces cellules pour examiner la transmigration des neutrophiles dans des conditions d'écoulement. En utilisant une chambre d'écoulement à faible volume faite d'un polymère avec des caractéristiques optiques de verre, des cellules vivantes d'imagerie de fluorescence de populations de cellules rares est é...

Vidéo: Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Recherche

Immunologie et infection

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Human neutrophiles Chambre flux Essai d&#39;adhésion

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

L&#39;utilisation de la cytométrie de flux pour évaluer l&#39;état de la chromatine dans les cellules T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Étude simultanée du recrutement des sous-populations de Monocyte sous flux In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...