Nous remercions le Dr T. Otis, département de neurobiologie, UCLA, pour le partage de l&#39;installation TPLSM avec nous, le Dr C. Fahlke, Institut de Physiologie, RWTH Aachen, en Allemagne, pour le don en nature du plasmide pEYFP-ClC1, et M. . R. Serrano pour le soutien technique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH / NIAMS subventions et AR047664 AR54816.

Procédures expérimentales pour l&#39;électroporation in vivo de muscles FDB et IO <ol><li> Avant de commencer l&#39;électroporation in vivo dans des protocoles, des plasmides d&#39;expression mammifère doit être amplifié pour produire de concentration dans la gamme de à 2-5 mg Remarque plasmidique / ul de TE:. Nous utilisons régulièrement des kits d&#39;amplification commerciaux et suivre les procédures du fabricant. Plasmides d&#39;expression commerciaux transportant le travail promoteur CMV très bien dans le muscle squelettique de transfections in vivo. </li><li> Aliquoter le volume nécessaire (10-20 pi) de la solution de plasmide et l&#39;enregistrer dans deux tubes de 0,5 ml Eppendorf (une pour chaque pied de la souris). </li><li> Préparer une solution contenant 2 mg / ml de hyaluronidase dans le Tyrode stérile. </li><li> Utiliser une boîte anesthésier, profondément anesthésier une souris utilisant 4% d&#39;isoflurane en O2 avec une machine à gaz anesthésique approuvé. Placez l&#39;animal sur un coussin chauffant (37 ° C) et de maintenir l&#39;anesthésie avec un masque facial chez les rongeurs. Surveiller la profondeur de l&#39;anesthésie par réflexe pincement de l&#39;orteil. </li><li> Sous observation avec un microscope à dissection, injecter 10 ul de la solution de hyaluronidase sous les coussinets d&#39;un pied de la souris en utilisant une 1 &quot;de long aiguille de calibre 33 stérile. Pénètrent dans la peau à un point proche du talon du pied et de faire avancer l&#39;aiguille sous la peau vers la base des orteils pour ~ 1 / 4 &quot;. </li><li> Répétez la procédure avec l&#39;autre pied s&#39;il le désire. </li><li> Débranchez l&#39;anesthésie et le lieu de la souris dans une cage. Laissez-le se remettre complètement de l&#39;anesthésie. </li><li> Après une heure, anesthésier l&#39;animal pour une deuxième fois et le placer sur le coussin chauffant. Suivant la même procédure décrite pour la solution de hyaluronidase, injecter un total de 20-50 pg de l&#39;ADN plasmidique (selon la taille de la construction plasmidique). Le volume d&#39;injection totale devrait être inférieure à 20 pl / pied. Remarque: lorsque L μ 15-20 est nécessaire, il est conseillé de fermer la peau au point d&#39;entrée d&#39;aiguille avec le tissu de la colle. </li><li> Débranchez l&#39;anesthésie et le lieu de la souris dans une cage. Laissez-le se remettre complètement de l&#39;anesthésie et d&#39;attendre 10-15 minutes. </li><li> Anesthésier les animaux pour la troisième fois et le placer sur le coussin chauffant. </li><li> Sélectionnez un pied de l&#39;animal. Placez une aiguille d&#39;acupuncture plaqué or sous la peau au niveau du talon, et un second à la base des orteils. Les électrodes sont orientés parallèlement les uns aux autres et perpendiculaires à l&#39;axe longitudinal du pied. </li><li> Connectez la tête des aiguilles (électrodes) au stimulateur électrique à l&#39;aide de micro-clip connecteurs. Électroporation les muscles en appliquant des impulsions 20, 20 ms en durée / chacune, à 1Hz. Selon l&#39;espacement des électrodes, l&#39;amplitude de la tension des impulsions &#39;est ajustée (en surveillant avec un oscilloscope) pour donner un champ électrique de ~ 100 Note V / cm:. Pas de contractions en réponse à des stimuli doit être observée si le niveau de L&#39;anesthésie est adéquat. </li><li> Si désiré, répétez la procédure ci-dessus dans le pied controlatéral de l&#39;animal. </li><li> Retour à l&#39;animal de sa cage et une fois complètement récupéré de l&#39;anesthésie le maintenir sous observation. Note: si la procédure a normalement, l&#39;animal devrait retrouver une mobilité complète dans les 30 minutes et est ensuite prêt à être renvoyé à la salle des animaux à la vivarium. Les injections de hyaluronidase et de l&#39;ADN dans les coussinets plantaires n&#39;ont pas perceptibles des effets néfastes sur les animaux. Une fois remis de l&#39;anesthésie, les souris sont capables de déambuler normalement autour de la cage. Comme précaution supplémentaire, ajouter à l&#39;eau potable de l&#39;animal au carprofène 0,0027 mg / ml pendant 2 jours comme un analgésique. </li><li> L&#39;expression des protéines peuvent être dosées 2-8 jours après la transfection. Cependant, l&#39;expression de nombreuses protéines soutenue a été observée pendant des mois. </li></ol> REMARQUE: Toutes les procédures animales étaient approuvés par le Comité du chancelier UCLA Animal Research comme prescrit par la Loi sur la protection des animaux et de la politique du PHS sur les soins aux animaux et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Les résultats représentatifs: La mise en œuvre correcte de l&#39;électroporation in vivo dans les procédures décrites ci-dessus devrait se traduire par la transfection de plasmides efficaces dans les muscles FDB et IO. Toutefois, l&#39;efficacité de l&#39;expression des variants de la protéine transgénique dépendra du plasmide, la taille et la complexité de la protéine, les propriétés fonctionnelles de la protéine, et un certain nombre d&#39;autres variables hors de notre contrôle. Comme l&#39;illustre la figure 1 pour un muscle FDB électroporation dans la présence d&#39;un plasmide commercial (PMR-mCherry) codant pour la protéine mCherry, la plupart des fibres musculaires sont transfectées avec notre protocole, comme illustré par le fait que la plupart d&#39;entre eux d&#39;affichage à fluorescence rouge. Cela n&#39;exclut pas la possibilité que les fibres individuelles présentent différents degrés d&#39;expression de protéines, ou que quelques fibres ne sont pas du tout transfectées 3. Il doit be fait remarquer que l&#39;expression efficace de grandes quantités de protéines fluorescentes comme mCherry, EGFP, ECFP et EYFP, n&#39;altère pas l&#39;excitabilité des fibres musculaires et propriétés de couplage excitation-contraction. En fait, ils sont indiscernables de ceux des muscles simulacre transfectées (résultats non présentés). Approches pratiques utilisées pour vérifier l&#39;expression des protéines localisées fluorescence marqués dans les fibres musculaires squelettiques. La localisation intracellulaire des protéines exprimées di novo transgénique est évaluée régulièrement par l&#39;acquisition simultanée, en utilisant le TPLSM, images fluorescentes des balises respectives et des images de marqueurs bien identifié des structures cellulaires. Le plus typique de ces derniers sont: a) la génération de second harmonique (SHG) des images, qui proviennent de l&#39;anisotropie de la myosine sarcomériques Un bandes (centré à la M-lignes) 9,10, et b) di-8-ANEPPS de fluorescence images, qui peuvent être obtenues par marquage de la surface et transversale tubulaire (T-tubules) système de membranes des fibres musculaires avec cette dye11 imperméants potentiométrique. Dans les images de fluorescence des fibres musculaires colorés avec di-8-ANEPPS, le T-tubules apparaissent comme des bandes étroites de la fluorescence orienté approximativement orthogonale à l&#39;axe longitudinal de la fibre. Ces bandes sont inégalement espacées les unes des autres: ils sont séparés par une longue distance qui s&#39;étend à travers le M-lignes, et une courte qui s&#39;étend à travers la ligne Z 11. Expression et localisation des α-actinine-EGFP dans les fibres musculaires squelettiques. Un exemple de l&#39;expression d&#39;une variante de la protéine marqués musculaires structurelles α-actinine est montré dans la figure 2. Cette protéine est connue pour être une composante majeure de la ligne Z et, en tant que telle, est couramment utilisé comme marqueur de cette structure12. Nous transfectées muscles FDB et IO avec le plasmide pEGFPN1-α-actinin1 d&#39;encodage pour l&#39;homme (non musculaire) α-actinine marqués au terminal C avec EGFP. Six jours après la transfection, nous avons constaté que, tel qu&#39;évalué par la fluorescence EGFP distribution, α-actinine est surtout exprimée à bandes étroites régulièrement espacés le long de l&#39;axe de la fibre. Une seule bande par sarcomère est considéré (Figures 2A et 2D). La colocalisation de ces bandes avec le Z-lignes est démontrée en comparant la distribution de l&#39;EGFP par fluorescence avec le SHG (figure 2B) et di-8-ANEPPS (figure 2E) des images. Comme le montre l&#39;image de superposition (figure 2C), α-actinine-EGFP bandes alternées avec des bandes de SHG, ce qui indique qu&#39;ils sont situés à mi-chemin entre deux consécutifs M-bandes, coïncidant avec l&#39;emplacement de Z-lignes. Dans les fibres musculaires transfectées colorés avec di-8-ANEPPS, α-actinine-EGFP bandes sont vu centré entre chaque paire de tubules T (figure 2F) qui sont connus pour le flanc de la Z-lignes (c&#39;est à dire séparées par une distance plus courte), indiquant ainsi que transgénique α-actinine est ciblée sur les Z-line. Expression de DHPRα1s marqués à l&#39;extrémité N-terminale avec EGFP L&#39;efficacité de la transfection du muscle avec pEGFPC1.1-DHPR 1s α est vérifiée dans les images TPLSM (figure 3A comme) montrant que la plupart des fibres d&#39;exprimer EGFP-DHPRα1s (une protéine transmembranaire). La caractéristique la plus importante de fibres transfectées est le modèle double-bandes de la EGFP par fluorescence (figures 3A et 3B) comme on s&#39;y attendrait si cette protéine a été ciblée sur les T-tubules. Il peut également être observé dans la figure 3 que tout l&#39;affichage des différentes fibres différents niveaux d&#39;intensité de fluorescence, le modèle de fluorescence bandes d&#39;une fibre individuelle semble être maintenue homogène le long de la fibre. Au plus fort grossissement (figure 3B), il peut être clairement vu que l&#39;espacement inégal entre les bandes est similaire à celle observée dans les fibres tachées di-8-ANEPPS (Figure 2E, par exemple). Les images de superposition (figure 3B &amp; 3E) illustrent le fait que les bandes SHG sont situés dans le plus grand espacement entre EGFP-DHPRα1s bandes, corroborant que cette protéine est à la T-tubules. D&#39;autres mesures de FRET avec l&#39;anion non fluorescents lipophiles DPA (données non présentées) démontrent en outre que la fraction EGFP est au sein de quelques nanomètres de le feuillet interne des membranes des tubules T &#39;. La localisation et l&#39;évaluation fonctionnelle de l&#39;expression de EYFP-ClC1 Fibres transfectées avec pEYFP-ClC1, qui code pour une construction EYFP-marqués (à l&#39;extrémité N-terminale) du canal chlorure de muscle squelettique (ClC1), affichage des bandes de fluorescence EYFP (figure 4A) avec une tendance similaire à celle observée pour l&#39;EGFP-DHPRα1s &#39;expression (figure 3A) et correspondant à l&#39;arrangement T-tubules comme illustré avec coloration di-8-ANEPPS (figure 2E). Comme prévu, la superposition de EYFP-ClC1 (figure 4A) et les images SHG (figure 4B) comme indiqué dans la superposition (figure 4C), illustrent le fait que les bandes SHG sont centrés à l&#39;espacement des grandes of entre les bandes de fluorescence EYFP. Afin d&#39;évaluer si l&#39;expression de EYFP-ClC1 traduit par une augmentation significative de la conductance de repos des fibres musculaires, comme prévu par la surexpression de canaux chlorure fonctionnel, nous fibres musculaires dissociées enzymatiquement à partir du muscle FDB transfectées et étudié leurs propriétés électrophysiologiques utilisant un microélectrodes deux montage expérimental décrit précédemment 6,11,13. La figure 5 montre les résultats de deux fibres: une exprimant de grandes quantités de EYFP-ClC1 tel qu&#39;évalué par des mesures globales d&#39;intensité de fluorescence dans un microscope standard à fluorescence (non représenté), et l&#39;autre est un contrôle non transfectées. Le record de tension dans la figure 5A (obtenu à partir de la fibre musculaire exprimer EYFP-ClC1) démontre qu&#39;en raison de la conductance excessive de repos, la fibre est presque non-excitables. Impulsions de relance actuels jusqu&#39;à 400nA (0.5ms) nécessaires pour être utilisé afin d&#39;obtenir une réponse très faible activité (pas de figure 5A dépassement,). Après le remplacement de la solution de Tyrode externe à un contenant 500 uM de l&#39;inhibiteur des canaux chlorure de 9-ACA, 200 impulsions nA actuelles étaient suffisantes pour susciter un potentiel d&#39;action (figure 5B), mais beaucoup plus lent et plus larges que celles enregistrées dans la fibre de contrôle ( La figure 5C). Comme prévu, plus de 9-ACA a eu des effets minimes sur cette fibre de contrôle (figure 5D). <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="Figure 1" border="0" /> Figure 1. Efficacité de transfection de la méthode d&#39;électroporation in vivo. Brightfield (A) et de fluorescence (B) des images d&#39;un muscle FDB transfectées avec PMR-mCherry. Jours après le protocole d&#39;électroporation: 12 jours. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">cliquez ici</a> pour une version agrandie de la figure 1. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Expression et le ciblage des α-actinine-EGFP dans les fibres de FDB. Panels A et B sont de fluorescence EGFP et images SHG, respectivement, d&#39;une fibre exprimer α-actinine-EGFP. Panel C est une superposition des images de A et B. Les panneaux D et E sont des images de fluorescence d&#39;une autre fibre exprimer α-actinine-EGFP et colorées avec di-8-ANEPPS, respectivement. Panneau de F est la superposition d&#39;images dans D et E. Jours après l&#39;électroporation protocole: 6 jours. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Expression et le ciblage de l&#39;EGFP-DHPRα1s en fibres FDB. Groupe A, l&#39;EGFP image de fluorescence d&#39;un groupe de fibres exprimant l&#39;EGFP-DHPRα1s. Groupe B est un agrandissement de la place dans le panneau A, afin de mieux montrer le modèle bandes de l&#39;expression des protéines. Panel C est l&#39;image SHG correspondant à l&#39;image dans le panneau A. D Panel est la superposition des images A et C. Groupe E est un élargissement de la zone indiquée dans Jours D. panneau après le protocole d&#39;électroporation: 20 jours. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Expression et le ciblage des EYFP-ClC1 en fibres FDB. Les panneaux A et B sont de fluorescence EYFP et images SHG, respectivement, de fibres exprimant EYFP-ClC1. Panel C est la superposition des images dans les panneaux A et B. Groupe D est un profil d&#39;intensité mesurée le long de la ligne blanche en surbrillance dans l&#39;image dans Jours C. panneau après le protocole d&#39;électroporation: 7 jours. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Fibres évaluation électrophysiologique exprimer transgéniques EYFP-ClC1. Panels A et B sont des enregistrements de tension d&#39;une fibre exprimer EYFP-ClC1 en réponse à des impulsions de courant, avant et après traitement avec 9-ACA, respectivement. Panneaux C et D sont des enregistrements de tension (potentiel d&#39;action) a suscité en réponse à des impulsions de courant dans une fibre non transfectées avant et après traitement avec 9-ACA, respectivement.

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The authors have nothing to disclose.

Nous décrivons ici les étapes détaillées qui doivent être suivies afin d&#39;atteindre transfections efficace de plasmides ADN dans les fibres musculaires squelettiques par électroporation in vivo. Les principaux avantages de notre approche sont la simplicité de mise en œuvre et son caractère invasif minimal qui en résulte risque négligeable pour la santé des animaux. En réalité, les protocoles ci-dessus décrite électroporation n&#39;entraînent pas beaucoup plus que les injections sous-cutanée...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

Un intérêt croissant pour la biologie cellulaire est d&#39;exprimer des formes modifiées transgénique de protéines essentielles (par exemple les constructions fluorescence marqués et / ou de variants mutants) afin d&#39;étudier leur distribution endogène et de la pertinence fonctionnelle. Une approche intéressante qui a été mis en œuvre pour atteindre cet objectif dans les cellules complètement différenciées est le<em&gt; In vivo</emTransfection&gt; de plasmides par diverses méthodes dans des tissus spécifiques tels que le foie<sup&gt; 1</sup&gt;, Le muscle squelettique<sup&gt; 2,3</sup&gt;, Et même le cerveau<sup&gt; 4</sup&gt;. Nous présentons ici une description détaillée des étapes qui doivent être suivies afin d&#39;transfecter efficacement matériel génétique dans les fibres du<em&gt; Court fléchisseur des orteils</em&gt; (FDB) et<em&gt; Interosseux</em&gt; (OI) des muscles de souris adultes en utilisant une<em&gt; In vivo</emApproche de l&#39;électroporation&gt;. Les paramètres expérimentaux ont été optimisés de manière à maximiser le nombre de fibres musculaires transfectées tout en minimisant les dommages tissulaires qui peuvent nuire à la qualité et la quantité des protéines exprimées dans les fibres individuelles. Nous avons vérifié que la mise en œuvre de la méthodologie décrite dans cet article les résultats d&#39;un haut rendement de protéines solubles, soit EGFP et ECFP<sup&gt; 3</sup&gt;, La calpaïne, FKBP12, β2a-DHPR, etc; protéines structurales, c&#39;est à dire minidystrophine et α-actinine et les protéines membranaires, soit α1s-DHPR, RyR1, cardiaques Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Échangeur, NaV1.4 canaux Na, SERCA1, etc, lorsqu&#39;il est appliqué à FDB, IO et autres muscles de souris et de rats. L&#39;expression efficace de certaines de ces protéines a été vérifiée avec biochimiques<sup&gt; 3</sup&gt; Et fonctionnelles des preuves<sup&gt; 5</sup&gt;. Cependant, de loin l&#39;approche la plus commune de confirmation que nous utilisons sont la norme microscopie à fluorescence et la microscopie laser 2-photons balayage (TPLSM), qui permettent d&#39;identifier non seulement l&#39;expression d&#39;ensemble, mais aussi la localisation intracellulaire détaillées, des constructions de protéines par fluorescence marqués. La méthode pourrait être également utilisé pour transfecter des plasmides codant pour l&#39;expression des protéines de pertinence physiologique (comme ici), ou pour l&#39;interférence ARN (siRNA) visant à supprimer l&#39;expression des protéines normalement exprimés (non testé par nous encore). Il faut noter que la transfection de fibres musculaires FDB et IO est particulièrement pertinent pour l&#39;enquête de la physiologie musculaire chez les mammifères car les fibres enzymatiquement dissocié de ces muscles sont actuellement l&#39;un des modèles les plus appropriés pour étudier les mécanismes de base de couplage de l&#39;excitabilité et excitation-contraction dans conditions pince de courant ou tension<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

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DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Nous décrivons des procédures détaillées pour la transfection efficace de l&#39;ADN plasmidique dans les fibres des muscles du pied des souris vivantes en utilisant l&#39;électroporation et la visualisation ultérieure de l&#39;expression des protéines en utilisant la microscopie à fluorescence.

Transfection d&#39;ADN des mammifères muscles squelettiques à l&#39;aide In Vivo L&#39;électroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

17.7K vues.  David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. Nous décrivons des procédures détaillées pour la transfection efficace de l'ADN plasmidique dans les fibres des muscles du pied des souris vivantes en utilisant l'électroporation et la visualisation ultérieure de l'expression des protéines en utilisant la microscopie à fluorescence.

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Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

L&#39;électroporation cellule unique in vivo dans le cerveau intact développement

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Recherche

Biologie

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Microinjection d&#39;ADN dans intranucléaires Dissocié neurones de mammifères adultes

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

L&#39;analyse de l&#39;ADN double-brin Break (ORD) de réparation dans les cellules de mammifères

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Évaluation ex vivo de la contractilité, fatigabilité et isolées du Alternans muscles squelettiques

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo L&#39;électroporation et microinjection de testicule de souris

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Détection et analyse de l&#39;ADN dommages souris muscle squelettique<em&gt; In Situ</em&gt; Utilisation de la méthode TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

ADN électroporation, isolement et d&#39;imagerie de myofibres

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.