Auteurs tiens à remercier Nancy Downer et tous les membres du laboratoire de Chimie Analytique, Université de Rome &quot;Tor Vergata&quot; pour leur collaboration et le soutien logistique. Ce travail a été soutenu par le projet européen &quot;BioCop&quot;.

1) Le blocage des billes magnétiques revêtues: Procédez comme suit pour bloquer billes magnétiques recouvertes: <ol><li> Préparer un ensemble de deux tubes Eppendorf ml; </li><li> Homogénéiser (secousses, mais pas vortex) de billes magnétiques recouvertes (voir l&#39;annexe pour la préparation des billes magnétiques recouvertes) en utilisant l&#39;échantillon tournant mélangeur; </li><li> Immédiatement après homogénéisation, une pipette 10 ul de billes magnétiques recouvertes dans chaque tubes Eppendorf distinctes; </li><li> Ajouter 1 ml de lait écrémé en solution de blocage dans chacun des tubes Eppendorf de l&#39;ensemble; </li><li> Laissez les billes magnétiques incuber pendant 30 min à température ambiante sur le mélangeur de l&#39;échantillon en rotation; </li><li> Retirer la solution de blocage: pour ce faire placer le tube dans concentrateur de particules magnétiques avec la partie magnétique mis sur pendant 2 min (voir billes magnétiques coller sur la paroi latérale du tube); soigneusement la pipette le surnageant en laissant intactes perles; </li><li> Ajouter 1 ml de tampon PBS + NaN 3 + BSA comme solution de stockage pour chaque tube; </li><li> Magasin de revêtement et bloqué les billes magnétiques à 4 ° C (s&#39;il vous plaît noter que des billes magnétiques revêtues sont stables pendant au moins 2 mois à 4 ° C); </li></ol> 2) de la chaîne immunologiques sur des billes magnétiques pour la construction de la courbe d&#39;étalonnage et d&#39;analyse d&#39;échantillon Procédez comme suit pour avoir des billes magnétiques prêt pour la mesure: <ol><li> Prenez un tube Eppendorf (2 ml) de solution de revêtement et bloquées pour chaque extrait de l&#39;échantillon que vous allez à analyser; </li><li> Prenez un tube supplémentaire pour chaque Eppendorf solution d&#39;étalonnage de travail; </li><li> Homogénéiser les billes magnétiques pendant 2 min sur le mélangeur échantillon tournant avant utilisation; </li><li> Retirer le liquide de stockage en utilisant concentrateur de particules magnétiques; </li><li> Laver les billes magnétiques à trois reprises avec la solution de lavage PBS / BSA. Retirer liquide de lavage; </li><li> Étape du concours: Ajouter à chaque tube contenant les billes lavées magnétiques, 200 pl de l&#39;échantillon extrait préparé; utiliser un tube de bille magnétique pour chaque échantillon. Répétez la même procédure pour chaque solution standard. Ajouter 200 pi de solution d&#39;anticorps monoclonaux pour chaque tube bille magnétique. Laissez les billes magnétiques incuber pendant une demi-heure sur la table de mixage échantillon tournant à température ambiante; </li><li> Retirer de tubes Eppendorf la solution utilisée pour la compétition-étape; </li><li> Étiquetage étape: Ajouter 400μl d&#39;anticorps secondaire marqué à chaque tube Eppendorf bille magnétique. Laissez les billes magnétiques incuber pendant une demi-heure sur la table de mixage échantillon tournant à température ambiante; </li><li> Enlever étiquette de la solution provenant de tubes Eppendorf; </li><li> Laver les billes magnétiques à trois reprises avec du PBS / Tween ® 20 solution de lavage. Retirer du liquide; </li><li> Resuspendre avec 100 pi de tampon DEA chaque aliquote de billes magnétiques. Maintenant, les billes magnétiques sont prêts pour l&#39;étape de mesure électrochimique; </li></ol> 3) Assemblée des PalmSens avec le multiplexeur (MUX) des options S&#39;il vous plaît noter: produits d&#39;hydrolyse enzymatique du substrat fautes de la surface de l&#39;électrode, pour cette raison une nouvelle électrode est nécessaire pour chaque mesure. <ol><li> Connecter un PC portable à PalmSens par le câble série; </li><li> Connectez la prise DIN du 9-CH8 multiplexeur avec PalmSens. </li><li> Branchez le câble série de huit canaux de contact électrique avec Mux CH8 Multiplexeur; </li><li> Bande d&#39;électrode place sur le bloc aimant huit. Prêtez attention à placer chaque aimant sous chaque électrodes de travail (à noter, la nécessité d&#39;un aimant unique pour chaque électrode est impératif sinon les particules magnétiques ne sera pas concentré sur la zone des électrodes de travail); </li><li> Branchez la bande électrodes en huit canaux contact électrique Mux; </li></ol> Pour la mesure DPV utiliser les paramètres suivants dans les cases appropriées: E commencer: 0 (V); fin E: 0,6 (V); étape E: 0,016 (V); impulsion E: 0,0339 (V); E conditionné: le taux de numérisation;:; 0 (V) 0 (V) E dépôt : 0,1 (V / s); T impulsion: 0,06 (s); conditionné T: 0 (s); dépôt T: 0 (s); équilibration T: 8 (s). 4) la réaction enzymatique et mesure électrochimique <ol><li> Homogénéiser en agitant chaque tube Eppendorf contenant des billes magnétiques prêt pour l&#39;étape de mesure électrochimique afin d&#39;obtenir une suspension bien dispersée de billes magnétiques; </li><li> Pipette de chaque Eppendorf, immédiatement après homogénéisation, une aliquote de 20 ul de la dispersion par billes magnétiques sur la surface de l&#39;électrode de travail correspondant. Pour chaque électrode d&#39;une utilisation de bande 20 ul de billes magnétiques provenant des tubes Eppendorf différents (par exemple l&#39;utilisation d&#39;électrodes pour huit huit différents Eppendorf); </li><li> Ajouter 80 ul de solution de substrat enzymatique sur la première électrode. Démarrer 2 min décompte. Après 14 secondes, ajouter 80 ul de solution de substrat enzymatique sur la deuxième électrode. Après 14 secondes supplémentaires, ajouter 80 ul de solution de substrat enzymatique sur la troisième électrode. Procéder à l&#39;int en même tempsErval (14 secondes) jusqu&#39;à la dernière électrode (ce qui signifie: déposer chaque aliquote de substrat avec des intervalles de 14 secondes). L&#39;intervalle de temps de 14 sec est calculée comme le temps requis par le potentiostat pour effectuer la mesure; à noter, la solution 80 ul de chaque capteur doit couvrir l&#39;électrode de travail, de référence et de contre. Par ailleurs, les solutions pour chaque capteur ne doit pas entrer en contact avec des solutions d&#39;électrodes voisines. </li><li> Après les 2 min décompte de la première addition de solution de substrat enzymatique, lancer la mesure électrochimique; </li><li> Utilisez le PalmSens Lite logiciel pour obtenir des pics de courant (mA) pour chaque solution. </li></ol> 5) Calcul Établir une courbe d&#39;étalonnage en utilisant une équation logistique à 4 paramètres et de calculer la concentration du total des HT-2/T-2 montant de toxine en nanogrammes par millilitre pour chaque tube Eppendorf contenant l&#39;échantillon inconnu. Les données expérimentales, la hauteur du pic (uA) contre la concentration de l&#39;calibrants (ng / ml), doivent être équipés avec un non-linéaire à quatre paramètres logistiques (4-PL) tracer l&#39;équation (1) (en utilisant Terrain Sigma 8.0 ou Kaleidagraph). Le non-linéaire 4-PL modèle est généralement adopté pour décrire les essais de liaison du ligand (LBA) 6. <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> (1) a, b, x0, y0 sont des paramètres logistiques comme donné par le programme tracé Sigma ajustement de la courbe. Utilisez la formule explicitées pour calculer la teneur des HT-2/T-2 montant total de toxines dans la solution d&#39;extrait échantillon dilué <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="Équation 2" /> (2) x est la concentration massique de la quantité totale de toxines HT-2/T-2 dans la solution d&#39;extrait dilué, calculé à partir de l&#39;équation logistique à 4 paramètres en nanogramme par milliltre (ng / ml) y est la valeur actuelle en uA obtenus pour l&#39;échantillon inconnu Annexe 6) de billes magnétiques recouvertes Procédez comme suit pour avoir des billes magnétiques revêtues: Procédure de lavage <ol><li> Homogénéiser Dynabeads tosylactivated ® M-280 (solution stock 2 x 109 billes / ml) en agitant et en vortex (vitesse max) pendant 1 min (éviter de faire mousser) (S&#39;il vous plaît noter la concentration de billes magnétiques a besoin d&#39;être toujours le même pour assurer la reproductibilité de la mesure); </li><li> Immédiatement pipette de 1 ml de billes au-dessus homogénéisé dans un tube Eppendorf de 2 ml; </li><li> Placer le tube dans concentrateur de particules magnétiques avec la partie magnétique mis sur pendant 2 min (voir billes magnétiques coller sur la paroi latérale du tube); </li><li> Soigneusement pipette le surnageant en laissant intactes perles; </li><li> Retirez le tube Eppendorf du concentrateur de particules magnétiques et remettre en suspension les perles dans 1 ml de 0,1 M pH tampon borate 9,5. Mélanger doucement pendant 2 min dans le mélangeur échantillon tournant pendant 2 min; </li><li> Pipeter le surnageant; </li><li> Pipeter 1 ml de solution tampon de borate dans le tube Eppendorf. Les billes magnétiques sont maintenant prêtes pour l&#39;étape d&#39;enrobage; </li></ol> Procédure de revêtement <ol start="8"><li> Ajouter 600 ml de HT-2 conjugué avec une solution stock de KLH (Keyhole Limpet Keyhole) à 1 ml de billes magnétiques) (dernière HT-2-KLH concentration de 375 mg / ml); incubation des billes magnétiques et HT-2-KLH solution pour 20h à 37 ° C * avec une rotation lente sur le tilt rotation mélangeur d&#39;échantillons; </li><li> Après une incubation lieu le tube dans le concentrateur de particules magnétiques et la pipette le surnageant; Lavez billes revêtues deux fois avec 1 ml de solution tampon PBS / BSA. Entre chaque lavage retirer PBS / BSA solution. Toutes les étapes de lavage ont été effectués mise en billes magnétiques et PBS / BSA sur mélangeur rotatif pendant 5 min; </li><li> Laver les billes magnétiques fois en utilisant 1 ml de solution tampon Tris / BSA. Retirer TRIS / solution de BSA. Effectuer cette étape en fixant des billes magnétiques et TRIS / BSA tampon sur tournante mélangeur pendant 4 h à 37 ° C *; </li><li> Laver les billes magnétiques fois en utilisant 1 ml de rafraîchi (conservés au réfrigérateur à 4 ° C) PBS / BSA solution tampon. Retirer du PBS / BSA solution. Effectuer cette étape de réglage des billes magnétiques et de tampon PBS / BSA sur la rotation de mixage pour 5min à température ambiante; </li><li> Après l&#39;étape de lavage supprimer tous les liquides de lavage et ajouter 1 ml de tampon PBS + NaN 3 + BSA comme liquide de conservation; </li><li> Magasin de billes magnétiques recouvertes à 4 ° C (s&#39;il vous plaît noter que des billes magnétiques revêtues sont stables pendant au moins 2 mois à 4 ° C); </li></ol> * A cet effet, le mélangeur est placé dans un four équipé d&#39;un trou qui permet l&#39;insertion du câble pour l&#39;alimentation. Alternativement, le mélangeur peut être placé dans une chambre thermostatée à 37 ° C. La préparation des échantillons 7) et l&#39;extraction 25 g d&#39;échantillon finement broyé (céréales pour bébés nourriture ou petit déjeuner), nous sommesighed dans un récipient du mélangeur et extrait avec 100 ml d&#39;acétonitrile / solution d&#39;eau (86/14) pendant 3 min dans un mélangeur à haute vitesse. Après centrifugation à 4000 rpm (3000 g) pendant 5 min, 8 ml de surnageant ont été prélevés et purifiés avec colonne Mycosep, 4 ml de l&#39;extrait nettoyées ont été séchés sous flux d&#39;azote. Échantillons séchés peuvent être stockés à -30 ° C jusqu&#39;à plusieurs mois. 8) la reconstitution échantillon Céréales pour petit déjeuner Reconstituer l&#39;extrait le petit déjeuner de céréales sèches (nourriture à base de céréales destinés à la consommation des adultes) avec 40 ml de PBS pH 7,4. De cette manière, un échantillon avec une concentration de toxine égale à la limite légale supposée (200 ng / g) donnera à l&#39;étape de mesure d&#39;un signal tombant au milieu de la plage de travail. La nourriture pour bébé Reconstituer l&#39;extrait sec d&#39;aliments pour bébés (aliments à base de céréales destinés à la consommation infantile) avec 4 ml de PBS. De cette manière, un échantillon avec une concentration de toxines égale à la limite légale supposée (20-25 ng / g) donnera à l&#39;étape de mesure d&#39;un signal tombant au milieu de la plage de travail.

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

L&#39;utilisation d&#39;anticorps comme sonde de reconnaissance biomoléculaire a vu une utilisation généralisée des technologies de détection; méthodes de détection immunochimiques, tels que ELISA et MEIAs, sont, aujourd&#39;hui, parmi les plateformes les plus utilisées et appliquées dans de nombreux laboratoires 7. Bien que ces approches obtenir une sensibilité et une spécificité exceptionnelle, un objectif premier de nombreux groupes de recherche dans les dernières ...

Réactifs <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate monopotassique </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate disodique </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 anhydre </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99,5%) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hydroxyméthyl] aminométhane </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albumine sérique bovine) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> TWEEN 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-naphtyl phosphate de disodium </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Solution de lait écrémé blocage - de lait écrémé sec </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 conjugué avec KLH (Keyhole Limpet Keyhole), solution mère (1 mg / ml dans PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> Le conjugué HT-2-KLH a été obtenue par le CDI-méthode où la libre circulation des groupes OH en position 3 et 4 de la toxine HT-2 ont été activés par le N, N&#39;-carbonyldiimidazole (CDI) et l&#39;activation de toxine HT-2 a été laissez réagir avec groupes amino de la protéine (KLH) pour générer un lien carbammate stable. </td></tr><tr><td> Secondaire anticorps marqué: IgG anti-souris (H + L) de cheval, conjugué à la phosphatase alcaline, la concentration de 1 mg / ml. </td><td> Vector Laboratories </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> La toxine HT-2 </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Les billes magnétiques: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Concentration 2 x 10 9 billes / ml. </td></tr></table> Solutions <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Préparation </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS), pH 7,4 </td><td> Dissoudre 0,20 g de chlorure de potassium, 0,20 g de dihydrogénophosphate de potassium, 1,16 g de phosphate disodique et 8,00 g de chlorure de sodium dans 900 ml d&#39;eau </td><td></td></tr><tr><td> Tampon diéthanolamine, DEA, 0,97 m + 1 mM de MgCl2 + 0,15 M de KCl, pH 9,8 </td><td> Dissoudre 0.0476g de MgCl 2 anhydre et 7.3.59 g de KCl dans ~ 300 ml d&#39;eau. Après dissolution, ajouter 51 ml de DEA (99,5%). Ajuster le pH à 9,8 avec HCl (6 M). Diluer à 500 ml avec de l&#39;eau. </td><td></td></tr><tr><td> Tampon borate 0,1 M pH 9,5 </td><td> Dissoudre 3,09 g de H 3 BO 3 en ~ 300 ml d&#39;eau distillée, ajuster le pH à 9,5 avec NaOH et / ou HCl (6 M ou des concentrations plus faibles). Diluer à 500 ml d&#39;eau distillée. </td><td></td></tr><tr><td> Tampon TRIS, 0,2 M, pH 8,5 </td><td> Dissoudre 3,85 g de Tris [hydroxyméthyl] aminométhane dans 100 ml d&#39;eau. Ajuster le pH à 8,5 avec NaOH et / ou HCl (6 M ou des concentrations plus faibles). Diluer à 200 ml avec de l&#39;eau. </td><td></td></tr><tr><td> Tampon TRIS + BSA solution (0,1%), pH 8,4 </td><td> Dissoudre 0,050 g de BSA dans 50 ml de tampon TRIS pH 8,4. </td><td> Cette solution doit être fraîchement préparée le jour d&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> Tampon PBS + TWEEN ® 0,05% </td><td> Dissoudre 0,250 g de Tween 20 dans 500 ml de tampon PBS préparé préalablement, pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon PBS + BSA solution à 0,1% </td><td> Dissoudre 0,050 g de BSA dans 50 ml de tampon PBS, pH 7,3. </td><td> Cette solution doit être fraîchement préparée le jour d&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> Tampon PBS + BSA 0,1% + 0,02% NaN3 </td><td> Dissoudre 0,050 g de BSA et 0,010 de NaN 3 dans 50 ml de tampon PBS, pH 7,3. </td><td> Stockage Solution </td></tr><tr><td> Substrat enzymatique </td><td> Dissoudre 0,010 g de 1-naphtyl phosphate de sel de sodium dans 100 ml de tampon DEA pH 9,8. Envelopper le ballon d&#39;serré dans du papier aluminium. </td><td> Cette solution doit être fraîchement préparée le jour d&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> Solution de lait écrémé bloquant </td><td> Ajouter 0,20 g de Blotting grade bloqueur non-lait écrémé en poudre (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) pour 200 ml de tampon PBS pH 7,3. </td><td> Cette solution doit être fraîchement préparée le jour d&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> Solution stock HT-2 </td><td> Dissoudre 10 mg de trichothécènes HT-2 flacon de toxine, dans 10 ml d&#39;acétonitrile pour donner une solution avec une concentration de 1 mg / ml. </td><td> Répartis cette solution dans des aliquotes à usage unique de 30 ml et de les stocker à moins de -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2 Solution étalon de travail </td><td> Pipeter 20 ml de HT-2 solution stock de toxine dans un 2 ml calibré fiole jaugée et diluer avec de l&#39;acétonitrile pour obtenir une solution HT-2 de travail contenant 10 ug / ml de toxine trichothécènes. </td><td> Cette solution doit être fraîchement préparée le jour d&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> HT-2 solutions calibrant travail </td><td> Diluer le HT-2 solution étalon de travail (10 pg / ml) pour préparer la solution de travail calibrant 100 ng / ml. Diluer HT-2 travaille solution d&#39;étalonnage à 100 ng / ml pour préparer des solutions de travail calibrant des concentrations suivantes 0 (blanc), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> Ces solutions doivent être fraîchement préparés le jour d&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> HT-2 conjugué avec KLH </td><td> Répartis HT-2 conjugué avec une solution stock de KLH (Keyhole Limpet Keyhole) (1 mg / ml dans PBS) en usage unique des aliquotes de 350 pi. </td><td> Aliquotes magasin à -30 ° C. </td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal spécifique </td><td> Diluer 1:350 (v: v) la concentration des stocks (1,383 mg / ml) d&#39;anticorps monoclonaux dans le PBS à utiliser dans l&#39;étape la compétition </td><td> Cette solution doit être fraîchement préparés au moment de l&#39;utiliser. 10 ml de solution mère d&#39;anticorps dans PBS pour un volume final de 3,5 ml, sont suffisantes pour analyser les 17 normes et / ou des échantillons. </td></tr><tr><td> Secondaire anticorps marqué </td><td> IgG anti-souris (H + L), conjugué à la phosphatase alcaline est dilué 1:100 (v: v) dans du PBS à utiliser dans l&#39;étape concurrence. </td><td> Solution 100 ul d&#39;actions d&#39;anticorps dans PBS pour un volume final de 10 ml, sont suffisantes pour analyser les 25 normes et / ou des échantillons. Cette solution doit être fraîchement préparés au moment de l&#39;utiliser. </td></tr></table> Un appareil <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Concentrateur de particules magnétiques: MPC-S ® </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> Instrument PalmSens </td><td> PalmSens </td><td> Fourni avec PalmSens Lite, Serial PC portable câble de connexion et le logiciel Mux options </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens Multiplexeur </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Huit canaux de contact Mux électriques </td><td> fabriqués à la main </td><td></td></tr><tr><td> Bande avec huit électrodes sérigraphiées (EVS) </td><td> fabriqués à la main </td><td></td></tr><tr><td> Spécialement conçu pour soutenir la bande électrodes </td><td> fabriqués à la main </td><td> Comprend 8 aimants néodyme dont chacune est placée en dessous de chaque surface de l&#39;électrode de travail de la SPE </td></tr><tr><td> Pipettes calibrées microlitre </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Agitateur magnétique et barreaux d&#39;agitation. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Béchers en verre (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fioles jaugées (2ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 et 2ml tubes Eppendorf. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Tubes Falcon ™ de 5ml et 15ml. </td><td> Falcon </td><td></td></tr><tr><td> Laboratoire Vortex </td><td></td><td> Ne pas utiliser vortex pour resuspendre billes magnétiques recouvertes d&#39;HT2-KLH ou liés à la chaîne immunologiques afin d&#39;éviter la dénaturation des pièces protéiques </td></tr><tr><td> Four de laboratoire ou la salle thermostaté </td><td></td><td> Choisissez un four capable de garder une température de 37 ± 3 ° C. </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Les immunoessais sont une alternative valable à la plus coûteuse en temps et consommer HPLC quantitative ou GC 1, 2 méthodes de dépistage pour la détection de mycotoxines dans les denrées alimentaires dangereuses. Dans ce protocole, nous montrons comment fabriquer et d&#39;interroger une enzyme électrochimique de dosage immuno-concurrentiel lié basé sur l&#39;utilisation de billes magnétiques comme support solide pour la chaîne immunochimiques 3 et électrodes sérigraphiées que la détection de la plate-forme. Notre méthode vise à déterminer la quantité totale de HT-2 et T-2 toxines, les mycotoxines appartenant à la famille des trichothécènes et de grande préoccupation pour la santé humaine 4. L&#39;utilisation d&#39;un clone d&#39;anticorps avec une réactivité croisée de 100% vers la HT-2 et T-2 permet de détecter simultanément deux toxines avec une sensibilité similaire 5. La première étape de notre analyse est l&#39;étape de revêtement où nous immobilisent toxine conjugué HT2-KLH sur la surface de billes magnétiques. Après une étape de blocage, nécessaire pour éviter les absorptions non spécifiques, l&#39;ajout d&#39;un anticorps monoclonal permet la concurrence entre immobilisé HT-2 et HT-2 gratuitement ou T-2 présents dans l&#39;échantillon ou dissous dans une solution standard. A la fin de l&#39;étape la concurrence, la quantité d&#39;anticorps monoclonaux liés à l&#39;immobilisation HT-2 sera inversement proportionnelle à la quantité de toxine dans la solution échantillon. Un anticorps secondaire marqué à la phosphatase alcaline (AP) est utilisée pour révéler la liaison entre l&#39;anticorps spécifique et l&#39;immobilise HT-2. L&#39;étape finale est effectuée la mesure par la chute d&#39;une partie aliquote de la suspension de billes magnétiques, correspondant à un échantillon / solution de norme spécifique, sur la surface d&#39;un écran-imprimés électrode de travail; billes magnétiques sont immobilisés et concentré au moyen d&#39;un aimant placé exactement sous le sérigraphié électrode. Après deux minutes d&#39;incubation entre les billes magnétiques et un substrat pour l&#39;AP, le produit enzymatique est détecté par Differential Pulse Voltamétrie (DPV) en utilisant un instrument portatif (PalmSens) également en mesure de lancer automatiquement les huit mesures dans un intervalle de quelques secondes.

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ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Un protocole pour détecter les trichothécènes (mycotoxines de préoccupation pour la santé humaine) en utilisant une méthode de dépistage nouvellement développé basé sur une méthode immunochimique compétitifs et une détection électrochimique dernière est démontrée.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic électrochimique) Méthode de détection des mycotoxines

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

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ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

14.1K vues.  University of Rome, Tor Vergata. Un protocole pour détecter les trichothécènes (mycotoxines de préoccupation pour la santé humaine) en utilisant une méthode de dépistage nouvellement développé basé sur une méthode immunochimique compétitifs et une détection électrochimique dernière est démontrée.

Vidéo: ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

La détection des protéines ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

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Biologie

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d&#39;affinité immuno-magnétiques

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-chase Analyse des chaînes de sucre N-glycoprotéines liées à des cellules de mammifères

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Homogène de détection rapide des essais biologiques utilisant un support magnétique Système de modulation Biosensing

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Détection directe de l&#39;activité Acétate de formation de l&#39;acétate kinase Enzyme

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Essais biologiques électroantennographique comme outil de dépistage pour les substances volatiles de la plante hôte

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR est une méthode sensible et rapide pour la détection de l&#39;ADN cytomégalovirus dans la formaline fixe, inclus dans la paraffine des tissus de biopsie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multi-enzyme préalable au moyen d&#39;un système de criblage enzymatique génétique à haut débit

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Isolation des noyaux par tissu entier à l’aide d’une méthode sans détergent et sans enzymes

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.