Nous tenons à remercier les Drs. James Bowie et Salem Faham pour fournir une expertise technique et des conseils sur la méthode et le Dr bicelle Aviv Paz pour des discussions utiles. Nous reconnaissons l&#39;appui Le Du expérimental. Rachna Ujwal a des intérêts financiers dans MemX Biosciences LLC, qui, cependant, ne prend pas en charge ce travail. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du NIH (RO1 GM078844).

Bicelle cristallisation base se compose de quatre étapes de base (figure 2): i) préparation d&#39;un bicelle lipidique formant: mélange amphiphile; ii) l&#39;incorporation de la protéine purifiée dans le milieu bicelle; iii) des essais de cristallisation (manuellement ou de manière robotisée), et iv) visualisation, l&#39;extraction et le gel de cristal. Ces étapes sont décrites en détail ci-dessous 1. Préparation de bicelles Bicelles peuvent se former dans une variété de lipides: les combinaisons amphiphile et sur une large gamme de concentrations. Par conséquent, une composition à base initiale sur les conditions de succès antérieurs, il est recommandé (tableau 1). Le mélange le plus de succès est le DMPC: CHAPSO bicelle formulation, qui peut être soit achetés dans le commerce comme une pré-mélangé prêt à utiliser la formulation (voir tableau des réactifs ci-dessous) ou préparés en laboratoire tel que décrit. Pour cet exercice, nous allons préparer 1 ml de DMPC 35%: mélange CHAPSO à un ratio 2,8:1 molaire. <ol><li&gt; Peser 0,26 g DMPC (M. 677,9 g / mol), 0,09 g CHAPSO (M. 630,9 g / mol) et ajouter de l&#39;eau déminéralisée pour un volume final de 1,0 ml. <ul type="disc"><li> Le pourcentage bicelle peut varier entre 10% -40% avec un DMPC: CHAPSO rapport molaire allant de 2.6-3.0:1 (tableau 1). </li><li> Remarque: Plus la concentration de la bicelle plus il est difficile de dissoudre les lipides entraîne une viscosité supérieure solution. Cependant, une formulation concentrée bicelle peut être avantageux lorsque la concentration en protéines est faible. </li></ul></li><li> Dissolution des lipides pour obtenir une solution homogène nécessite un effort considérable, faisant de cette étape, la plupart du temps dans la méthode bicelle. Faites défiler les étapes suivantes jusqu&#39;à la DMPC est complètement mélangé: <ol><li> Chauffer le mélange à ~ 40 ° C en utilisant un bain d&#39;eau ou d&#39;un incubateur et vortex pour ~ 1 minute. <ul type="disc"><li> Remarque: Comme plusieurs cycles sont effectués, le réchauffement le mélange se traduira par un con gel-likecohérence rend difficile de vortex. </li></ul></li><li> Refroidir le mélange sur la glace et le vortex pendant quelques minutes. Refroidissement aide liquéfier la solution facilitant le vortex. <ul type="disc"><li> Remarque: Comme plusieurs cycles sont effectués, le mélange peut devenir trouble au refroidissement. </li></ul></li><li> Répétez les étapes énumérées ci-dessus (1.2.1 et 1.2.2) jusqu&#39;à ce que le lipide est complètement dissoute. <ul type="disc"><li> Remarque: Ce processus peut prendre plusieurs heures. La formation Bicelle est indiqué par les changements de comportement de phase des DMPC: formulation CHAPSO. Une fois terminée, le mélange sera un gel transparent ou au-dessus la température ambiante et un liquide visqueux sur la glace. </li></ul></li></ol></li><li> Le mélange est bicelle maintenant prêt à utiliser et peut être conservé à -20 ° C pour stockage à long terme (jusqu&#39;à 5 ans). En raison du risque d&#39;hydrolyse du groupe de tête des phospholipides, il n&#39;est pas conseillé de stocker bicelles à température ambiante pendant de longues périodes. </li></ol> 2. Incorporation de protéines dans bicelles La plupart des structures MP ont été obtenus à partir de bicelles cristallisé dans DMPC: CHAPSO bicelle concentration allant de 2 à 8% en utilisant une concentration en protéines de 8 à 12 mg / ml (tableau 1). Si possible, les écrans initiaux devraient utiliser ces lignes directrices et des concentrations supplémentaires peuvent être criblés à l&#39;étape de l&#39;optimisation. Comparée à la méthode LCP, l&#39;incorporation de protéines avec bicelles est un processus simple (figure 3), qui devrait être fait le même jour que des essais de cristallisation. <ol><li> Décongeler le DMPC: CHAPSO bicelle mélange à température ambiante jusqu&#39;à ce que le changement de phase pour un gel transparent. <ul type="disc"><li> Remarque: Plusieurs gel-dégel ne sera pas affecter le comportement bicelle. </li></ul></li><li> Placer le mélange sur la glace pour liquéfier et brièvement au vortex pour rétablir une phase homogène bicelle. Lorsqu&#39;il est placé sur la glace, le mélange peut devenir trouble. </li><li> From sur ce point, garder le mélange et la protéine purifiée bicelle sur la glace. Cela permet de garder l&#39;bicelle dans une phase liquide qui rend prêtent à de pipetage. </li><li> Ajouter le mélange à l&#39;bicelle purifiée détergent solubilise la protéine dans un 1:4 (V / V) ratio. <ul type="disc"><li> Par exemple: 100 ul de protéines bicelle mélange est obtenu en mélangeant 80 ul de protéines avec 20 bicelle ul. Si la concentration en protéines est de 15 mg / ml et la concentration bicelle est de 35%, cela donne un mélange de protéines bicelle-incorporé avec une concentration en protéines de 12 mg / ml et une concentration bicelle de 7%. </li></ul></li><li> Mélanger doucement le contenu de pipetage de haut en bas jusqu&#39;à ce que la solution devienne claire et homogène. <ul type="disc"><li> Remarque: Si des bulles apparaissent, un tour rapide (30-60 secondes, 13000 rpm, 4 ° C) avec une centrifugeuse de table peut aider à les supprimer. </li></ul></li><li> Incuber le mélange sur la glace pendant au moins 30 min pour favoriser l&#39;intégration complète de la protéine into bicelles. Le mélange de protéines bicelle est maintenant prêt pour des essais de cristallisation. </li></ol> 3. Mise en place d&#39;essais de cristallisation Autres techniques de cristallisation des lipides tels que le LCP nécessitent un équipement spécialisé à cause de forte viscosité du médium, mais le comportement de phase unique de mise en œuvre dans bicelles permet pratiquement n&#39;importe quel format standard, y compris la cristallisation de la robotique (figure 3). Essais de cristallisation peut être effectuée soit en suspension ou assis formats de dépôt en utilisant la norme des écrans disponibles dans le commerce. <ol><li> Que la mise en place des plateaux manuellement ou en utilisant un robot de cristallisation, de maintenir le mélange de protéines bicelle sur la glace. Cela permet de garder le froid mélange de protéines-bicelle et s&#39;assurer que la viscosité de la solution est minime. </li><li> Essais de cristallisation Manuel - Utiliser une pipette standard, le mélange de protéines bicelle peut être mélangée avec une solution de réservoir de la même manière que normalement effectuerED pour des protéines membranaires solubles ou détergent solubilisé. <ul type="disc"><li> Remarque: Conservez le mélange de protéines bicelle sur la glace pendant les essais. </li></ul></li><li> Essais de cristallisation robotisée - Nous avons adapté ces épreuves pour le robot de cristallisation Mosquito, mais en principe (suivant les mêmes précautions) la technique devrait être compatible avec tous les robots de cristallisation. Les conseils suivants vous assurer que le mélange de protéines bicelle reste frais et avec précision la pipette par le robot: <ol><li> Prérefroidir la plaque de maintien du mélange de protéines-bicelle en le plaçant sur la glace. </li><li> Pipeter le mélange de protéines bicelle dans la plaque et de continuer à maintenir la plaque sur la glace. Cette plaque doit être le dernier élément d&#39;aller sur le robot avant de commencer la course. </li><li> Mise en place du bac réservoir et les couvercles de cristallisation sur la plate-forme 3 et 5, respectivement, du robot moustique. </li><li> Placer la plaque contenant des protéines bicelle mélange sur la plate-forme 4du robot moustique. Ceci assure le mélange de protéines bicelle est le dernier à être capté par le robot et il est immédiatement libéré. </li><li> Afin d&#39;éviter le chauffage et augmentation de la viscosité, ne pas mélanger le réservoir avec le mélange de protéines bicelle. </li><li> Lorsque vous effectuez plusieurs écrans, retourner immédiatement la plaque bicelle en protéines à la glace pour le refroidissement dès que une course est terminée. </li></ol></li><li> Volume de goutte et le ratio (protéine: réservoir) peut être choisi que pour des essais de cristallisation conventionnels. Par exemple, les essais initiaux de cristal à l&#39;aide du robot moustique peut être configuré à l&#39;aide de protéines 0,25 ul: mélange bicelle plus 0,25 réservoir ul. </li><li> Incuber les essais de cristal dans une chambre à 20 ° C. La température est une sélection de bonnes et de paramètre d&#39;optimisation car le comportement de phase des bicelles dépend de la température. <ul type="disc"><li> Des températures plus élevées induisent la phase lamellaire 12 (figure 1), qui a l&#39;avantage de pré-organisationla protéine dans des couches. Les températures inférieures à 20 ° C peuvent être criblés, mais vous ne devriez pas descendre en dessous de 4 ° C, car cela pourrait provoquer des lipides pour précipiter sur de longues périodes de temps. </li></ul></li><li> De la même manière que des essais de cristallisation traditionnelle, les essais doivent être surveillés bicelle sur une base régulière pour l&#39;apparence de cristaux et de croissance. Nous vous recommandons de vérifier sur les plateaux de la 1 ère et 3 ème jour post-installation suivie d&#39;une inspection hebdomadaire. </li><li> Optimisation de cristal peut être effectuée en utilisant des méthodes couramment utilisées pour les cristaux de détergent à base de grille dont le dépistage, le dépistage d&#39;additifs, en changeant etc températures plus, le pourcentage bicelle et de protéines: rapport bicelle peuvent être variées. Par ailleurs, bicelles peuvent être dopés avec des lipides spécifiques qui peuvent être nécessaires pour la stabilité des protéines ou de fonction. </li></ol> 4. Visualisation, cristal d&#39;extraction et de congélation Depuis les procès de cristal avec le mélange de protéines bicelle<html> avoir une viscosité similaire à la protéine-détergent gouttes, la visualisation et l&#39;extraction de cristal est de routine et est effectuée comme traditionnelle set-ups. <ol><li> Visualisation: Contrairement aux médias LCP qui nécessite souvent un éclairage de haute qualité sous une lumière normale et polarisée pour la détection des cristaux, la visualisation n&#39;est pas entravée par bicelles. Coloré et aussi incolore, gouttes de cristal de protéines peuvent être facilement analysés à l&#39;aide de microscopes standard et aucun équipement spécial n&#39;est requis. </li><li> Bicelles, comme d&#39;autres supports lipidiques, ont tendance à produire un pourcentage élevé de faux positifs. Un microscope UV contribue grandement à différencier des protéines à partir de cristaux de sel (figure 4). </li><li> Extraction et de congélation: extraction de cristal et le gel est relativement simple et ne nécessite pas la dissolution des médias bicelle environnantes. En outre, la phase de bicelle se donne quelques modérée cryo-protection. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <html> nt &quot;&gt; Il prend généralement 2-3 jours pour les cristaux à comparaître et à environ une semaine ou plus pour eux de grandir à leur taille maximale. Ce fut le cas pour la bactériorhodopsine et le canal de souris anions voltage-dépendants 1 (mVDAC1) 4,8 cristaux . Pour d&#39;autres protéines membranaires cela peut prendre plusieurs semaines pour la croissance cristalline, il est donc important de continuer à suivre les essais de cristal bien au-delà des premières semaines. Comme avec les autres médias lipidique, bicelles tendent à former des formes qui peuvent paraître cristalline. Il a également été observé qu&#39;ils conduisent à un pourcentage plus élevé de sel et de cristaux de lessive. Un microscope à UV qui détecte la fluorescence du tryptophane peut considérablement aider à éliminer ces non-protéiques de faux positifs. La figure 4 montre des formes de lipides, de sel et de cristaux de protéines que considérée à la lumière visible et UV pour aider à distinguer les différents résultats qui peuvent être observés. 83fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Bicelle schématique. Bicelles sont composés d&#39;une molécule lipidique bicouche formant comme DMPC (bleu) et un amphiphile tels que CHAPSO (vert), qui protège les bords hydrophobe de la bicouche. Comme la température est augmentée, en forme de disque bicelles subir une transformation de phase dans une feuille 12 lamellaire perforé. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig2.jpg" /> Figure 2. Organigramme pour le procédé de cristallisation bicelle décrivant les quatre étapes de base. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig3.jpg" /> Figure 3. Essais cristal configuration schématique. Protéines membranaires purifiées détergent solubilisé peut être directement mélangé avec bicelles sur la glace par un simple pipetage du contenu ensemble. Après incubation du mélange de protéines / bicelle sur la glace pour les essais de cristallisation ~ 30 minutes,peuvent être mis en place en utilisant n&#39;importe quel format standard dont la robotique. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig4.jpg" /> Figure 4. Visualisation des essais de cristal. Image visible (en haut) et de l&#39;image UV (panneau inférieur) de (A) cristaux aciculaires observés dans un état ​​de sel seulement. Pas de fluorescence peut être détectée à partir des cristaux, une indication de faux positif. (B) en forme de bâtonnet cristal formé dans un état ​​de MPD. Le cristal fluorescence faiblement mais a été jugée non protéinique utilisant diffraction des rayons X. (C) Crystal observer environ quatre semaines après la mise en place des essais. La forte fluorescence sous lumière UV confirme qu&#39;il est un cristal de protéine. <table border="1"><tbody><tr><td> No. </td><td> Protéines </td><td> Source </td><td> Formulation Bicelle </td><td> Protéines Concentratisur </td><td> Détergent 1 </td><td> Résolution (A) </td><td> Référence </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Bactériorhodopsine 2 </td><td> Halobacterium salinarum </td><td> 8% DMPC: CHAPSO (2,8:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 2.0 </td><td> Faham et Bowie, 2002 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 8% DTPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 1.8 </td><td> Faham et al., 2005 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> β2-adrénergiques / complexe Fab </td><td> Homo sapiens </td><td> 8,3% DMPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 10 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 3.4/3.7 </td><td> Rasmussen et al., 2007 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Canal anionique voltage-dépendants 1 </td><td> Mus musculus </em&gt; </td><td> 7% DMPC: CHAPSO (2,8:1) </td><td> 12 mg / ml </td><td> LDAO </td><td> 2.3 </td><td> Ujwal et al., 2008 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Xanthorhodopsin </td><td> Salinibacter ruber </td><td> 4,2% DMPC, NM 5% </td><td> 4 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 1.9 </td><td> Luecke et al., 2009 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Protéase Rhomboid </td><td> Escherichia coli </td><td> 2% DMPC: CHAPSO (2,6:1) </td><td> 9 mg / ml </td><td> Glucoside Nonyl </td><td> 1.7 </td><td> Vinothkumar, 2011 </td></tr></tbody></table> 1 détergent utilisé pour la purification des protéines membranaires 2 lipides des membranes pourpres autochtones peuvent être emportés lors de la purification Tableau 1. Résumé des conditions de cristallisation pour les structures de protéines membranaires résolu en utilisant bicelles.

<ol>
	<li>Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phases:+A+novel+concept+for+the+crystallization+of+membrane+proteins.">Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).</li><li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+Monoacylglycerols:+The+Workhorse+Lipids+for+Crystallizing+Membrane+Proteins+in+Mesophases.">Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases.</a> Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).</li><li>Nollert, P., Landau, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+release+of+crystals+from+lipidic+cubic+phases.">Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases.</a> Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).</li><li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles.">Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).</li><li>Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+bacteriorhodopsin+from+bicelle+formulations+at+room+temperature.">Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature.</a> Protein Science. 14, 836-840 (2005).</li><li>Luecke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+structure+of+xanthorhodopsin,+the+light-driven+proton+pump+with+a+dual+chromophore.">Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).</li><li>Ujwal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+&#197;+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating.">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 &#197; resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).</li><li>Vinothkumar, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+rhomboid+protease+in+a+lipid+environment.">Structure of rhomboid protease in a lipid environment.</a> J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).</li><li>Rasmussen, S. G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+[bgr]2+adrenergic+G-protein-coupled+receptor.">Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 450, 383-387 (2007).</li><li>Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+aligned+phospholipid+bilayers+with+positive+ordering:+a+new+model+membrane+system.">Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system.</a> Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Bicelles sont un support unique lipidique qui offrent un natif bicouche-comme l&#39;environnement tout en se comportant comme si solubilisées par des détergents. Cette propriété donne bicelles un net avantage sur les autres méthodes de cristallisation à base de lipides car il n&#39;y a pas de courbe d&#39;apprentissage ou de l&#39;équipement spécialisé requis pour cette technique. Une fois bicelles sont disponibles, que ce soit commercial ou préparé dans le laboratoire, ils peuvent être directement mélangé...

high-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method

Les protéines membranaires (les députés) jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques tels que le pompage des molécules spécifiques à travers la bicouche membranaire contraire imperméable qui entoure toutes les cellules et les organelles. Altérations de la fonction du résultat de députés dans plusieurs maladies et affections humaines, ainsi, une compréhension complexe de leurs structures demeure un objectif essentiel pour la recherche biologique. Cependant, la détermination des structures de députés demeure un défi important souvent issus de leur hydrophobicité. Les députés ont d&#39;importantes régions hydrophobes incorporé dans la bicouche. Les détergents sont fréquemment utilisés pour solubiliser ces protéines de la bicouche générant une micelle protéines de détergent qui peuvent ensuite être manipulés d&#39;une manière semblable que les protéines solubles. Traditionnellement, les essais de cristallisation se faire en utilisant un mélange de protéines de détergent, mais ils résistent souvent à produire des cristaux de cristallisation ou de mauvaise qualité. Ces problèmes surviennent en raison de lal&#39;incapacité du détergent pour bien imiter la bicouche résultant en une mauvaise stabilité et de l&#39;hétérogénéité. En outre, les boucliers de détergent à la surface hydrophobe de la MP en réduisant la surface disponible pour les contacts de cristal. Pour contourner ces inconvénients députés peut être cristallisé dans les médias lipidique, qui reproduit plus fidèlement leur environnement endogène, et est récemment devenu une technique de novo pour la cristallisation MP. Lipidique phase cubique (LCP) est une bicouche lipidique en trois dimensions pénétré par un système interconnecté de canaux aqueuse à 1. Bien monooléine est le lipide de choix, les lipides connexes tels que monopalmitolein et monovaccenin ont également été utilisés pour faire LCP 2. Les députés sont incorporés dans le LCP où ils diffusent en trois dimensions et des noyaux de cristal nourrir. Un grand avantage de la LCP est que la protéine reste dans un environnement plus natif, mais la méthode a un certain nombre d&#39;inconvénients techniques, y compris visc hauteosity (nécessitant des appareils spécialisés) et des difficultés dans la visualisation et la manipulation de cristal 3,4. En raison de ces difficultés techniques, nous avons utilisé un autre support lipidique pour la cristallisation-bicelles 5,6 (figure 1). Bicelles sont des mélanges de lipides / amphiphile formé par le mélange d&#39;un lipide phosphatidylcholine (DMPC) avec un amphiphile (CHAPSO) ou un lipide à chaîne courte (DHPC). Dans chaque disque bicelle, les molécules lipidiques génèrent une bicouche tandis que la ligne amphiphile des molécules apolaires fournissant les bords des propriétés bénéfiques des deux bicouches et des détergents. Surtout, en dessous de leur température de transition, la protéine-bicelle mélanges ont une viscosité réduite et sont manipulés d&#39;une manière semblable comme détergent solubilisées députés, rendant bicelles compatible avec les robots de cristallisation. Bicelles ont été utilisées avec succès à cristalliser plusieurs protéines membranaires 5,7-11 (tableau 1). Cette collection croissantedes protéines démontre la polyvalence de bicelles de cristalliser deux hélice alpha et feuillet bêta députés à partir de sources procaryotes et eucaryotes. En raison de ces succès et la simplicité de mise en œuvre à haut débit, bicelles devrait faire partie de l&#39;arsenal tous les cristallographe protéines de la membrane. Dans cette vidéo, nous décrivons la méthodologie bicelle et de fournir un protocole étape par étape pour la mise en place des essais de cristallisation à haut débit des députés purifiée en utilisant la robotique standard.

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High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Bicelles sont des mélanges de lipides / amphiphile qui maintiennent les protéines membranaires (les députés) au sein d&#39;une bicouche lipidique, mais ont un comportement de phase unique qui facilite criblage à haut débit par les robots de cristallisation. Cette technique a réussi à produire un certain nombre de structures à haute résolution provenant des deux sources procaryotes et eucaryotes. Cette vidéo décrit les protocoles pour générer le mélange lipidique bicelle, en incorporant les députés dans le mélange bicelle, la mise en place des essais cristallisations (manuellement ainsi que robot) et des cristaux de la récolte à partir du milieu.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.6K vues.  University of California Los Angeles. Bicelles sont des mélanges de lipides / amphiphile qui maintiennent les protéines membranaires (les députés) au sein d'une bicouche lipidique, mais ont un comportement de phase unique qui facilite criblage à haut débit par les robots de cristallisation. Cette technique a réussi à produire un certain nombre de structures à haute résolution provenant des deux sources procaryotes et eucaryotes. Cette vidéo décrit les protocoles pour générer le mélange lipi...

Vidéo: High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Recherche

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

L&#39;évaluation des essais de cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires petites pour les études en biologie structurale par cristallographie électronique

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de protéines membranaires cultivées dans des mésophases lipidiques pour la détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

ARN prédiction de la structure secondaire via SHAPE à haut débit

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Détection de cibles miARN dans à haut débit utilisant le test de 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...