Nous remercions Mike W. Davidson (Florida State University) pour fournir l&#39;ADN plasmidique codant pour des protéines fluorescentes. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde GM72048 (au DWP).

1. Préparation des échantillons fluorescents gouttelettes de protéines Un échantillon de protéine fluorescente se compose de gouttelettes d&#39;une émulsion 1-octanol/eau avec la protéine fluorescente résidant dans la phase aqueuse. Cette émulsion est pris en sandwich entre une lame de microscope et d&#39;un verre carré de 22 mm de couverture pour les applications de microscopie. <ol><li> Avant de prendre des échantillons de gouttelettes de protéines fluorescentes les lames de microscope et des lunettes de couvrir les besoin d&#39;être nettoyé et recouvert d&#39;un agent hydrophobe. </li><li> Nettoyer la verrerie en lavant 5 minutes avec de l&#39;acétone et laisser sécher à l&#39;air. (En option, après le nettoyage de la verrerie peut être traitée pendant 30 secondes dans un nettoyeur de plasma pour obtenir des résultats optimaux revêtement). </li><li> Préparer une solution à 2% dans l&#39;acétone et méthyltriméthoxysilane manteau de la verrerie au cours d&#39;une incubation de 2 minutes dans cette solution. Après revêtement enlever les verres de la solution et laisser sécher à l&#39;air. Ensuite, rincez avec de l&#39;éthanol à 70% à partir d&#39;un flacon pulvérisateur et laisser sécher de nouveau. (En option, à ce stade de la verrerie peut être cuit pendant 1 heure à 80 ° C à covalente lien le revêtement de la verrerie). Verrerie couché peut être stocké pendant au moins un mois. </li><li> Les protéines fluorescentes sont purifiés comme ses protéines 6-balisé à partir de E. Coli 1. Mesurer le spectre d&#39;absorbance de la protéine purifiée et préparer une dilution d&#39;actions avec une densité optique d&#39;environ 0,1 à STE tampon (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 1 mM), contenant 0,1% d&#39;albumine sérique bovine (BSA) . En plus de préparer 10 ml d&#39;un mélange 1:1 de tampon 1-octanol et STE dans un tube de 15 ml conique et mélanger vigoureusement. Après un congé de mélanger jusqu&#39;à ce que la séparation de phase est terminée. La phase supérieure est le 1-octanol. (Attention: Parce que le 1-octanol a une odeur forte, il est important d&#39;utiliser un conteneur à déchets fermé pour tout ce qui vient en contact avec le 1-octanol). </li><li> Pour rendre l&#39;émulsion pipette 45 ul du 1-octanol et 5 protéines fluorescentes ul dans un tube de centrifugeuse. Appuyez sur le tube une fois avec votre doigt pour commencer la formation de l&#39;émulsion, puis soniquer le tube pendant 30 secondes dans un bain de sonication. En attendant obtenir une lame de microscope couché et couvercle en verre prêt. Après sonication l&#39;émulsion doit être complètement couvert. Immédiatement après sonication pipette 4 émulsion ul à partir du milieu du tube sur une lame de microscope couché et couvrir avec un couvercle en verre enduit. </li><li> Si la procédure est effectué correctement, l&#39;émulsion doit répandre uniformément entre la lame de microscope et le verre objet. En quelques minutes, l&#39;échantillon doit être stable, composé de ~ 10 um d&#39;épaisseur gouttelettes fluorescentes à diamètres variables. La plus grande gouttelettes sont près du centre de l&#39;échantillon et le plus petit est situé plus loin vers les bords. </li></ol> 2. Mise en place d&#39;une expérience photoconversion La procédure suivante est une stratégie générale pour la mise en place d&#39;une expérience protéine fluorescente photoconversion. Cette procédure peut être appliquée pour des protéines purifiées ainsi que pour les cellules vivantes. <ol><li> Les paramètres suivants constituent un point de départ pour mettre en place votre expérience photoconversion: 40x objectif 1.3NA immersion dans l&#39;huile Taille de l&#39;image = 512 x 512 pixels Balayage zoom = 4 Pixel temporisation = 6 msec. Z-résolution (taille sténopé) = 3 um </li><li> Configurer deux canaux de détection de la fluorescence initiale et photoconverted, ainsi que d&#39;un &quot;canal photoconversion&quot;. Dans cet exemple nous allons utiliser purifiée mOrange2 protéine, qui est une orange à rouge protéines fluorescentes photoconvertible. Les espèces d&#39;orange est détecté à l&#39;aide d&#39;excitation 561 nm et la fluorescence est collectée entre 570 nm et 630 nm. Les espèces photoconverted rouge est détectée à l&#39;aide d&#39;excitation 633 nm et la fluorescence est collectée entre 640 nm et 700 nm. Pour le «canal photoconversion&quot; sélectionner 488 nm d&#39;excitation et de collecter la fluorescence entre 490 nm et 540 nm. (Remarque:. Imagerie du canal photoconversion n&#39;est pas strictement nécessaire) </li><li> Utilisez le canal pour l&#39;imagerie de la fluorescence initiale avec balayage continu d&#39;ajuster la puissance du laser et de gain du détecteur de qualité d&#39;image optimale. </li><li> Activez le canal photoconversion et sélectionnez un laser de puissance faible. Démarrer une série d&#39;imagerie laps de temps et d&#39;augmenter progressivement le laser photoconversion jusqu&#39;au significative de blanchiment de la fluorescence initiale est observée. Poursuivre l&#39;analyse jusqu&#39;à la fluorescence initiale est d&#39;environ 75% blanchi. </li><li> Désactiver le canal photoconversion et d&#39;activer le canal de détection de la fluorescence de photoconverted. Démarrer l&#39;imagerie avec un gain élevé et détecteur de laser de puissance faible et augmenter progressivement la puissance du laser jusqu&#39;à la fluorescence photoconverted est détecté. Une fois que vous détecter la fluorescence photoconverted vous pouvez ajuster la puissance du laser et de gain du détecteur de qualité d&#39;image optimale. </li><li> Enfin, la puissance du laser utilisépour photoconversion ainsi que la durée de photoconversion besoin d&#39;être optimisé. L&#39;augmentation de la puissance du laser sera photoconversion accélérer le rythme de photoconversion, la puissance du laser Cependant trop de photobleach la protéine. </li><li> Une fois la puissance optimale photoconversion laser et la durée ont été déterminés, ces paramètres peuvent être utilisés pour configurer un photoblanchiment standard ou module de FRAP et le «canal photoconversion&quot; n&#39;est plus nécessaire. </li></ol> 3. Double-sonde soulignant optique avec mOrange2 et Dronpa En raison de l&#39;décalée vers le rouge propriétés spectrales, mOrange2 peut être utilisé en combinaison avec la protéine verte Dronpa photoswitchable fluorescente à double sonde optique pour permettre soulignant soulignant sélective de 4 cellules individuelles (organite) des populations. <ol><li> Les cellules sont cultivées dans des plats en verre MatTek bas et transfectées 24 heures avant d&#39;imagerie utilisant la norme Lipofectamine2000 transfection 1. </li><li> Mettre en place le microscope pour mOrange2 photoconversion comme décrit dans la section 2. </li><li> Configurer le microscope pour photocommutation Dronpa. Dronpa fluorescence peut être imagée en utilisant le «canal photoconversion&quot; mOrange2 (voir étape 2.2). (Remarque: Réduire la puissance du laser utilisé pour l&#39;imagerie Dronpa, parce que la puissance du laser trop de provoquer l&#39;inactivation de Dronpa.) Ajouter un canal pour la photoactivation Dronpa. Nous utilisons 800 nm excitation à deux photons pour la photoactivation, mais alternativement cela peut être réalisé à l&#39;aide d&#39;excitation 405 nm. Déterminer la puissance du laser nécessaire pour l&#39;imagerie, photoactivation, et photoinactivation des Dronpa fluorescence. </li><li> Attention: photoconversion de mOrange2 et l&#39;inactivation de Dronpa deux survenir lors d&#39;excitation 488 nm. En raison de la puissance du laser élevées requises pour mOrange2 photoconversion ce sera aussi inactiver Dronpa fluorescence. D&#39;autre part, l&#39;inactivation Dronpa produit déjà à la puissance du laser beaucoup plus faible et peut être réalisée sans photoconversion mOrange2 significative. </li><li> Une fois les paramètres de photoconversion mOrange2 et photocommutation Dronpa sont fixés, en soulignant la sonde optique double est réalisé par les étapes suivantes. Tout d&#39;abord, inactiver Dronpa fluorescence dans l&#39;ensemble du champ de vue avec l&#39;excitation de puissance nm bas 488. Deuxièmement, sélectionnez une région d&#39;intérêt et mOrange2 photoconvert avec excitation de puissance nm haute 488. Enfin, sélectionnez une région d&#39;intérêt pour activer Dronpa fluorescence. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Préparation de l&#39;échantillon des gouttelettes. Un échantillon) gouttelettes correctement préparé. B) L&#39;échantillon préparé sans revêtement de la lame de microscope et couvercle en verre. C) échantillon préparé sans ajouter 0,1% de BSA. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Effet de la puissance du laser et la durée des photoconversion mOrange2 photoconversion. Gouttelettes contenant Simple mOrange2 protéines étaient continuellement photoconverted utilisant différentes quantités de puissance du laser 488 nm. Puissance du laser utilisé pour photoconversion relative était de 10% (solide), 25% (en pointillés), et 100% (en pointillés). A) les espèces orange fluorescent. B) Photoconverted rouge des espèces fluorescentes. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Double-sonde soulignant optique avec mOrange2 et Dronpa. Une cellule) exprimant mOrange2-histone H2B et Dronpa-Mito avant photoconversion, montrant la fluorescence orange dans le noyau et la fluorescence verte dans les mitochondries. B) Dronpa fluorescence était éteint avec l&#39;excitation de puissance nm bas 488, provoquant photoconversion minimale de mOrange2. C) a été mOrange2 photoconverted au rouge avec une excitation de puissance nm haute 488. D) Dronpa de fluorescence a été allumé à nouveau en utilisant 800 nm à 2 photons d&#39;excitation. Les panneaux sont des superpositions d&#39;images de fluorescence de la collaboration avec l&#39;image de contraste interférentiel différentiel.

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li></ol>

Le purifiée échantillon fluorescent gouttelettes de protéines est un exemple de format très pratique pour la caractérisation des protéines fluorescentes photophysiques, par exemple pour étudier la cinétique de photoblanchiment et cinétique photoconversion. Le volume de gouttelettes extrêmement petite (~ 20 picolitres) facilite photoblanchiment et des expériences photoconversion, qui peuvent être difficiles à réaliser dans les systèmes de base cuvette. En outre, comme indiqué ici de l&#39;échantillon des...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

Photoconvertible protéines fluorescentes (PC-PC) sont une classe de protéines fluorescentes &quot;surligneur optique&quot; capacité, ce qui signifie que la couleur de la fluorescence peut être changé par l&#39;exposition à la lumière d&#39;une longueur d&#39;onde spécifique. Soulignant optique non invasive permet le marquage d&#39;une sous-population de molécules fluorescentes, et est donc idéal pour le suivi des cellules individuelles ou les organites. Les paramètres critiques pour les photoconversion efficaces sont l&#39;intensité et la durée d&#39;exposition de la lumière photoconversion. Si l&#39;intensité est trop faible, photoconversion sera lente ou ne se produira pas du tout. D&#39;autre part, l&#39;intensité d&#39;exposition trop ou trop longtemps peut photobleach la protéine et ainsi réduire l&#39;efficacité de photoconversion. Ce protocole décrit une approche générale comment mettre en place un microscope confocal à balayage laser pour des applications photoconversion PC-PF. Premièrement, nous décrivons une procédure de préparation des échantillons purifiés de gouttelettes de protéines. Ce format de l&#39;échantillon est très pratique pour étudier le comportement photophysiques des protéines fluorescentes sous le microscope. Deuxièmement, nous allons utiliser l&#39;échantillon de gouttelettes de protéines de montrer comment configurer le microscope pour photoconversion. Et enfin, nous allons montrer comment réaliser soulignant optiques dans des cellules vivantes, y compris à double sonde optique avec soulignant mOrange2 et Dronpa.

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Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Ce protocole décrit une approche générale pour effectuer photoconversion de protéines fluorescentes sur un microscope confocal à balayage laser. Nous décrivons les procédures de photoconversion d&#39;échantillons de protéines puried, ainsi que pour les bi-sonde optique dans les cellules soulignant vivre avec mOrange2 et Dronpa.

Photoconversion de protéines purifiées fluorescentes et double-sonde optique dans Soulignant cellules vivantes

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

photoconversion-purified-fluorescent-proteins-dual-probe-optical

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K vues.  Vanderbilt University. Ce protocole décrit une approche générale pour effectuer photoconversion de protéines fluorescentes sur un microscope confocal à balayage laser. Nous décrivons les procédures de photoconversion d'échantillons de protéines puried, ainsi que pour les bi-sonde optique dans les cellules soulignant vivre avec mOrange2 et Dronpa.

Vidéo: Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Étiquetage des cellules souches avec des colorants fluorescents pour les non-invasive de détection avec l&#39;imagerie optique

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Recherche

Biologie

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Entretien et nettoyage du microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Marquage fluorescent du COS-7 exprimant des protéines de fusion SNAP-tag pour imagerie de cellules vivantes

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Translocation polarisée des protéines fluorescentes dans les Xenopus</emEctoderme> en réponse à la signalisation Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivez l&#39;imagerie des protéines GFP-étiquetés<em&gt; Drosophila</em&gt; Les ovocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caractérisation de calcification Events Utilisation en direct optiques et Electron Microscopy Techniques dans un tubeworm Marine

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...