Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros des NIH, l&#39;Institut national de recherche dentaire et craniofaciale.

Partie 1: Microscope et la préparation de l&#39;installation d&#39;imagerie <ol><li> Toute microscope confocal inversé doit être adaptée à l&#39;IVM. Dans cette étude, un microscope Olympus IX81 inversé, équipé d&#39;une unité Fluoview-1000 confocal à balayage laser a été utilisé. Pour atteindre la résolution la meilleure possible, l&#39;utilisation d&#39;objectifs à grande ouverture numérique, tel que l&#39;immersion dans l&#39;eau UPLSAPO 60x/1.20 NA, et l&#39;immersion dans l&#39;huile Plan-Apo 60x/1.42 NA est recommandée. objectifs à immersion dans l&#39;huile ont des efficacités de collecte et, bien qu&#39;ils nécessitent l&#39;utilisation d&#39;une lamelle couvre-objet entre le tissu et l&#39;objectif, elles offrent une meilleure qualité de formation d&#39;image lorsqu&#39;il est utilisé pour des zones d&#39;image à l&#39;intérieur de 15 à 20 um à partir de la surface. En outre, l&#39;utilisation d&#39;huile élimine le souci de l&#39;évaporation de l&#39;eau au cours de séances d&#39;imagerie plus longues. Afin de maintenir la température et l&#39;humidité, le microscope doit être entièrement fermé et alimenté en air chaud et humidifié. En variante, l&#39;animal, la platine du microscope, et l&#39;objectif doit être réchauffé par d&#39;autres moyens. Par exemple, les plaquettes de chaleur chimique peuvent être utilisées pour l&#39;animal et de la scène, et chauffe spécifiquement conçus objectives peuvent être utilisés pour l&#39;objectif (figure 1A). Le chauffage objectif doit être activée 30 min avant de commencer la procédure. Remarque: lorsque les plaquettes de chaleur sont utiliser pour garder l&#39;animal réchauffer une gaze doit placer entre le coussin et la peau. La peau doit être surveillée pour des brûlures. </li><li> Les étapes standard dans la plupart des microscopes confocaux disponibles dans le commerce ont une ouverture qui est utilisé pour insérer divers supports qui sont utilisés pour s&#39;adapter à des diapositives, des boîtes de Pétri, et des plaques de différentes tailles. Pour effectuer IVM, un insert de platine standard 35 mm boîtes de Pétri est inversé à l&#39;envers, recouvert d&#39;une lame de verre de 40 mm, qui est ensuite fixé par de la graisse à vide poussé de silicone ou du ruban adhésif (figure 1A). Un logement d&#39;insertion personnalisé peut également être fabriqué à partir de 3 mm de la plaque d&#39;aluminium épais. La surface du verre est alors cleaned avec 70% d&#39;éthanol et glissée avec un Kimwipe. </li><li> Fabrication d&#39;un support personnalisé pour l&#39;immobilisation SG (stabilisateur). Le but de la porte est de stabiliser les SG en place et de manière rigide les deux à l&#39;étage et la lamelle. Le support peut être fabriqué à partir d&#39;une boîte de Pétri de 60 mm de matière plastique. Tout d&#39;abord, le fond de la boîte est cassée à distance des parois et découpé en rectangles de 15 x 10 mm. Ensuite, les bords sont arrondis et polis à l&#39;aide de papier de verre fin. Quatre entretoises (1,5-2 mm) sont construits en enlevant les embouts en caoutchouc de 1 ml pistons de seringue. En utilisant du papier abrasif fin, la surface des entretoises et des quatre coins de la pièce de plastique sont polies. Les entretoises sont ensuite collés à l&#39;aide de colle gélatineuse, et plus tard lissées à l&#39;aide du papier de verre sur une surface plane. Notez que pour les animaux plus âgés, la taille des porteurs et les entretoises peuvent être augmentés pour accueillir un peu plus grandes glandes. </li><li> Préparation du gel de couplage optique. 0,3% Carbomère-940 (Le tableau 2) gel est préparé en chauffant 100 ml d&#39;eau ultra-pure et en dissolvant 5,47 g de D-sorbitol. Ensuite, on ajoute 0,3 g de Carbomère-940. Le bécher doit être couvert et placé sur une plaque chauffante agitation (plus bas du réglage de chaleur) pendant plusieurs heures ou jusqu&#39;à ce que tous les bouquets carbomer sont complètement dissous. Enfin, Trietanolamine est goutte à goutte, tout en agitant doucement ajouté, jusqu&#39;à un pH d&#39;environ 7,4 est atteint. Le gel est stocké à 4 ° C 13. </li></ol> Partie 2: Animaux et anesthésie <ol><li> Avant de procéder à des expériences sur des animaux, les protocoles devraient être approuvés par le comité de protection des animaux et de l&#39;éthique local. Surtout, les chercheurs doivent être correctement formés pour effectuer des interventions chirurgicales et devraient consulter leur comité de protection des animaux ou de l&#39;établissement vétérinaire avant de procéder à la procédure. </li><li> Dans cette étude, un modèle de souris (GFP / mTomato-souris) obtenue en croisant des souris FVB exprimant la GFP soluble (GFP-souris) wiDes souris C57B6 e exprimant un peptide membrane-cible fusionnée avec la protéine fluorescente en tandem de tomate (mTomato-souris) 6 a été utilisé. Remarque: il faut généralement prendre 20-30 minutes pour l&#39;animal de devenir pleinement anesthésié et préparé pour l&#39;imagerie </li><li> Les souris sont logées dans un environnement contrôlé à l&#39;animalerie et sont laissées s&#39;acclimater pendant une semaine avant l&#39;expérience. Cette étape est nécessaire pour l&#39;imagerie de la SGS depuis tous les résultats de détresse à une meilleure activité sécrétoire 12. L&#39;eau et la nourriture sont fournis ad libitum. Les mâles de 2 à 5 mois sont utilisés pour des expériences d&#39;imagerie (20-30 g). </li><li> Avant l&#39;anesthésie, peser les animaux pour déterminer la dose appropriée de l&#39;anesthésie. </li><li> Etant donné que la contrainte induite par l&#39;administration d&#39;anesthésiques injectables peut altérer l&#39;activité sécrétoire de la GV, induire pré-anesthésie par inhalation d&#39;isoflurane, suivie de l&#39;injection d&#39;anesthésiques. Pour cela, placer les souris très doucement dans la chambre de vaporisation, ettourner sur le débit d&#39;oxygène (800-900 mmHg). Réglez les niveaux isoflurane à 3% pour commencer l&#39;induction de pré-anesthésie. </li><li> Une fois que les animaux sont inconscients, injecter un mélange de 100 mg / kg de kétamine et 20 mg / kg de xylazine dans la cavité péritonéale (25 aiguille G). Anesthésiques sont préparés par dilution de 100 mg / ml de xylazine à 20 mg / ml dans une solution saline, puis mélanger avec la kétamine. Ce mélange est dilué à 1:1 avec du sérum physiologique et une quantité appropriée est injectée sur la base du poids de l&#39;animal. Cette dilution aide à prévenir une surdose accidentelle. A noter que le mélange perd de son efficacité au bout de 20 min. </li><li> Observer les animaux pour des signes d&#39;éveil et injecter plus de mélange anesthésique si elles sortent de l&#39;anesthésie (environ 75% de la dose initiale dans les 45 minutes après la première injection, et 50% toutes les heures par la suite). Contrôler la profondeur de l&#39;anesthésie toutes les 15 min en pinçant la patte et en observant la réponse. Remarque: Toujours administrer pommade ophtalmique à évitersécheresse oculaire. </li><li> Anesthésiques induisent hypothermie, ce qui peut affecter la reproductibilité des expériences et la santé de l&#39;animal. Par conséquent, les souris doivent être maintenus sous la lampe chauffante ou sur un bloc chauffé pendant toute la durée de l&#39;expérience. Remarque: la lampe de chaleur doit être d&#39;au moins 12-18 cm de l&#39;animal pour éviter de brûler </li><li> La température corporelle des animaux doit être contrôlée avec un thermomètre équipé d&#39;une sonde de température rectale. </li></ol> Partie 3: Chirurgie des animaux et de positionnement pour Microscopie intravitale <ol><li> Préparer l&#39;espace de travail avec tous les instruments chirurgicaux (tableau 1) qui doit être propre et stérile. </li><li> Rasez la zone du cou de la souris avec une tondeuse électrique. Essuyer la face ventrale de la région du cou de la souris anesthésiée avec une éponge de gaze trempée dans 70% d&#39;éthanol. Sécher l&#39;excédent avec un Kimwipe. </li><li> Avec des pincettes courbes ternes soulèvent un petit morceau de peau sur la ligne médiane (approximativementron à l&#39;extrémité inférieure des muscles masséters), et une petite incision (figure 1B). </li><li> Insérez les ciseaux dans l&#39;ouverture et séparer la peau loin du tissu sous-jacent en ouvrant les lames de ciseaux. Éviter d&#39;endommager le tissu glandulaire sous-jacent en pointant les ciseaux vers le côté inférieur de la peau. Répétez cette étape plusieurs fois jusqu&#39;à ce que la peau est séparée des tissus profonds (figure 1B). </li><li> Avec des ciseaux, découpez une bande de peau qui se détache d&#39;environ 3 mm de large et 10 mm de long. La peau doit être coupée de sorte que l&#39;ouverture commence près de la base des SG où le nerf, le conduit et les vaisseaux sanguins relient la glande au reste du corps. Après le nettoyage de la surface de la plaie, l&#39;ouverture résultante sera de forme ovale et mesure environ 8 x 12 mm. Les deux Commissions d&#39;études seront visibles après l&#39;ouverture (figure 1B). </li><li> Avec une seringue appliquer le gel de couplage optique dans le milieu de la découpe et de l&#39;essuyer versl&#39;extérieur avec de la gaze stérile. Nettoyer les morceaux de gaze doit être utilisé pour chaque lingette pour empêcher l&#39;introduction de cheveux ou de sang dans le tissu exposé. Répétez cette étape jusqu&#39;à ce que tout le sang et lâche poil est enlevé. </li><li> Utilisation # 7 pincettes, séparer le tissu conjonctif loin de glande sous-maxillaire droit tout le chemin à la base de la glande (variante de ce protocole peut être utilisé sur la SG de gauche). Tout d&#39;abord, trouver la pointe de la SG et de saisir le tissu conjonctif quelques millimètres au-dessus de la pointe de la glande. Déchirer le tissu conjonctif autour de la glande sans blesser le parenchyme. (Figure 1B). Une fois la glande est exposé, séparer délicatement le tissu conjonctif de la glande. En cas de saignement, laver le sang avec une solution saline. Assurez-vous que tous les tissus conjonctifs sont séparées et la glande est entièrement exposés. Gardez la glande humide en appliquant un gel de couplage optique régulièrement. </li><li> Avant de mettre l&#39;animal au microscope, placer un morceau épais de gaze et la HEAt emballer sur la platine du microscope afin de maintenir une température de 38 ± 2 ° C. La température du bloc à chaleur chimique peut être ajustée par la taille des coupes qui exposent la poche interne à l&#39;atmosphère. Gaze procure une certaine protection de l&#39;emballage de la scène métal de chaleur. Couvrez le dessus du paquet de la chaleur avec un mince morceau de gaze ainsi. </li><li> Placez l&#39;animal sur son côté (côté droit pour le droit glande) et sur la toile. Placer l&#39;animal avec la glande salivaire sous-maxillaire placé au milieu de la lamelle couvre-objet (Figure 1C). </li><li> L&#39;animal doit être fixé et stabilisé dans cette position avant de l&#39;immobiliser la glande. Placez un morceau de ruban adhésif de masquage sur la face ventrale de la patte avant droite de la souris. Accrocher les incisives de la souris par une suture de soie (figure 1C, encart). Créer une certaine tension entre le fil de soie et la patte et les fixer sur la scène par du ruban adhésif. Le SG doit reposer naturellement dans le milieu de l&#39;lamelle. La tête et le thorax doivent être en outre stabilisées par des cales en matière plastique qui peut être couplé à l&#39;étage. </li><li> Placer un petit morceau de tissu de nettoyage pour lentille sur la glande (figure 1C). Elargir la glande légèrement et placez un support personnalisé sur la glande. Associer étroitement le stabilisateur de la scène avec du ruban adhésif. Le couplage peut être amélioré par une pince métallique reliée à l&#39;étage (figure 1C). Tension et des angles aigus doivent être évités car ils peuvent compromettre la circulation sanguine. Immédiatement après la stabilisation inspecter le flux sanguin soit en examinant visuellement la glande (il convient de conserver une coloration rose) ou par épifluorescence. Chez la souris GFP / m-tomate, des altérations brut de l&#39;écoulement du sang peuvent être facilement évalués depuis à la fois les vaisseaux sanguins et plusieurs des cellules du sang sont marquées avec le m-tomate. </li><li> Couvrir l&#39;animal avec de la gaze et un coussin chauffant. Mesurer la température de la glande exposée à l&#39;aide d&#39;un thermomètre équipé wvec une petite sonde à thermocouple souple mis en contact avec un côté de la glande exposé. </li></ol> Partie 4: Paramètres d&#39;imagerie <ol><li> En utilisant un éclairage à épifluorescence focalisation sur la surface de la glande soit en utilisant la GFP ou de l&#39;ensemble de filtre de la DP. Trouver la surface de la SG, et évaluer le débit sanguin dans les capillaires et la morphologie globale du tissu. Les signes de lésions tissulaires comprennent bourgeonnement de la membrane ou de l&#39;apparition de grandes vacuoles. </li><li> Évaluer la stabilité du tissu soit par épifluorescence ou en pré-balayage de la zone sélectionnée. Une préparation stable est essentiel, puisque la plupart des artefacts de mouvement ne peut être enlevé ou corrigés pour l&#39;analyse des données de post-traitement. Si la préparation n&#39;est pas stable, des ajustements sont nécessaires. </li><li> Pour trouver l&#39;image focale bon plan les glandes en mode pré-balayage (1X zoom), et passer progressivement de l&#39;objectif vers la lamelle jusqu&#39;à ce que les structures acineuses, les granules de sécrétion et la pmembrane Lasma devenir visible (Figure 2). </li><li> Les paramètres d&#39;imagerie pour le time-lapse dépendent de l&#39;expérience individuelle. À l&#39;image de la dynamique des granules sécrétoires utilisent une vitesse de balayage de 0,5-2 sec / cadre, et 256 x 256 pixels avec un 0,2 um / pixel échelle spatiale (champ de vision d&#39;environ 50 um x 50 um). Afin de visualiser correctement les granules et la membrane plasmatique, l&#39;épaisseur optique doit être réglé entre 0,9 à 1,2 um. Pour exciter la GFP et le tandem de tomate, on peut utiliser une longueur d&#39;onde de 488 nm et 561 nm, respectivement. La puissance de crête est d&#39;environ 0,5 mW pour le 488 nm et 1 mW pour le 561 nm. Ceci assure un minimum de photoblanchiment. </li><li> Les réglages du détecteur doivent être ajustées pour maintenir le signal dans la gamme dynamique et dépend de la luminosité de l&#39;échantillon. </li><li> Une fois que tous les paramètres sont réglés, l&#39;imagerie peut être démarré. Tout d&#39;abord, prendre un instantané du champ de vue pour être utilisé comme un point de référence. Tandis quel&#39;imagerie in laps de temps, la dérive du tissu en XY et Z peut se produire. Ceci peut être compensé en ajustant manuellement la zone de balayage et la position de Z. Les réglages doivent être effectués progressivement et par petits incréments pour éviter les artefacts. En outre, l&#39;image de référence peut être utilisée pour déterminer si le photoblanchiment se produit. Si photoblanchiment significatif est détecté (réduction de plus de 15 à 20% de la fluorescence), de réduire la puissance du laser de 0,1 mW. </li><li> Pour stimuler l&#39;exocytose, injectables par voie sous cutanée de 0,1 mg / kg d&#39;une solution fraîchement préparée de l&#39;isoprotérénol dans une solution saline. Exocytose est déclenchée environ 1 minute après l&#39;injection. Les granules de sécrétion de fusion avec la membrane plasmatique seront détectés par l&#39;augmentation de fluorescence de la GFP dans les granules et la diffusion des peptides tandem de tomate dans leurs membranes de limitation (Figure 3). Nous recommandons l&#39;acquisition de 3-4 séquences time-lapse dans la même région, 10 min chacune. </li><li> Après la séance d&#39;imagerie, euthanasier l&#39;anesthetized animaux par inhalation de CO 2 dans une chambre d&#39;euthanasie (10-12 mm de Hg pendant 10 min). </li></ol>

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	<li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy.">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li><li>Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+exocytosis:+novel+insights+from+intravital+microscopy.">Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy.</a> Traffic. 13, 627-634 (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+for+studying+the+uptake+and+trafficking+of+fluorescently+conjugated+molecules+in+live+rodents.">Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents.</a> Traffic. 9, 1801-1810 (2008).</li><li>Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasmid+DNA+in+the+salivary+gland+epithelium:+novel+approaches+to+study+dynamic+cellular+processes+in+live+animals.">Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).</li><li>Sramkova, M., Najman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+you+need+to+know+about+intravital+microscopy:+A+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, (2012).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+image+membrane+trafficking+in+live+rats.">Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats.</a> Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).</li><li>Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+microscopy+of+hepatic+transport.">Quantitative intravital microscopy of hepatic transport.</a> Intravital. 1, 44-53 (2012).</li><li>Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+excitation+microscopy+in+intact+animals.">Multi-photon excitation microscopy in intact animals.</a> J. Microsc. 222, 58-64 (2006).</li><li>Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+morphology+and+functional+dynamics+of+vital+murine+intestinal+mucosa+revealed+by+autofluorescence+2-photon+microscopy.">Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).</li><li>Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degranulation+of+rat+salivary+glands+following+treatment+with+receptor-selective+agonists.">Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).</li></ol>

Jusqu&#39;à présent, les structures sous-cellulaires ont été imagées essentiellement in vitro (c&#39;est à dire des cultures de cellules) ou ex vivo (c.-à-orga-cultures, des tranches de tissus, préparations acineuses) systèmes modèles qui souvent ne récapitulent les caractéristiques des tissus vivants intacts 6. À cet égard, l&#39;approche présentée ici représente une percée majeure car elle permet l&#39;imagerie de la dynamique d&#39;une étape de trafic membranaire spéci...

Dans les deux dernières décennies, l&#39;avènement de la microscopie en direct et l&#39;utilisation de protéines fluorescentes ont conduit à des avancées majeures sur chaque processus cellulaire imaginables, faisant ainsi progresser notre compréhension de la biologie des cellules 1. Ce champ a considérablement bénéficié de l&#39;utilisation de cultures de cellules de mammifères qui sont des systèmes modèles très puissants, en particulier quand il s&#39;agit de manipulations expérimentales. Cependant, ils ne fournissent pas souvent une représentation fidèle de la biologie des organismes multicellulaires complexes 2. Cette question a commencé à être abordées par le développement de la microscopie intravitale (IVM), qui a ouvert la porte à l&#39;analyse des questions biologiques clés dans des domaines tels que la neurobiologie, l&#39;immunologie et de la biologie de la tumeur 3. Jusqu&#39;ici, la plupart des études fondées sur l&#39;IVM ont été réalisées au niveau des tissus et des cellules individuelles, sans fournir aucune information sur la dynamique des compartiments sous-cellulaires. Récemment, notre laboratoire et d&#39;autress ont développé des techniques capables d&#39;IVM imagerie structures sous-cellulaires chez les rongeurs vivants 4-7, 13-15 et permettant des manipulations pharmacologiques et génétiques in vivo. Cette approche a été utilisée par nous pour étudier le trafic membranaire in vivo, et plus particulièrement l&#39;endocytose et exocytose régulée 6,7. Notre système de modèle expérimental est basé sur l&#39;exposition, la stabilisation et l&#39;imagerie des glandes salivaires sous-maxillaires (SG) de rongeurs anesthésiés. Le choix de la SG en tant qu&#39;organe de modèle pour IVM est dû au fait que les glandes sont facilement accessibles en effectuant une chirurgie mineure, peut être externalisé sans compromettre leur physiologie, et stabilisé pour réduire les artefacts de mouvement en raison de battement de coeur et la respiration. En outre, SG peut être manipulée génétiquement de façon sélective soit par l&#39;injection de vecteurs viraux ou non viraux basés à travers le canal salivaire 8,9. Enfin, SG sont des glandes exocrines composées de epith polariséeElial cellules qui forment les acini et canaux, les cellules myoépithéliales, et une population complexe de cellules stromales. Pour cette raison, ils sont un excellent modèle pour étudier l&#39;exocytose, l&#39;endocytose, la livraison de gènes, et le cytosquelette d&#39;actine, comme l&#39;a souligné dans nos études récentes 10, et offrir la possibilité d&#39;étudier les aspects de la biologie cellulaire, tels que la polarité cellulaire, la division cellulaire, la cellule jonctions cellulaires, et des canaux ioniques. Dans cet article, nous décrivons en détail un protocole d&#39;imagerie pour la réalisation de la résolution subcellulaire dans l&#39;épithélium des SG d&#39;une souris vivante. Plus précisément, nous montrons comment l&#39;imagerie des granules de sécrétion dans les cellules acineuses des SG durant l&#39;exocytose régulée. Comme montré précédemment, lors de la stimulation par des agonistes du récepteur bêta-adrénergique, les granules de sécrétion fusionnent avec la membrane plasmique apicale et s&#39;affaissent peu à peu, libérant leur contenu dans les cellules acineuses canalicules 6. Notre objectif est de fournir les outils de base pour enquêteurs mexpérience inimal dans les procédures chirurgicales et la manipulation des animaux, afin qu&#39;ils puissent effectuer avec succès IVM à une résolution subcellulaire. Depuis la partie la plus difficile dans l&#39;IVM est la préparation de l&#39;animal, ici nous nous concentrons sur la description des procédures chirurgicales de base qui sont utilisées pour exposer et immobiliser les SG sans compromettre leur fonction. En ce qui concerne les procédures pour étiqueter les structures sous-cellulaires, plusieurs stratégies, telles que l&#39;administration systémique de sondes fluorescentes, l&#39;utilisation d&#39;animaux transgéniques, ou une combinaison des deux, ont été décrits ailleurs 7,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflourane (Forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>101936-40</td>
			<td>Handle under chemical hood</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine (ketaved)</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health</td>
			<td>57457-034-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine (Anased)</td>
			<td>Akorn, Decatur</td>
			<td>61311-481-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neomycin/Polymyxin B</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>24208-785-55</td>
			<td>Use to lubricate the eye of the mouse</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbomer-940</td>
			<td>Ashalnd, Inc.</td>
			<td>4607-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td>Add drop wise to prevent the solution to solidify</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoproternol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16504</td>
			<td>Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 &deg;C</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>190AF</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Portable Downdraft table equipped with HEPA filter</td>
			<td>Hazard Technology</td>
			<td>PDDT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat lamp, Model HL1</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>HL-1 US</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MicroTherma 2T Thermometer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TW2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Operating Scissors (11.5 cm straight</td>
			<td>World Precision Instruments </td>
			<td>5003708-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#7 curved tip tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14187</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black Braided Silk suture #4.0</td>
			<td>George &amp; Tiemann &amp; Co</td>
			<td>160-1219-4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gauze sponges 2" x 2"</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CL-TISSUE (M97) AX6476</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins

Nous décrivons ici un procédé pour l&#39;image des structures sous-cellulaires chez les rongeurs vivants qui est basé sur l&#39;utilisation de la microscopie intravitale confocale. En tant qu&#39;organe de modèle, nous utilisons les glandes salivaires des souris vivantes, car ils offrent plusieurs avantages. Tout d&#39;abord, ils peuvent être facilement exposées à permettre l&#39;accès à l&#39;optique, et stabilisés pour faciliter la réduction des artefacts de mouvement à cause de battement de coeur et de la respiration. Ceci facilite considérablement l&#39;imagerie et de suivi de petites structures sous-cellulaires. En second lieu, la plupart des populations de cellules des glandes salivaires sont accessibles à partir de la surface de l&#39;organe. Ceci permet l&#39;utilisation de la microscopie confocale qui a une résolution spatiale plus élevée que d&#39;autres techniques qui ont été utilisées pour l&#39;imagerie in vivo, tels que la microscopie à deux photons. Enfin, les glandes salivaires peuvent être facilement manipulées génétiquement et pharmacologiquement, fournissant ainsi un système robuste d&#39;étudier les processus biologiques au niveau moléculaire. Dans cette étude, nous nous intéressons à un protocole conçu pour suivre la cinétique de l&#39;exocytose des granules de sécrétion dans les cellules acineuses et la dynamique de la membrane plasmique apicale où les granules sécrétoires fusionnent lors de la stimulation des récepteurs bêta-adrénergiques. Plus précisément, nous avons utilisé une souris transgénique qui co-exprime cytosolique GFP et un peptide de la membrane cible fusionnée à la protéine fluorescente tandem tomate. Cependant, les procédés que nous avons utilisés pour stabiliser et de l&#39;image des glandes salivaires peuvent être étendus à d&#39;autres modèles de souris et couplé à d&#39;autres approches pour étiqueter les composants cellulaires in vivo, ce qui permet la visualisation des différentes structures sous-cellulaires, tels que les endosomes, les lysosomes, les mitochondries, et le cytosquelette d&#39;actine.

Dans la GFP / mTomato souris, les acini apparaissent comme des structures bien distinctes, qui expriment la GFP cytosolique et membranaire ciblée tandem tomate peptide (figure 2, ligne brisée). En acini individu, les cellules acineuses sont délimitées par le peptide tandem tomate. GFP est également détecté dans les noyaux qui sont clairement visibles à l&#39;intérieur des cellules acineuses (figure 2, les flèches). GFP cytosolique est exclue des granules de sécrétion des vé...

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Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Microscopie intravitale est un outil puissant qui permet l&#39;imagerie de divers processus biologiques chez les animaux vivants. Dans cet article, on présente un procédé détaillé pour l&#39;imagerie de la dynamique des structures sous-cellulaires, telles que les granules de sécrétion, dans les glandes salivaires des souris vivantes.

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

intravital-microscopy-for-imaging-subcellular-structures-live-mice

Research

JoVE Journal

Biology

23.5K vues.  National Institutes of Health.  Microscopie intravitale est un outil puissant qui permet l'imagerie de divers processus biologiques chez les animaux vivants. Dans cet article, on présente un procédé détaillé pour l'imagerie de la dynamique des structures sous-cellulaires, telles que les granules de sécrétion, dans les glandes salivaires des souris vivantes. 

Vidéo: Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Imagerie de cellules vivantes de la F-actine fluorescente Dynamics via chatoiement de microscopie (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Recherche

Biologie

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Marquage fluorescent Drosophile</emOuvrages d&#39;art> Coeur

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Marquage fluorescent du COS-7 exprimant des protéines de fusion SNAP-tag pour imagerie de cellules vivantes

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

Photoconversion de protéines purifiées fluorescentes et double-sonde optique dans Soulignant cellules vivantes

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivez l&#39;imagerie des protéines GFP-étiquetés<em&gt; Drosophila</em&gt; Les ovocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Récupération de fluorescence après Photoblanchiment du jaune Fluorescent Protein tag p62 en Structures induites ressemblant à Aggresome

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Imagerie de cellules vivantes à super-résolution de structures subcellulaires

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...