The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).

1. Construction de vecteurs d&#39;expression <ol><li> Infusion de clonage PCR utilisation pour construire jusqu&#39;à 96 plasmides d&#39;expression en parallèle en utilisant les vecteurs popine-3C-GFP et POPIN-N-GFP qui ajoutent soit clivables fusions GFP-His6 C-terminales ou N-terminales à des séquences 13 respectivement. Remarque: Le choix du vecteur est dicté par la topologie de la protéine depuis la GFP doit être exprimée dans le cytosol, donc pour une protéine ayant une extrémité N-terminale extracellulaire et cytoplasmique C-terminale nous utiliserons POPIN-N-GFP et pour un N-terminale extracellulaire et cytosolique C-terminale de nous utiliseraient popine-3C-GFP. Lorsque les deux extrémités sont cytosolique nous utilisons popine-3C-GFP sauf se il ya raison fonctionnelle ne pas marquer l&#39;extrémité C-terminale. </li><li> Amplifier les séquences d&#39;ADN codant pour les protéines membranaires avec des amorces incorporant les extensions suivantes indiquées: popine-3C-GFP (de Amorce sens - AGGAGATATACCATG; amorce inverse - CAGAACTTCCAGTTT) et Popin-N-GFP (de Amorce sens - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; amorce inverse - ATGGTCTAGAAAGCTTTA). </li><li> Analyser la réaction de PCR par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Une fois les produits propres PCR ont été obtenus, ajouter 5 U Dpnl à chaque puits (maquillage dans 5 pi de tampon de réaction 1x Dpnl). On purifie les produits de PCR en utilisant des billes magnétiques dans un format à 96 puits. Remarque: Dpnl est ajouté pour éliminer le vecteur de modèle; cette étape ne est pas nécessaire si l&#39;ADN génomique est utilisé comme matrice. </li><li> Ajouter 1 pi (100 ng) du vecteur linéarisé approprié à chaque puits d&#39;une plaque PCR. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un add x multicanal pipette ul de PCR purifié insérer dans les puits appropriés de la plaque PCR. Veiller à ce que tous les produits sont de l&#39;ordre de 10 à 250 ng. </li><li> Ajouter (9-x) pi d&#39;eau au puits et transférer l&#39;ensemble des 10 pi dans un tube contenant du sec-dans-fusion réactif. Laissez pendant 30 sec. </li><li> Mélanger le contenu brièvement par pipetage de haut en bas. Transfertles réactions de retour à la plaque originale PCR et le joint. </li><li> Incuber pendant 30 min à 42 ° C dans un thermocycleur. </li><li> Transférer immédiatement les réactions de glace dès que la réaction est terminée et ajouter 40 ul de TE (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). </li><li> Congeler à la fois ou se transformer en cellules compétentes. Pour la transformation, utilisez 3 pi de la réaction dilué par 50 pi aliquote de compétence élevée (&gt; 5 x 10 9 transformants / pg) E. compétente cellules de E. coli. </li><li> Ajouter 1 ml de gélose LB complétés avec 50 ug / ml de carbénicilline par puits d&#39;une plaque de culture de tissu de 24 puits (pour le clonage, préparer puits pour 2 x nombre de constructions). </li><li> À la suite de l&#39;excroissance, à la suite de plaque excroissance 25 ul et 25 ul d&#39;une dilution 1 dans 5 de la culture sur la gélose contenant 24 puits des plaques de culture tissulaire. </li><li> Répartir les cellules en inclinant légèrement la plaque. </li><li> Sécher la plaque avec le couvercle pendant 10-15 min à 37 ° C ou dans un flow hotte à température ambiante. </li><li> Replacez le couvercle et tournez la plaque à l&#39;envers et incuber une nuit à 37 ° C. </li><li> Choisissez deux colonies et mini-préparation des vecteurs. </li><li> PCR vérifier les constructions utilisant l&#39;amorce spécifique de l&#39;inversion de construction et une amorce sens spécifique de vecteur (par exemple pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG). </li></ol> 2. Transformation de E. Les souches de E coli Xpression Remarque: Avant d&#39;effectuer ce protocole, E. des cellules compétentes E. coli sont faites, aliquotés et conservés congelés à -80 ° C 13 comme décrit précédemment. expression de la protéine de membrane est un dépistage systématique chez deux souches, Lemo21 (DE3) et C41 (DE3) pLysS. Pour faciliter l&#39;interprétation des résultats, il peut être utile d&#39;inclure un contrôle positif, par exemple un plasmide exprimant la GFP ou une protéine de membrane fusionnée à la GFP connu à exprimer et à un contrôle vecteur vide négative. <ol><li> Décongeler le aliquotted E. coli sur la glace. Ajouter 3 pi de mini-prepped plasmide d&#39;expression à chaque aliquote de cellules compétentes. </li><li> Incuber le mélange sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Choc thermique des cellules pendant 30 secondes à 42 ° C. </li><li> Laisser les cellules se rétablissent sur de la glace pendant 2 min, puis ajouter 300 ul de bouillon de puissance à chaque tube. </li><li> Incuber pendant 1 h dans un 37 ° C incubateur statique. </li><li> Préparer la gélose LB dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits, supplémenté avec 50 pg / ml de carbénicilline et 35 ug / ml de chloramphenicol. Ajouter rhamnose à une concentration finale de 0,25 mM dans les puits contenant Lemo21 (DE3). Remarque: Si le produit est susceptible d&#39;être toxique dans les puits contenant C41 (DE3) pLysS peut être complété avec 1% (p / v) de glucose. </li><li> Transfert 30 ul de cellules du mélange de transformation sur les plaques de gélose LB. Étendre et sécher la plaque comme décrit au 01/13 au 01/15. </li></ol> 3. Préparation de cultures de démarrage nuit Note: Toujours préparer cultures de la nuit le jour après transformation jamais d&#39;une vieille plaque de transformation. <ol><li> Ajouter le bouillon de 0,7 ml de puissance à chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits en puits profond complété avec 50 ug / ml de carbénicilline et 35 ug / ml de chloramphenicol. Ajouter rhamnose dans les puits contenant Lemo21 (DE3) à une concentration finale de 0,25 mM. Eventuellement, compléter C41 (DE3) pLysS avec 1% (p / v) de glucose; voir ci-dessus (2,6 note). </li><li> Choisissez une colonie à partir des plaques de transformation de nuit dans chaque puits. Sceller le bloc avec un joint d&#39;étanchéité perméable aux gaz. </li><li> Agiter le bloc à 250 tours par minute dans un incubateur avec un jet large (par exemple, une orbite de 25 mm) ou à 600 tpm dans un incubateur avec un petit jet (par exemple, une orbite de 4,3 mm) à 37 ° C pendant une nuit. </li></ol> 4. Croissance et induction des cultures <ol><li> Ajouter 3 ml de bouillon de puissance additionné de 50 pg / ml de carbénicilline et 35 ug / ml de chloramphenicol à chaque waune de 24 puits plaque puits profond. Ajouter L-rhamnose (et glucose) tel que décrit à la section 3.1. Utiliser 3 ml de culture pour permettre la récolte, en double exemplaire et pour permettre une certaine évaporation de l&#39;eau à travers le joint perméable au gaz. </li><li> Mettre en place les cultures d&#39;expression en ajoutant 150 ul de Lemo21 (DE3) ou C41 (DE3) pLysS cultures d&#39;une nuit à chaque puits des blocs à 24 puits à puits profonds. </li><li> Agiter les blocs à 37 ° C jusqu&#39;à ce que la DO moyenne à 595 nm est d&#39;environ 0,5 à travers la plaque. </li><li> Induire l&#39;expression par addition d&#39;IPTG à la culture à une concentration finale de 1,0 mM d&#39;IPTG. </li><li> Développer les cultures pendant la nuit (18-20 h) avec agitation à 20 ° C. </li></ol> 5. Analyse d&#39;expression par In-gel Fluorescence <ol><li> Récolte en double exemplaire. Transférer 1 ml de la culture de chaque puits dans un puits carré, fond conique, de 96 puits bloc puits profond. Remarque: Harvest en double exemplaire en cas de rupture du bloc ou pour permettre l&#39;essai d&#39;un alternative détergent si désiré. </li><li> Sceller les blocs et récolter les cellules par centrifugation à 6000 xg pendant 10 min. </li><li> Inversez le bloc et décanter les médias. Appuyez sur le bloc doucement sur une serviette en papier pour drainer les médias restants. </li><li> Sceller les plaques et conserver à -80 ° C pendant un minimum de 20 min. Éventuellement, laissez l&#39;expérience à ce point et le bloc traité au moment opportun. </li><li> De-gel des pastilles pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Utiliser une pipette multicanaux ou un agitateur orbital (1000 rpm pendant 10 min) à 4 ° C pour remettre en suspension les cellules complètement dans 200 ul de tampon de lyse (50 mM de NaH 2 PO 4, NaCl 300 mM mM d&#39;imidazole 10 1% v / v de Tween 20, ajuster le pH à 8,0 en utilisant du NaOH). </li><li> Ajouter 20 ul de la solution de DLPI (20 ul DNase I (4000 unités / ml), 20 mg de lysozyme, et l&#39;inhibiteur de protease 20 ul de cocktail dans un volume final de 2 ml d&#39;eau). Incuber pendant 10 min avec agitation par secousses (~ 1000 tpm) à 4 ° C. </li><li&gt; Ajouter 25 ul de 10% n-dodécyle β-D-maltoside (DDM). </li><li> Incuber pendant 60 min avec agitation par secousses (~ 1000 tpm) à 4 ° C. </li><li> Centrifugeuse le bloc puits profond à 6000 g pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Transfert 10 ul du lysat clarifié à une plaque de microtitrage et ajouter 10 ul de SDS tampon de gel de PAGE de chargement (Tris 100 mM, pH 6,8, 4% p / v de SDS, 0,2% p / v de bleu de bromophénol, 10% v / v β mercaptoéthanol, et 20% v / v de glycérol). ATTENTION! NE PAS FAIRE BOUILLIR l&#39;échantillon. </li><li> Charge 10 pi d&#39;échantillon de l&#39;étape 5.11 / puits sur un gel de SDS-PAGE (s) et fonctionnent à 100-120 V (tension constante) dans une chambre froide jusqu&#39;à ce que le front de colorant atteigne le fond (2 à 2,5 h). </li><li> Placer le gel sur un imageur (par exemple avec un filtre la lumière bleue pour détecter les protéines de fusion GFP). Le temps d&#39;exposition est choisi de sorte que les bandes lumineuses ne sont pas saturés. </li></ol> 6. L&#39;intensification des cultures cellulaires <ol><li> Transformer une aliquote de compétente <em&gt; E. coli comme décrit dans l&#39;article 2. </li><li> Choisissez une colonie dans 10 ml de bouillon de puissance (complété comme décrit dans la section 3) et pousser une nuit à 37 ° C. </li><li> Diluer 5 ml de la culture d&#39;une nuit dans 500 ml de bouillon de puissance. </li><li> Grandissez avec agitation à 250 tours par minute à 37 ° C jusqu&#39;à ce que la DO à 595 nm est ~ 0,5. </li><li> Induire l&#39;expression par addition d&#39;IPTG à une concentration finale de 1,0 mM. </li><li> Cultivez la nuit sous agitation à 250 tours par minute à 20 ° C. </li><li> Récolte des cellules par centrifugation à 5000 g pendant 15 min. </li><li> Surnageant défausse. Les culots cellulaires peuvent être conservés à -80 ° C. </li></ol> 7. Préparation des membranes <ol><li> Décongeler les cellules (si nécessaire) à la température ambiante et remettre en suspension dans 1 x PBS, pH 7,5 à un volume de 5 ml par gramme de culot cellulaire; Augmenter le volume que nécessaire jusqu&#39;à ce que la viscosité se réduit à une consistance liquide. Ajouter MgCl 2 à une concentration finale de 1 mM, ADNase I à une concentration finale de 10 ug / ml et unepréemballée protease comprimé d&#39;inhibiteur par 20 g de culot de cellules. Casser cellules ouvertes en utilisant un perturbateur cellulaire réfrigérés à une pression de 30 kpsi. </li><li> Pellet les cellules non rompues et les débris à 30000 g pendant 15 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un tube ultra-centrifugation. </li><li> Recueillir la fraction totale de la membrane vers le bas en faisant tourner le surnageant à une ultra-centrifugation à 200 000 xg pendant 1 heure à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot de membrane en glacées 10 ml de PBS pH 7,5 en utilisant un homogénéisateur de cellule. 1 ml membranes remises en suspension sont nécessaires pour chaque détergent. Eventuellement, à ce stade, flash geler la suspension de la membrane dans de l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C. </li></ol> 8. solubilisation et l&#39;analyse de la fraction membranaire <ol><li> Fraction membranaire dégel (si nécessaire), et pour chaque détergent à utiliser pour la solubilisation, aliquotes de 900 ul de la suspension de membrane 1,5 ml dans un micro-centrifu polyallomèreTube ge. </li><li> Ajouter 100 ul de chaque détergent fraîchement préparé (10% p / v des solutions de DDM, cymal, DM-6 et AOTA) à une concentration finale de 1% pour le tube de 1,5 ml spécifié. Par solubilisation de protéines de la membrane eucaryote hémisuccinate de cholestérol (0,2% en concentration finale) peuvent être ajoutés aux détergents. </li><li> Incuber les mélanges à 4 ° C pendant 1 heure avec agitation douce. </li><li> Pellet la fraction insoluble de détergent avec une paillasse ultra-centrifugeuse, tubes assurant sont au moins à moitié plein, à 150 000 g à 4 ° C pendant 45 min et conserver surnageant. Remarque: L&#39;efficacité de solubilisation avec un détergent peut être estimée en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence par mesure de la fluorescence de la GFP des membranes solubilisées avec la fraction insoluble de détergent remise en suspension dans le même volume de PBS. </li><li> Analyser le mono-dispersité du détergent différent: des complexes de protéines membranaires en utilisant la chromatographie par fluorescence détectée exclusion de taille (FSEC). </li><li> Pour l&#39;analyse FSEC, équilibrer une colonne d&#39;exclusion de taille avec une large gamme de fractionnement, par exemple 5000 à 5.000.000 en poids moléculaire, avec un tampon (20 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,03% DDM) fonctionnant à un débit de 0,3 ml / min . Utilisez ce tampon pour tous les échantillons, ce est à dire qu&#39;il ne est pas modifié pour chaque détergent testé. </li><li> Injecter 100 ul de membranes solubilisées sur la colonne à un débit de 0,3 ml / min de débit. Surveiller profil d&#39;élution en utilisant l&#39;optique de fluorescence (excitation à 488 nm et émission à 512 nm). Si un moniteur de fluorescence en ligne ne est pas disponible, la collecte des fractions et lire la fluorescence dans un lecteur de plaque. </li><li> volume d&#39;élution d&#39;importation et les données d&#39;intensité de fluorescence dans un programme de feuille de calcul pour l&#39;affichage graphique. </li><li> Analyser la matière restante de la membrane solubilisée par fluorescence en gel comme décrit dans la section 5. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dans le protocole décrit dans cet article, la ligature indépendante clonage dans un vecteur rapporteur GFP est combiné à détection de fluorescence pour cribler rapidement l&#39;expression relative de plusieurs protéines membranaires en E. coli. Vecteurs peuvent être faites dans les quatre jours ouvrables avec le dépistage d&#39;expression primaire de prendre une semaine supplémentaire. En-gel fluorescence de lysats détergentes de cellules entières est utilisé pour classer expression frappe pour une analyse ultérieure dans un écran secondaire. L&#39;écran d&#39;expression tel que présenté primaire ne nécessite pas d&#39;équipement spécialisé en dehors d&#39;un incubateur agitateur approprié pour la croissance des cellules dans des blocs de puits profonds. Toute autre manipulation impliquant liquide à 96 puits des plaques SBS peut être effectuée en utilisant des pipettes multicanaux. Le protocole peut être facilement modifié pour inclure d&#39;autres souches de E. coli cultivées dans différentes conditions d&#39;expression (par exemple de température basse). Dans le cas de la LEMO21 (DE3) en titrant le niveau de rhamnose (de 0 à 2,0 mM)ajouter à moduler le taux de transcription peut augmenter le niveau d&#39;expression de certaines protéines de la membrane 7. Détergents autres que DDM pourraient être utilisés pour l&#39;extraction dans l&#39;écran principal si détergents plus sévères peuvent solubiliser les protéines des corps d&#39;inclusion et donc donner des faux positifs. De toute évidence, la plus élaborée l&#39;écran initial devient, le plus de temps l&#39;expérience. L&#39;écran secondaire consiste à préparer une fraction membranaire totale des résultats d&#39;expression identifiés dans l&#39;écran principal. Ce est une étape critique car il confirmera la localisation des protéines de fusion à la membrane du E. cellules de E. coli. Extraction ultérieure de la protéine de fusion GFP dans différents détergents est suivie par chromatographie d&#39;exclusion de taille de la fluorescence détectée de matériau solubilisé pour évaluer la mono-dispersité des complexes détergent-protéine. Ce est une autre étape cruciale car elle identifie le détergent le plus approprié poursolubilisation de la protéine de membrane pour le traitement ultérieur en aval. Toutefois, l&#39;expérience montre que l&#39;optimisation du choix de la lessive (s) peut encore être nécessaire pendant la purification et la cristallisation. Preuve d&#39;un comportement uniforme dans différents détergents, y compris celles qui ont une taille relativement petite de micelles (par exemple LDAO) semble être un bon indicateur de la propension à former ainsi diffracter cristaux au moins pour des protéines membranaires procaryotes 14. En ce qui concerne le profil indiqué pour la protéine de membrane sur la figure 2B semble très favorable. Le principal avantage d&#39;utiliser un rapporteur GFP est qu&#39;il donne une lecture rapide de l&#39;expression dans des échantillons de l&#39;ONU-purifié. Un inconvénient est que la protéine de fusion GFP doit être éliminé au cours de la purification de la protéine pour la cristallisation. Dans le cas de vecteurs utilisés ici, un site de protease 3C du rhinovirus permet le clivage de la GFP. En variante, il est facilede re-clone protéines candidates, identifiés dans l&#39;écran, dans des vecteurs qui ne ajoutent une polyhistidine ou autre marqueur d&#39;affinité pour la purification ultérieure. Cela suppose que la fusion de GFP ne est pas nécessaire pour l&#39;expression. La principale alternative à l&#39;utilisation fusion à la GFP pour la détection de l&#39;expression de protéine de la membrane et la solubilisation est d&#39;ajouter seulement un marqueur d&#39;histidine. Toutefois, cette approche nécessite en général à partir d&#39;une fraction de membrane 15 qui, pour l&#39;évaluation de nombreux variants deviendrait beaucoup de temps. En résumé, l&#39;objectif principal du protocole décrit dans cet article est de permettre à un grand nombre de séquence de la protéine de la membrane variantes être évalués rapidement en termes d&#39;expression et de solubilisation avec un détergent et de priorités pour une analyse plus approfondie.

Il a été estimé que les protéines membranaires représentent environ 20 à 30% des gènes codés dans tous les génomes séquencés 1, y compris le génome humain 2. Compte tenu de leur rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques, par exemple le transport des métabolites, la production d&#39;énergie et comme cibles pour les médicaments, il ya un intérêt intense dans la détermination de leur structure tridimensionnelle. Toutefois, par rapport à des protéines solubles, des protéines membranaires sont très sous-représentées dans la Protein Data Bank. En fait, des 99 624 structures libérés dans l&#39;APB ( <a href="http://www.rcsb.org/pdb/">http://www.rcsb.org/pdb/</a> ) seulement 471 ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) sont classés comme des protéines membranaires. Cela reflète les difficultés techniques de travail avec les protéines membranaires qui sont naturellement exprimés à des niveaux relativement bas; rhodopsine est l&#39;un des quelques exceptions 3,4. La surexpression de version recombinantes dans des cellules hétérologues se traduit souvent par mauvais repliement et mauvais ciblage à la membrane qui limite le niveau global de la production. Le choix du meilleur détergent pour l&#39;extraction et la solubilisation d&#39;une protéine de membrane, une fois exprimé rend difficile la purification subséquente et nécessite une optimisation minutieuse. Escherichia coli reste hôte d&#39;expression la plus couramment utilisée pour des protéines membranaires représentent 72% ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) des structures résolu à ce jour qui sont presque exclusivement à partir de sources bactériennes. E. spécifique souches coli, C41 (DE3) et C43 (DE3), ont été isolés qui ne conduisent pas à la sur-expression de protéines membranaires et donc d&#39;éviter les effets de la toxicité observé pour les autres souches BL21 5,6. Réglage du niveau d&#39;expression recombinante de la protéine de membrane semble être critique pour optimiser le niveau de production de 6,7. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Dans de nombreux cas, la production réussie de protéines membranaires pour la détermination de la structure a nécessité l&#39;évaluation de plusieurs versions dont deletions amino- et carboxy-terminales, de multiples orthologues d&#39;exploitation de la variation de séquence naturelle et différentes protéines de fusion 6-8. Par conséquent, un procédé pour le criblage d&#39;expression de plusieurs protéines de la membrane en parallèle est essentielle. Une méthode couramment utilisée consiste à fusionner la protéine à la protéine fluorescente verte (GFP) expression permettant d&#39;être suivis sans la nécessité de purifier la protéine. De cette façon, des informations sur le niveau d&#39;expression, la stabilité et le comportement dans différents détergents peut être évaluée avec de petites quantités de matière non purifiée 9-12. Dans cet article, on décrit un protocole simplifié pour le clonage et l&#39;expression criblage de protéines membranaires dans E. coli en utilisant la fusion à la GFP en tant que journaliste de la production et la caractérisation ultérieure de détergent: protéines compLexes (figure 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPIN-N-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPINE-3C-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C41(DE3)pLysS</td>
			<td>Lucigen (http://lucigen.com/</td>
			<td>60444-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEMO21(DE3)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2528H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns</td>
			<td>Clontech/Takara</td>
			<td>639688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power broth</td>
			<td>Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)</td>
			<td>MD12-106-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8849</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-&#946;-D-Maltoside)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM ( n-Dodecyl &#223;-maltoside )</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D97002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM (n-Decyl &#223;-maltoside)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D99003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D71111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>4672030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200&#181;L LTS Spacer</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>LA6-300XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20&#181;L LTS</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-20XLSPLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200&#181;L LTS Tip</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-1200XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well V bottom deep well blocks</td>
			<td>Porvair sciences</td>
			<td>360115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5928</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WG1203BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell4 SureLock Midi-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WR0100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibramax 100</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>544-21200-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tension rollers attachment</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>549-81000-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393253</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs</td>
			<td>Shel Lab&#160;</td>
			<td>SSI5R-HS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova44R incubator</td>
			<td>New Brunswick /Eppendorf</td>
			<td>Innova44R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI)</td>
			<td>Constant systems</td>
			<td>PL083016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in escherichia coli

La production de protéines membranaires recombinantes pour des études structurelles et fonctionnelles reste techniquement difficile en raison de faibles niveaux d&#39;expression et l&#39;instabilité inhérente de nombreuses protéines membranaires fois solubilisé dans les détergents. Un protocole est décrit qui combine le clonage indépendant de la ligature de protéines membranaires sous forme de fusions de GFP avec l&#39;expression dans Escherichia coli détectées par fluorescence de la GFP. Cela permet à la construction et l&#39;expression de dépistage de la protéine de membrane multiples / variantes pour identifier les candidats appropriés pour plus d&#39;investissement de temps et d&#39;efforts. Le rapporteur GFP est utilisé dans un criblage primaire de l&#39;expression par la visualisation de la fluorescence de la GFP suivant gel de Polyacrylamide SDS (SDS-PAGE). Les protéines membranaires qui présentent à la fois un niveau d&#39;expression élevé avec un minimum de dégradation, comme indiqué par l&#39;absence de GFP libre, sont sélectionnés pour un criblage secondaire. Ces constructions sont mises à l&#39;échelle et une fraction membranaire totale préparés et solubiliserd dans quatre détergents différents. Suite à une ultracentrifugation pour éliminer le matériau insoluble de détergent, des lysats sont analysés par chromatographie d&#39;exclusion de taille de détection de fluorescence (FSEC). Le suivi du profil d&#39;exclusion de taille par fluorescence de la GFP fournit des informations sur la mono-dispersité et l&#39;intégrité des protéines membranaires dans des détergents différents. Protéines: combinaisons de détergents qui se éluent avec un pic symétrique avec peu ou pas de droits GFP et l&#39;agrégation minimale sont des candidats pour une purification ultérieure. En utilisant la méthodologie ci-dessus, l&#39;expression hétérologue dans E. coli du SED (forme, l&#39;allongement, la division et la sporulation) protéines de 47 espèces différentes de bactéries a été analysée. Ces protéines ont typiquement dix domaines transmembranaires et sont essentiels pour la division cellulaire. Les résultats montrent que la production des SED orthologues chez E. coli était très variable en ce qui concerne les niveaux d&#39;expression et l&#39;intégrité des protéines de fusion GFP. L&#39;expérience iindéterminés un sous-ensemble pour complément d&#39;enquête.

La famille de protéines SEDS (forme, allongement, division, et la sporulation) est essentiel pour la division cellulaire bactérienne. Ces protéines intégrales ont typiquement dix domaines transmembranaires avec deux terminaisons amino et carboxy à l&#39;intérieur de la cellule. Pour illustrer le protocole décrit ci-dessus, 47 SED orthologues ont été clones dans le vecteur popine-3C-eGFP. Un petit écran d&#39;expression à l&#39;échelle des constructions a été effectuée en deux souches .coli E, Lemo21 (DE3) cultivées en présence de 0,25 mM rhamnose pour bloquer l&#39;expression fuit et C41 (DE3) pLysS, qui sont couramment utilisés pour l&#39;expression de la membrane 8.5 protéines. Détergent solubilisé lysats de cultures induites ont été analysés par électrophorèse SDS-polyacrylamide. Utilisation de la fluorescence in-gel pour visualiser les protéines de fusion GFP exprimées ont montré que, entre les deux souches 38 des 47 SED constructions ont été produites. Fait intéressant, il y avait des différences entre les deux souches d&#39;expression. Sur les 38 exprimé constructions, seulement 18 ont été produites dans les deux souches, 14 seulement exprimée dans Lemo21 (DE3) et 6 seulement en C41 (DE3) pLysS. Dans l&#39;ensemble, il y avait un taux de réussite plus élevé pour le Lemo21 (DE3) par rapport à la pLysS C41 (DE3) (38 vs 24). Cependant l&#39;observation que certaines protéines semblent être souche spécifique signifie que le dépistage est à la fois utile. Les données représentatives pour 24 des 47 SED constructions sont représentées à la figure 1. L&#39;intensité des bandes donne une indication sur le niveau d&#39;expression, par exemple la protéine de fusion en C4 et sur ​​la figure 1A et 1B est bien exprimé dans les deux souches, mais le supplément bandes de plus bas poids moléculaires suggèrent que la protéine est partiellement dégradé. Dans de nombreuses voies, il est un groupe qui correspond en taille à la GFP seule. Une évaluation qualitative de l&#39;intégrité de la protéine peut être effectuée en examinant l&#39;intensité de la protéine de fusion GFP par rapport à la connexion;par exemple G4 et H4 sont complètement décomposés à la GFP libre dans C41 (DE3) pLysS (figure 1B) alors que dans le Lemo21 (DE3) il ya une certaine protéine intacte (figure 1A). Pour 14 des protéines exprimées 38 l&#39;intensité de la bande de GFP libre est similaire à celle de la protéine de fusion, par 21 l&#39;intensité de la bande de GFP libre est supérieure à celle de la protéine de fusion et une minorité des protéines de fusion (3 / 38 exprimée) par exemple F6 et G6 à la figure 1A avoir relativement peu de GFP libre par rapport à la protéine de fusion. Deux des constructions qui expriment bien dans les B5 écran primaire (bandes à haute intensité pour la GFP libre et des protéines de fusion) et G6 (peu libre GFP) ont été exprimées et une fraction membranaire totale préparée à partir de 500 ml de culture cellulaire. Les membranes remises en suspension ont été répartis en portions aliquotes et analysés par chromatographie d&#39;exclusion de taille fluorescence détectée (FSEC). Les profils sont présentés dans FSEC Figure 2A et 2B, respectivement, et montrent que les deux protéines de SED se comportent différemment dans les quatre détergents testés. Dans un cas (Figure 2A: échantillon B5) la protéine seulement donné un pic symétrique avec peu agrégation dans DDM qui serait donc le détergent de choix pour purification ultérieure. Par contre l&#39;autre protéine de fusion (Figure 2B: échantillon G6) a un profil similaire dans tous les détergents testés. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig1highres.jpg" width="700px" /> Figure 1: Schéma de flux de travail pour le dépistage membrane expression de la protéine dans E. coli en utilisant un rapporteur GFP. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig2highres.jpg" /> Figure 2: écran principal de l&#39;expression de la protéine de membrane en utilisant la fluorescence in-gel. </strong&gt; lysats de détergent de E. cellules de E. coli ont été analysés par SDS-PAGE et gels imagées par Epi Bleu éclairage et un filtre 530/28. Les résultats sont présentés pour 24 constructions (étiquetés A4-H6 fonction de leur position dans une plaque de 96 puits). Les positions des bandes pour GFP libre et des protéines de fusion GFP sont indiqués. (A) les protéines exprimées dans Lemo21 (DE3). (B) Les protéines exprimées dans C41 (DE3) pLysS. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig3highres.jpg" /> Figure 3:. Écran secondaire de membrane expression de la protéine en utilisant une Chromatographie d&#39;exclusion de taille de la fluorescence détectée (FSEC) Total des fractions membranaires ont été extraites dans quatre détergents différents et les protéines membranaires solubilisées analysé par chromatographie d&#39;exclusion stérique en utilisant un système FPLC couplée à un détecteur de fluorescence. FSEC de profils (A) de B5 protéine de la membrane et (B) </strong&gt; protéine membranaire G6. La position des pics correspondant à des protéines agrégées, solubilisé la protéine de fusion GFP GFP et libre sont indiqués. Les détergents testés sont indiqués ci-dessous les profils.

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Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Une approche rationalisée de dépistage de l&#39;expression des protéines membranaires recombinantes dans Escherichia coli basée sur la fusion de la protéine fluorescente verte est présenté.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

green-fluorescent-protein-based-expression-screening-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

32.4K vues.  Research Complex at Harwell.  Une approche rationalisée de dépistage de l'expression des protéines membranaires recombinantes dans Escherichia coli basée sur la fusion de la protéine fluorescente verte est présenté. 

Vidéo: Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Recherche

Biologie

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un test pour mesurer l&#39;activité des Escherichia coli Inductible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Criblage à haut débit activité endoglucanase fongique dans les Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocoles pour la mise en œuvre d&#39;un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sur la base du système d&#39;expression cellulaire gratuit TX-TL pour la biologie synthétique

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening Expression quantitative et purification appliquée à recombinant disulfure riches protéines venin produit dans<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Purification non chromatographique de polypeptides recombinants élastine et de leurs fusions avec des peptides et des protéines<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Les avantages multiples de la protéine co-expression dans<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...