Pour générer un organoïde à partir d’un seul récepteur hépatocellulaire B2 producteur d’érythropoïétine, ou d’une cellule souche intestinale FEB2-positive, effectuer un tri cellulaire activé par fluorescence en fonction de l’expression de FEB2 et diviser les cellules obtenues en quatre groupes, élevé, moyen, faible et négatif. Après avoir recueilli la pastille de haute cellule FEB2 avec centrifugation à 390G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, incorporer les cellules FEB2 hautes triées uniques dans l’ECM par pipetage, puis ensemencer les cellules sur une plaque de 24 puits à 100 singulets par 40 microlitres d’ECM par puits. Incuber la plaque de 24 puits pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour la polymérisation de l’ECM.
Ensuite, couvrir l’ECM avec 500 microlitres de milieu de culture contenant 10 micromolaires kinase associée à la rangée, ou inhibiteur de roche pendant les deux premiers jours pour maintenir les cellules élevées FEB2. Inspectez manuellement les cellules à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 40X et observez des organoïdes viables avec formation de sphéroïdes et protrusion cryptique. Des structures de villa cryptique auto-organisées rappelant l’intestin grêle normal ont été recréées à partir de cellules élevées FEB2 uniques.
Au cinquième jour de la culture, des structures ressemblant à des sphéroïdes se sont formées et, du septième au neuvième jour, l’évagination des taches pour former des cryptes s’est produite.
