Pour l’isolement de la crypte de l’intestin grêle murin, utilisez des fragments correctement lavés de cinq millimètres sur cinq millimètres de l’intestin grêle murin isolé. Incuber les morceaux dans des antibiotiques PBS contenant deux EDTA millimolaires pendant 30 minutes sur de la glace sans les agiter. Pour faciliter la solidification de la matrice extracellulaire, ou ECM, incuber au préalable une plaque de 24 puits dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius.
Après avoir aspiré la solution d’EDTA des fragments de tissu, ajoutez 25 millilitres d’antibiotiques PBS froids frais. Ensuite, secouez vigoureusement le récipient à la main, 30 à 40 fois. Filtrer la suspension une fois à travers une crépine de 70 microns.
Avant de passer à l’étape suivante, confirmez la présence des cryptes au microscope. Ensuite, centrifugez la suspension à 390 G et quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, re-suspendre la pastille de crypte dans 20 millilitres de DMEM contenant 2% de sorbitol, ci-après appelé DMEM de sorbitol.
Transférez 10 millilitres de la suspension crypte dans chacun des deux nouveaux tubes de 15 millilitres. Cette fois, centrifugez les deux tubes à une vitesse inférieure de 80 G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius pour séparer les grandes masses cellulaires des cellules ou des débris. Aspirez doucement le surnageant, en laissant environ deux millilitres de surnageant dans chaque tube.
Ensuite, ajoutez 10 millilitres de DMEM de sorbitol à chaque tube. Centrifuger à nouveau la suspension à 80 G et quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Aspirer le surnageant comme démontré précédemment, et ajouter 10 millilitres de DMEM de sorbitol pour la remise en suspension.
Après avoir aspiré le surnageant, ajoutez 10 millilitres de DMEM complet et re-suspendez la pastille en pipetant de haut en bas. Laissez reposer la suspension pendant une minute pour obtenir efficacement les cryptes flottantes. Après une minute, filtrez la suspension des deux tubes dans un tube frais à travers une crépine cellulaire de 70 microns pour purifier les cryptes.
Pour compter les cryptes pures avant l’ensemencement, versez 25 gouttelettes de microlitres dans un plat de six centimètres en trois points. Comptez le nombre de cryptes au microscope à un grossissement de 4X et calculez la concentration de cryptes par 25 microlitres. Ensuite, centrifuger le filtrat entier à 290 G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.
Pour l’ensemencement, suspendre les cryptes dans l’ECM à une concentration de 100 cryptes pour 40 microlitres d’ECM. Pipeter de haut en bas cinq à 10 fois doucement en évitant les bulles d’air pour obtenir une suspension homogène. Ensuite, ensemencez 40 microlitres de la suspension cryptique par puits dans la plaque préchauffée de 24 puits.
Incuber la plaque de 24 puits pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour la polymérisation de l’ECM. Couvrir l’ECM par puits avec 500 microlitres de milieu de culture contenant le facteur de croissance épidermique de la souris, la R-Spondine 1 de souris recombinante et le noggin de souris recombinant. La concentration finale de matériaux par puits est indiquée ici.
Culture des cryptes en incubant à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Effectuez une imagerie en direct pour enregistrer la morphogenèse organoïde à l’aide d’un microscope imageur Timelapse toutes les trois heures pendant sept jours maximum et obtenez des images empilées Z en série. Presque toutes les cryptes isolées ont été immédiatement scellées et sont apparues en forme de cône une fois expulsées des niches épithéliales.
En outre, les cryptes de la fraction finale ont été intégrées et adaptées à une utilisation en culture. Des images timelapse de la croissance organoïde ont révélé que la prolifération active et la différenciation des cellules souches intestinales se produisaient dans la région cryptique avec bourgeonnement. Le bourgeonnement a été couplé à la migration cellulaire, à la prolifération et à la différenciation des cellules de Paneth.
